Molekularbiologie

Vergleichende Molekularbiologie

Von vergleichender Molekularbiologie spricht man, wenn der Einsatz molekularbiologischer Verfahren darauf abzielt, Verwandtschaftsverhältnisse zwischen verschiedenen Spezies zu ermitteln. Es handelt sich insofern also um ein spezielles Anwendungsgebiet, in dem Lebewesen auf molekularer Ebene miteinander verglichen werden.

Aufgaben der Molekularbiologie

Zur Molekularbiologie gehört, wie oben genannt, die vergleichende Molekularbiologie, die dabei hilft, die Evolution besser nachzuvollziehen.

Damit im Zusammenhang steht die Genetik als weiteres Einsatzgebiet der Molekularbiologie. Die Erkenntnisse aus der Untersuchung von DNA, RNA und ihre Interaktionen können also insgesamt in ganz verschiedenen Bereichen von Nutzen sein. Dazu gehören:

• Verbesserung des Verständnisses von grundlegenden Funktionen der Zelle und des Körpers, auch Krankheiten können so genauer erklärt und therapiert werden
• Entschlüsselung des genetischen Codes
• Aufstellung von Stammbäumen von Spezies
• Auffinden von genetischen Krankheitsursachen
• Gentechnik inkl. Gentherapie

Molekularbiologie Genetik

Ein Teilgebiet der Molekularbiologie ist die Molekulargenetik. Sie betrachtet Vererbung, Vervielfältigung und Expression von Erbgut (DNA). Dabei ist der Fluss von Informationen ausgehend von der DNA hin zu Proteinen besonders relevant. Er wird im sogenannten zentralen Dogma der Molekularbiologie zusammengefasst.

Über die Transkription wird mit DNA als Vorlage eine mRNA erstellt. Diese dient dann in der Translation als Grundlage für die Zusammensetzung eines Proteins. Jedes Basentriplett (Codon) kodiert dabei für eine Aminosäure. Über reverse Transkription kann aus mRNA wieder auf DNA rückgeschlossen werden. Eine Rückkehr von Proteinen zu mRNA ist jedoch nicht möglich.

Methoden der Molekularbiologie

Die Methoden der vergleichenden Molekularbiologie sollen zeigen, wie nah zwei verschiedene Spezies miteinander verwandt sind. Die Verwandtschaftsanalyse kann auf der Ebene der DNA und der Proteine erfolgen. Die verschiedenen Techniken vergleichen also entweder eine Aminosäure- oder DNA-Sequenz.

Vergleich von Proteinen

Bei der Gegenüberstellung von Proteinen handelt es sich um einen Aminosäuresequenzvergleich. Er wird oft für die Verwandtschaftsanalyse eingesetzt.

Wenn man davon ausgehen kann, dass alle Lebewesen von einem gemeinsamen Vorfahren stammen, sollten sich die Aminosäuresequenzen bei unterschiedlichen Arten ähneln. Je näher verwandt die Lebewesen, desto weniger Unterschiede gibt es in der Aminosäuresequenz. Die Veränderungen der Aminosäuresequenz treten durch Mutationen auf.

Methoden zum Aminosäuresequenzvergleich sind unter anderem der Edman-Abbau und der Serum-Präzipitin-Test.

Edman-Abbau

Beim Edman-Abbau wird die Aminosäuresequenz direkt nachgewiesen. Ein Protein wird fragmentiert, also in kleinere Abschnitte zerlegt, und dann dessen endständige Aminosäure abgespalten. Die abgespaltene Aminosäure kann über weitere Reaktionen festgestellt werden. Dies geschieht so oft, bis das ganze Protein sequenziert ist.

Serum-Präzipitin-Test

Der Serum-Präzipitin-Test ist ein Antigen-Antikörper-Test, der die Übereinstimmung von Proteinen prüft. Mit einem solchen Test kann die immunologische Verwandtschaft verschiedener Tiere nachgewiesen oder widerlegt werden. Dazu werden die Eigenschaften verschiedener Blutbestandteile ausgenutzt.

Wie wird ein Präzipitintest durchgeführt? Im folgenden Beispiel wird die Untersuchung mit menschlichem Blut durchgeführt, es ist aber auch auf jegliche andere Spezies übertragbar.

1. Einem Menschen wird Blut entnommen.
2. Das geronnene Blut wird zentrifugiert, sodass das Serum als Überstand verbleibt.
3. Das Serum wird einem anderen Lebewesen injiziert. Meistens handelt es sich um Kaninchen oder Hühner. Diese Organismen entwickeln Antikörper gegen menschliche Serum-Bestandteile.
4. Nach einigen Wochen wird den Tieren Blut abgenommen. Hier wird wieder gewartet, bis sich das flüssige Serum vom Plasma getrennt hat.
5. Sollte dieses Serum wieder mit menschlichem oder tierischem Blut vermischt werden, entsteht eine Ausfällung. Die Ausfällung entsteht dadurch, dass die Antigene im Blut mit Antikörpern bekämpft werden. Je näher die Verwandtschaft, desto größer ist die Ausfällung.

Ein Präzipitintest ist allerdings sehr ungenau und liefert keine konkreten oder manchmal sogar widersprüchliche Ergebnisse. Das liegt vorwiegend daran, dass die Ergebnisse je nach Referenztier stark voneinander abweichen können. Heutzutage verwendet man deshalb stattdessen die DNA-Sequenzierung oder andere Methoden der Aminosäuresequenz-Analyse.

Vergleich von DNA

Weitere Methoden arbeiten auf Ebene der DNA bzw. manchmal auch der RNA. Dazu muss das genetische Material zunächst aufbereitet werden. Danach ist es bereit für verschiedene Sequenzierungstechniken.

Vorbereitung des genetischen Materials

Die DNA durchläuft verschiedene Schritte, bei denen z. B. ein gewünschter Abschnitt extrahiert und vervielfältigt werden kann.

DNA-Restriktion

Meistens wird für die Forschung nur ein bestimmtes Gen oder ein Gen-Abschnitt benötigt. Um an diese zu gelangen, wird auf DNA-Restriktion zurückgegriffen. Dabei wird die DNA mithilfe einiger Restriktionsenzymen in Abschnitte geteilt. Der Vorteil von Restriktionsenzymen ist, dass diese eine bestimmte Basenabfolge erkennen können. Sie können den DNA-Strang an dieser Stelle durchschneiden.

Aus den verschiedenen DNA-Abschnitten nimmt man sich das spezifische Stück, worauf das gesuchte Gen liegt. Die DNA-Stücke werden in diesem Fall mithilfe der Gelelektrophorese nach der Länge sortiert.

Polymerase-Kettenreaktion

Die weitere Vorbereitung erfolgt meist mithilfe einer PCR (Polymerase Chain Reaction).

In dem Verfahren der PCR wird ein doppelsträngiger DNA-Abschnitt benötigt, welcher die gesuchte Gen-Sequenz enthält. Damit die Vervielfältigung durchgeführt werden kann, werden zwei Primer, sogenannte Oligonukleotide, eingesetzt. Diese binden an den Anfangs- und Endpunkten des DNA-Abschnitts. Die Oligonukleotide sind zwischen 15 und 25 Basen lang. Ihre Aufgabe ist es, den Bereich, der vervielfältigt werden soll, zu begrenzen.

Für die PCR werden zusätzlich Desoxynukleosidtriphosphate (für den Neuaufbau der DNA-Stränge), Ionen und Puffer benötigt.

Die PCR ist ein zyklischer Prozess und wird in einem Thermocycler durchgeführt. Eine durchschnittliche PCR hat zwischen 25 und 40 Zyklen, wobei in jedem Zyklus die Menge der DNA verdoppelt wird. Die PCR wird in drei Schritten durchgeführt und jeder Schritt dauert etwa 30 Sekunden:

1. Denaturierung
2. Hybridisierung/ Anlagerung der Primer (Annealing)
3. Verlängerung (Elongation)

Damit die DNA denaturieren oder schmelzen kann, wird ein PCR-Ansatz auf ca. 95 °C erwärmt. Dabei werden die Wasserstoffbrücken zwischen der beiden Strängen der DNA gespalten. Danach liegen komplementäre Einzelstränge vor.

Anschließend wird die Temperatur auf 55 bis 65 °C gesenkt. Der passende Primer kann an den beiden DNA-Einzelsträngen binden. Die Voraussetzung für eine erfolgreiche Anlagerung der Primer ist, dass die Sequenz der Primer mit der Basenabfolge des DNA-Strangs übereinstimmt. Sonst kann keine Anlagerung erfolgen.

Die Temperatur wird wieder erhöht. Dieses Mal auf 68 bis 72 °C. Diese Temperatur bietet die optimale Arbeitstemperatur für die spezielle DNA-Polymerase, wodurch die Synthese beschleunigt wird. Somit kann sich die DNA-Polymerase an die Primer anlagern. Zu dem neuen Strang fügt die DNA-Polymerase komplementäre Nukleotid-Bausteine hinzu.

Der Reaktionsansatz wird anschließend auf etwa 95 °C erhitzt. So kann ein neuer PCR-Zyklus beginnen.

Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

Diese kompliziert klingende Methode wird beispielsweise bei forensischen Untersuchungen oder für Vaterschaftstests angewendet. Sie dient dabei der Bestimmung eines individuellen genetischen Fingerabdrucks.

Mit einer PCR wird die DNA amplifiziert. Danach kommt das oben beschriebene Prinzip der Restriktionsenzyme zum Einsatz. Bei jedem Individuum entstehen nach Hinzugabe der Enzyme verschieden lange Fragmente, da sich die vorhandenen Schnittstellen in der DNA unterscheiden. Ordnet man die Fragmente mithilfe einer Gelelektrophorese der Länge nach, so entsteht ein spezifisches Muster. Die Technik eignet sich sehr gut, um die DNA aus zwei Proben miteinander zu vergleichen.

DNA-Sequenzierung nach Sanger

Die Sanger-Sequenzierung kennt man auch als Didesoxymethode oder Kettenabbruchmethode. Heutzutage wird sie allerdings nicht mehr ganz so häufig angewendet, weil auch neuere Methoden wie die Pyrosequenzierung (Next Generation Sequencing) zur Verfügung stehen.

Wie wird die Sanger-Sequenzierung durchgeführt?

1. Schritt: Denaturierung

Da die DNA als ein Doppelstrang vorliegt, wird sie erst aufgetrennt, indem sie auf etwa 90 °C für eine Minute erhitzt wird. Dadurch zerstört die Hitze die vorliegenden Wasserstoffbrücken zwischen den Basen. So werden die Doppelstränge getrennt und es liegen dann zwei Einzelstränge vor. Einer der beiden DNA-Stränge wird als Matrize verwendet.

2. Schritt: Anlagerung der Primer

Ein künstlicher Primer setzt sich an das 3'-Ende des Einzelstrangs. Der Primer legt durch seine Bindung an einer bestimmten Stelle am Matrizenstrang den Startpunkt der Synthese fest.

3. Schritt: Generierung der DNA-Fragmente

Damit DNA-Fragmente im Labor hergestellt werden können, werden einige spezifische Stoffe benötigt:

• die vorher erstellten Matrizen mit Primern
• Nukleotide in Form von dNTP und ddNTP von verschiedenen Basen
• das Enzym DNA-Polymerase, welches die DNA aus den Nukleotiden synthetisiert

Um einen komplementären Strang zum Matrizenstrang zu synthetisieren, werden Nukleotide mit den vier Basen (A, T, G, C) gebraucht. Es werden vier identische Reaktionsmedien hergestellt, um später die Basen zu unterscheiden. Die Reaktionsmedien beinhalten eine Matrize mit angelegtem Primer und Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) der vier Basen.

Zusätzlich werden Abbruchnukleotide (Didesoxynukleotidtriphosphate, ddNTPs) hinzugefügt, welche die Synthese der komplementären Strangs anhalten sollen. Jedes Reaktionsmedium enthält eine andere Art eines Abbruchnukleotids.

Ähnlich zum Ablauf der DNA-Replikation werden komplementäre DNA-Nukleotide mithilfe der DNA-Polymerase an die Matrize gesetzt. Die Synthese beginnt am Primer. Solange die DNA-Polymerase kein Abbruchnukleotid findet, kann diese weiter arbeiten. Am Ende wird die Synthese durch ein ddNTP beendet. Da die ddNTPs immer an verschiedenen Stellen an dem DNA-Strang liegen, entstehen immer unterschiedlich lange DNA-Fragmente.

4. Bestimmung der Basenabfolge

Am Ende des Prozesses müssen die DNA-Doppelstränge erneut erhitzt werden, um die synthetisierten DNA-Fragmente von dem DNA-Einzelstrang zu entfernen. Die neuen Fragmente der DNA werden je nach Gewicht mit der Gelelektrophorese geordnet. Mithilfe der Position im Gel und den ddNTPs am Ende des Strangs kann nun die Basenabfolge abgelesen werden. An den Abbruchstellen sieht man dann, welche Abbruchnukleotide vermerkt wurden.

Next Generation Sequencing

Die Sanger-Sequenzierung ist eine vergleichsweise aufwendige Methode, mit der nur kleinere DNA-Abschnitte entschlüsselt werden können. Effizienter arbeiten die Verfahren des Next Generation Sequencing, kurz NGS.

Beim NGS werden zunächst viele DNA-Fragmente erzeugt, die vervielfältigt werden. Viele Sequenzierungen können parallel ablaufen, was die Verfahren sehr effizient macht. In der Regel werden stattfindende Basenpaarungen detektiert und anschließend analysiert.

DNA-Hybridisierung

Die DNA-Hybridisierung ist ebenfalls gut geeignet zur Analyse von Verwandtschaftsbeziehungen.

Zu Beginn der DNA-Hybridisierung wird doppelsträngige DNA so hoch erhitzt, dass sich zwei Einzelstränge bilden. Man spricht dabei auch von Denaturierung. Nun werden Einzelstränge verschiedener Herkunft miteinander vermischt und die Temperatur so weit gesenkt, dass sich zwei komplementäre Stränge aneinander lagen können. Es bildet sich Hybrid-DNA, die Stränge unterschiedlicher Spezies beinhaltet.

Anschließend wird die DNA erneut erhitzt. Je höher der Verwandtschaftsgrad ist, desto später lösen sich die Wasserstoffbrücken wieder voneinander. Eng verwandte Spezies bilden stärkere Bindungen aus, da die DNA-Stränge mehr komplementäre Basenpaare enthalten. So lässt sich vom Zeitpunkt der Denaturierung auf die Verwandtschaft schließen.

Blotting

Die DNA-Hybridisierung kommt auch bei einem Verfahren namens Blotting zum Einsatz.

Die Blotting-Technik funktioniert nicht nur für DNA, bei der die Verankerung in der Membran über DNA-Hybridisierung möglich ist, sondern auch für Proteine und RNA. Während man bei DNA vom Southern Blot spricht, gibt es den Western Blot für Proteine und den Northern Blot für RNA. Um einen Überblick zu geben, werden auch diese Blots hier mitbehandelt.

Allgemein wird ein Gel, eine Membran aus Nylon oder Nitrozellulose und ein Transferpuffer gebraucht. Im Prinzip verlaufen alle Methoden gleich.

Molekularbiologie einfach erklärt

Wie lässt sich Molekularbiologie einfach erklären und so das oben erwähnte zusammenfassen? Molekularbiologie setzt sich mit DNA, RNA und Proteinzusammensetzung von Lebewesen auseinander. Um diese zu untersuchen, gibt es verschiedene Methoden, die auf DNA oder Proteinebene ansetzen können. Nutzt man sie, um Evolution und Verwandtschaftsverhältnisse besser nachvollziehen zu können, spricht man von vergleichender Molekularbiologie.

Die Einsatzgebiete der Molekularbiologie sind vielfältig und reichen von der Aufstellung von Stammbäumen bis hin zur Therapieentwicklung für verschiedene Krankheiten.