Homologe Rekombination

Homologen Rekombination – Ablauf

Die homologe Rekombination setzt voraus, dass zwei identische oder ähnliche doppelsträngige DNA-Moleküle in unmittelbarer Nähe zueinander liegen. Dabei muss nicht der ganze Strang identisch sein. Es reicht schon, wenn eine längere homologe (identische) Sequenz vorliegt.

Kürzung der Enden nach Doppelstrangbruch

Bevor die Rekombination starten kann, müssen die Enden des kaputten Stranges zunächst auf die richtige Länge gekürzt werden. Dabei stutzen spezielle Nukleasen die losen Enden so zurecht, dass Überhänge der 3'-Enden der DNA entstehen.

Austausch der Stränge

Sobald der beschädigte Strang passende Überhänge hat, kommt die zweite, identische DNA zum Einsatz. Der neu geschaffene Überhang schlängelt sich zwischen die beiden Stränge der intakten DNA und sucht nach einer komplementären Sequenz, die er durch Basenpaarung binden kann.

Damit zwei Einzelstränge zu einer doppelsträngigen DNA zusammengehalten werden können, müssen die Sequenzen jeweils komplementär zueinander sein. Jede Base hat auch eine komplementäre Base – Adenin hat Thymin und Cytosin hat Guanin. Diese Basenpaare können in einem Doppelstrang Wasserstoffbrücken zwischen sich ausbilden, wodurch sie zusammengehalten werden. Da zwischen nicht komplementären Sequenzen keine Wasserstoffbrücken ausgebildet werden, können die Stränge an dieser Stelle auch nicht zusammengehalten werden.

Elongation des gekürzten Stranges

Nach der erfolgreichen Bindung an eine komplementäre Sequenz kann die Elongation des defekten Stranges beginnen. Bei der Elongation bindet eine DNA Polymerase an den Strang und fängt an, Nukleotide aneinanderzuhängen, die den Strang verlängern. Als Vorlage wird dazu die Sequenz genommen, an die der Strang zuvor gebunden hat. Die Nukleotide beinhalten Base, die jeweils komplementär zum intakten Strang sind. Auf diese Weise kann der Strang vorlagengetreu wiederhergestellt werden.

Ist der neue Strang weit genug zusammengebaut, kann er sich vom intakten Strang lösen. Der Rest des Prozesses kann nun ohne den homologen, intakten Doppelstrang stattfinden.

Fertigstellung der homologen Rekombinationsreparatur

Hat sich der zu reparierende Strang vom intakten Strang gelöst, kann die Reparatur fortgesetzt werden. Jetzt ist die andere Seite des Doppelstranges an der Reihe: Hier kann der gekürzte Strang auch neu synthetisiert werden, die komplementäre Vorlage dafür ist die andere Seite des Doppelstrangs, die schon mithilfe des intakten Stranges gebildet wurde. Nachdem beide Stränge fertig gebaut sind, müssen nur noch die Lücken zu den intakten Sequenzen geschlossen werden. Diese Aufgabe übernehmen Ligasen.

Homologen Rekombination – Funktionen

Die homologe Rekombination beschreibt einen Mechanismus, der in Zellen zur Erhaltung der Erbinformation und auch für die Gendiversität genutzt wird.

Homologe Rekombination – bei Schäden und Doppelstrangbrüchen in der DNA

Sollte die DNA einen Doppelstrangbruch erleiden, ist die homologe Rekombination eine geeignete Methode, um den Schaden aufzuheben. Doppelstrangbrüche können durch äußere Einflüsse herbeigeführt werden. Dazu zählen unter anderem UV-Strahlung oder verschiedene chemische Reaktionen.

Ein anderer Fall, bei dem die homologe Rekombination von Nutzen ist, sind Schäden an der Replikationsgabel.

Sollte an einer Stelle der DNA ein Einzelstrangbruch oder ein fehlendes Nukleotid vorkommen, fällt der Strang ab, sobald die Replikationsgabel diese Stelle erreicht. Dieses Problem kann dann durch die homologe Rekombination wieder behoben werden.

Homologe Rekombination – Funktion bei der Meiose

Die homologe Rekombination wird nicht nur für Reparaturzwecke genutzt, sondern hat auch eine wichtige Aufgabe bei der Meiose.

Während der Meiose wird homologe Rekombination angewendet, um zwischen den väterlichen und mütterlichen Chromosomen Gene auszutauschen. Auf diese Weise kommt es zu neu kombinierten Chromosomen mit einem Chromosomensatz, der nur aus den väterlichen und mütterlichen Chromosomen zusammengewürfelt ist. Dieser Mechanismus wird auch als crossing over bezeichnet. Im Gegensatz zur DNA Reparatur muss hier zunächst gezielt ein Doppelstrangbruch herbeigeführt werden.

Homologe Rekombination – Funktion bei Viren

Viren haben oft das Problem, dass die Organismen, die sie infizieren, mit der Zeit immun gegen sie werden. Das Immunsystem merkt sich, wie diese Viren von außen „aussehen“ und kann daher besser gegen sie vorgehen. Um dem Immunsystem oder Medikamenten zu entgehen und sich weiter verbreiten zu können, haben Viren daher die Fähigkeit, ihr Genom schnell leichten Veränderungen zu unterziehen. Diese Maßnahme ist primär bei Viren verbreitet, deren genetische Information auf RNA codiert ist, da in dieser öfter zufällige Mutationen auftauchen können als in der DNA.

Eine Methode, ihr Genom zu diversifizieren ist die Einbringung von zufälligen Mutationen, bei denen sich einzelne Basen verändern. Eine andere Methode ist die Einbringung neuer Sequenzen ins Genom durch die homologe Rekombination. Die Voraussetzung dafür ist die Infektion einer Zelle durch zwei verschiedene Viren. Wichtig dabei ist, dass homologe Rekombination nur dann vorliegt, wenn Sequenzen an denselben Stellen der Genome der zwei Viren ausgetauscht werden. Fälle, bei denen genetisches Material von verschiedenen Stellen ausgetauscht wird, können zwar trotzdem als Rekombination bezeichnet werden, allerdings nicht als homologe.

Fehlfunktion und Defizienz der homologen Rekombination

Die korrekte Reparatur eines DNA Doppelstrangs ist maßgeblich für das weitere Überleben einer Zelle. Daher ist es umso gravierender, wenn die homologe Rekombination nicht mehr so funktioniert, wie sie sollte. Die Zellen mancher Menschen sind nicht mehr dazu fähig, die homologe Rekombination immer fehlerfrei durchzuführen. Es kommt zu falsch zusammengebauten DNA Strängen und daher zu Mutationen im Erbgut. Dieser Zustand wird auch als Defizienz der homologen Rekombination (HRD) bezeichnet.

Die Ursache für eine HRD ist meistens genetisch bedingt. Durch den Ausfall bestimmter Gene kann die Funktion der homologen Rekombination beeinträchtigt werden, wodurch eine HRD entsteht. Als Folge der vermehrten Mutationen in Zellen sind Menschen mit einer HRD anfällig für Tumore, vorwiegend in den Eierstöcken. Kommt es zu so einem Fall, spricht man auch von Eierstockkrebs.

Homologe Rekombination – Gentechnische Anwendungen

Die homologe Rekombination wird nicht nur in natürlichen Prozessen diverser Organismen genutzt, sondern auch für Anwendungen der Gentechnik. Da nur die Sequenz der Bindungsstelle eines kaputten Stranges mit der des intakten Stranges übereinstimmen muss, kann sich dieser Prozess zunutze gemacht werden. Es können gewünschte Sequenzen in die Genome mancher Organismen eingebracht oder unerwünschte herausgeholt werden. Die dabei entstehende DNA wird auch als rekombinante DNA bezeichnet.

Rekombinante DNA kann in verschiedene Organismen eingebracht werden, um sogenannte transgene Organismen hervorzubringen – Organismen, in deren Genom DNA aus anderen Lebewesen enthalten ist.

Transgene Organismen sind hauptsächlich in der Industrie und der Forschung wichtig.

Wird ein Gen im Wirt durch homologe Rekombination verändert – egal ob es danach verändert oder gar nicht mehr vorhanden ist – wird der Prozess auch als gene targeting bezeichnet.

Gene targeting und knock-out durch homologe Rekombination

Für das gezielte Verändern oder Ausschalten von Genen – auch genannt knock-out – durch homologe Rekombination müssen einige Punkte beachtet werden.

• Das neu einzubringende Gen muss zunächst in einen Vektor eingebracht werden. Vektoren sind Plasmide, also kreisförmige DNA Stränge, in die das gewünschte Gen eingebaut wird. Dieser Vektor kann später vom zu verändernden Organismus aufgenommen werden.
• Da homologe Rekombination voraussetzt, dass ein Strang einen Bruch hat, müssen vor dem eigentlichen Prozess Restriktionsenzyme angewendet werden. Das sind Enzyme, die DNA an einer ganz bestimmten Stelle aufschneiden können. Dafür binden sie an eine vorher definierte Basensequenz und schneiden dort wie eine Schere durch den DNA-Strang.
• Das Einbringen eines Gens durch homologe Rekombination funktioniert nur in seltenen Fällen. Um im weiteren Verlauf genau die Zellen auswählen zu können, in die das gewollte Gen eingebaut wurde, muss der Vektor entsprechend konstruiert werden.

Konstruktion des richtigen Vektors

Ein Vektor, der für die homologe Rekombination genutzt wird, muss bestimmte Gene enthalten. Diese müssen sich an der Sequenz orientieren, die an der gewünschten Stelle im Genom bereits vorhanden ist. Die bereits im Genom des Zielorganismus vorhandene Sequenz kann dabei folgendermaßen aussehen.

Die Sequenz, an der die Bindung für die homologe Rekombination stattfindet, muss zwingend homolog, also identisch, zu der Sequenz im Vektor sein. Ansonsten sollte der Vektor folgende Sequenzen enthalten.

1. Das neu einzubringende Gen. Dieses Gen muss nicht unbedingt ein komplett neues Gen sein. Es kann auch schon im Organismus enthalten sein, aber auf dem Vektor eine Mutation enthalten, die die Funktion verändern oder ausschalten würde.
2. Zwei Bindungssequenzen, die mit den Sequenzen im Zielgenom übereinstimmen.
3. Ein Markergen zwischen den Bindungssequenzen. Dieses wird im Rahmen der homologen Rekombination mit in das Zielgenom eingebaut.

   In Bakterien kann dieses Markergen zum Beispiel für eine Antibiotika-Resistenz codieren. Nach dem Prozess der homologen Rekombination können die Bakterien auf einer Platte verteilt werden, die dieses Antibiotikum enthält. Nur Bakterien, die den Vektor eingebaut haben, sollten resistent sein. Diese Bakterien fangen an, in Kolonien zu wachsen und mit ihnen können die Experimente fortgeführt werden. Alle anderen Bakterien ohne die Resistenz sterben.

4. Ein Markergen außerhalb der Zielsequenzen. Dieses sollte nicht ins Genom eingebaut werden.

   In Bakterien kann hierfür etwa das Gen sacB eingebaut werden. Es kodiert für das Enzym Levansucrase, das in Anwesenheit von Sucrose einen toxischen Stoff produziert. Ist die Zielsequenz durch homologe Rekombination eingebaut worden, dann sollte dieses Gen nicht eingebaut worden sein, da es außerhalb der Bindungssequenzen lag. Ist der Genabschnitt allerdings auf andere Weise eingebaut worden – und daher vielleicht auch gar nicht an seinem eigentlichen Ziel –, ist dieses Markergen nun im Genom des Zielorganismus enthalten. Die Platte, auf der die Bakterien als Nächstes ausgestrichen werden, enthält daher Sucrose, um die Reaktion der wachsenden Kolonien darauf beobachten zu können. Bakterien, die dieses Markergen eingebaut haben, stellen Levansucrase her, das wiederum einen toxischen Stoff produziert. Diese Bakterien sterben.

Da die Anwendung der homologen Rekombination aufwendig ist und keine hohe Einbaufrequenz aufweist, werden heutzutage zum gezielten Einbau von Genen allerdings andere Methoden genutzt. Dazu gehören insbesondere die Nutzung des CRISPR/Cas9 Systems oder Zinkfingernukleasen.