Koloniehybridisierung

Koloniehybridisierung – Ablauf

Die DNA-Koloniehybridisierung ist ein Verfahren, welches in festen Phasen erfolgt. Bei der Koloniehybridisierung werden Bakterienkolonien auf einen Filter oder eine Membran gelegt. Daraufhin folgt die Freilegung der DNA durch eine sogenannte Bakterienlyse.

Ebenso wird die DNA denaturiert und auf der Membran fixiert. Im Anschluss folgt die Hybridisierung, bei der sich eine beigefügte DNA-Sonde mithilfe von Wasserstoffbrückenbindungen an einen spezifischen DNA-Einzelstrang bindet.

Die Sonden sind immer markiert, damit nach Beendigung des Prozesses komplementäre Bereiche detektiert werden können. Zuletzt werden Sonden, welche sich nicht an einen DNA-Einzelstrang gebunden haben, abgewaschen. Im letzten Schritt werden die Sonden mithilfe von zwei unterschiedlichen Methoden, auf die unten eingegangen wird, sichtbar gemacht.

1. Schritt: Bakterienlyse

Die Bakterienlyse beschreibt das Auflösen der Zellwand des Bakteriums. Dabei gibt es verschiedene Möglichkeiten, um dies zu erreichen: zum Beispiel durch Erhöhung des pH-Wertes und der Temperatur. Auch eine Nutzung von UV-Strahlen ist möglich, um die Zellwand aufzulösen. Oftmals werden für diesen Prozess Natriumhydroxid und Dampf, oder Mikrowellenstrahlung verwendet. Um mögliche Rückstände der Zelle zu entfernen, nutzt man die Proteinase K.

2. Schritt: Denaturierung

Fast zeitgleich zur Bakterienlyse erfolgt auch die Denaturierung der DNA. Die Denaturierung bewirkt das Aufspalten des DNA-Doppelstrangs in seine beiden Einzelstränge, indem die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst werden. Dafür ist lediglich eine Temperatur über 94 Grad Celsius notwendig. Diese kann zum Beispiel mit Dampf oder Mikrowellenstrahlung erreicht werden.

3. Schritt: Fixation der DNA

Die Fixation der DNA wird ebenfalls durch das Anheben des pH-Wertes mit gleichzeitig steigender Temperatur gesichert. Die Fixation bewirkt, dass die DNA an ihren Ort gebunden ist. Sie ist nun also nicht mehr beweglich, sondern fest an die Membran, auf welche die DNA gelegt worden ist, gebunden.

4. Schritt: Zugabe der Sonde

Heutzutage existieren automatisierte Verfahren zur Herstellung von Sonden, die man als synthetische Oligonukleotid-Sonden bezeichnet. Ebenfalls ist es durch Fortschritte in der Forschung möglich, kleinere Sonden herzustellen. Kleinere Sonden haben den Vorteil, dass es unwahrscheinlicher ist, dass sie an mehrere Gene andocken. Ein Andocken an mehrere Gene würde die Sonde unbrauchbar machen.

5. Schritt: Hybridisierung

Bei der Hybridisierung werden zwischen der einsträngigen Sonde und dem DNA-Einzelstrang Wasserstoffbrückenbindungen gebildet. Dabei entsteht Abschnitte, welche DNA-Doppelstränge bilden. Bei einer Temperatur von etwa 20 Grad unter dem Schmelzpunkt läuft die Hybridisierung am schnellsten ab.

6. Waschschritte

Durch sogenannte Waschschritte werden die Sonden entfernt, die sich an keinen DNA-Einzelstrang gebunden haben. Bei den Waschschritten ist eine passende Temperatur ausschlaggebend. Sie darf nicht zu hoch sein, damit sich nicht bereits gebundene Wasserstoffbrückenbindungen wieder auflösen, aber auch nicht zu niedrig, da dies zu fehlerhaften Basenpaaren führen kann.

7. Detektion

Die Detektion beschreibt das Aufspüren der zuvor beigefügten Sonden. Dies ist notwendig, um die erhaltenen doppelsträngigen DNA-Fragmente zu detektieren. Unterschieden wird dabei zwischen Sonden, welche mit einem radioaktiven Stoff markiert worden sind, und jenen, die mit anderen Farbstoffen markiert worden sind.

Radioaktiv-markierte Sonden

Die Sonden, die radioaktiv markiert worden sind, werden mittels Autoradiografie detektiert. Dabei wird ein Röntgenfilm auf die Membran gelegt und in einer sogenannten Röntgenkassette platziert. Danach folgt eine mehrstündige Belichtungszeit. Anschließend wird der Film entwickelt. Einen positiven Ausschlag erkennt man dann durch das Vorhandensein von Radioaktivität. Diese ist in Form von kleinen, schwarzen Punkten auf dem Röntgenbild erkennbar.

Radioaktiv-markierte Sonden sind sehr sensitiv, doch da ihre Handhabung und die spätere Entsorgung hohen Aufwand und höhere Kosten verursachen, werden sie nur noch selten genutzt.

Nicht-radioaktive Sonden

Bei Sonden, die nicht radioaktiv markiert worden sind, werden meist fluoreszente Farbstoffe genutzt. Dabei kann dieser direkt an die Sonde gekuppelt sein, aber auch indirekt an ein Indikatormolekül angebunden sein. Häufig genutzte Indikatormoleküle sind Biotin, Fluoreszein oder Digoxigenin (DIG). Durch ihre einfachere Handhabung greift man in der modernen Forschung eher auf diese Weise der Markierung zurück. Teilweise ist es sogar möglich, die Sonden bei bis zu -20 Grad Celsius zu lagern, und sie mehrmals wiederzuverwenden, ohne, dass ein Qualitätsverlust einhergeht.

Bedeutung der Koloniehybridisierung

Bisher wurde die Koloniehybridisierung hauptsächlich in der Lebensmittelforschung genutzt. Mit ihr war es möglich, Lebensmittel in kurzer Zeit auf verschiedenste, lebende Bakterienkolonien zu prüfen. Seit Ende des 21. Jahrhunderts hat sich das Nutzungsgebiet auch auf die Abwasserforschung erweitert. Die Prüfung des Abwassers mithilfe der Koloniehybridisierung bringt zuverlässige Ergebnisse, um die Wasserqualität zu prüfen. Ebenso wird die Koloniehybridisierung auch im medizinischen Sektor angewandt.

Ein großer Nachteil der DNA-Koloniehybridisierung ist, dass vor Anwendung eine Kultivierung der Bakterien notwendig ist. Bei der Kultivierung wachsen die Bakterien unter kontrollierten Bedingungen, wie bei einer bestimmten Temperatur und Luftfeuchtigkeit. Dies ist einerseits nicht nur zeitaufwendiger, sondern bringt auch den Nachteil mit, dass höchstens 15 % aller Organismen auf die Kultivierung anspringen. Das hat zur Folge, dass möglicherweise nicht alle Bakterien die vorhanden sind, durch die Koloniehybridisierung erkannt werden.