Polymerase Kettenreaktion

Polymerase Kettenreaktion – PCR Verfahren

Heutzutage ist diese Technik nicht mehr aus der Molekularbiologie wegzudenken. Beispielsweise wird die Methode genutzt, um den genetischen Fingerabdruck in kürzester Zeit zu erstellen. Allgemein findet die PCR-Methode dort ihre Anwendung, wo Forscher*innen nicht ausreichend DNA vorliegt.

Die Labormethode wurde in den 1980-er Jahren von dem DNA-Chemiker Kary Banks Mullis erfunden. Seither hat seine Erfindung an großer Bedeutung gewonnen und ist aus der biologischen Forschung nicht mehr wegzudenken. 1993 erhielt der Wissenschaftler dafür den Nobelpreis in Chemie.

Mithilfe eines Geräts, dem Thermocycler, können die Wissenschaftler*innen die PCR durchführen. Die wichtigste Aufgabe des Geräts ist es, die erforderliche Temperatur für die einzelnen Phasen der Polymerase-Kettenreaktion herzustellen.

Polymerase Kettenreaktion – Ablauf

Der Ablauf der Polymerase Kettenreaktion sieht folgendermaßen aus:

Zuerst wird die zu vervielfältigende DNA in einen Thermocycler gegeben. Doch neben der DNA gibt es weitere Komponenten, die in den Thermocycler hinzugefügt werden müssen, damit das Gerät den gewünschten DNA-Abschnitt vervielfältigen kann. Hierzu gehören:

1. Eine stabile DNA-Polymerase: Hierzu wird oft die Taq-Polymerase genutzt, welche aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus stammt. Diese spezielle Polymerase wird aus heißen Quellen isoliert und ist daher an das Arbeiten bei hohen Temperaturen gewöhnt, was bei anderen Enzymen meistens nicht der Fall ist.
2. Freie Nukleotide: Die freien Nukleotide dienen als Bausteine für die neu synthetisierten DNA-Stränge.
3. Primer: Die verwendeten Primer bestehen aus mehreren Nukleotiden und sind komplementär zu den jeweiligen Anfängen des DNA-Doppelstrangs. Sie sollen sich während der PCR am Anfang des Strangs anlagern, damit die Taq-Polymerase von dort aus weiterarbeiten kann und die restlichen komplementären Nukleotide verknüpfen kann.
4. Pufferlösung aus Magnesium: Eine Pufferlösung aus Magnesium ist notwendig für die Enzymaktivität der Polymerase.

Befinden sich alle Bestandteile im Thermocycler, so kann das Gerät eingeschaltet werden und die PCR beginnen. Die Polymerase Kettenreaktion läuft in drei Schritten ab: der Denaturierung, Hybridisierung und Elongation.

Abbildung 1: Ablauf der PCR

Polymerase Kettenreaktion – PCR Schritte

Was in den Phasen Denaturierung, Hybridisierung und Elongation in der Polymerase-Kettenreaktion genau passiert, erklären Dir die folgenden Abschnitte genauer.

Phase 1: Denaturierung

Allgemein liegt die DNA zu Beginn der PCR-Methode in ihrer Doppelhelixstruktur vor. Damit die DNA jedoch vervielfältigt werden kann, muss sie ihre Struktur ändern und in zwei Einzelstränge aufgetrennt werden. Ansonsten könnten sich im Verlauf der PCR keine Primer anlagern und die taq-Polymerase nicht arbeiten.

Hierzu werden zuerst die Wasserstoffbrücken, durch die die einzelnen DNA-Stränge verbunden sind, gespalten. Denn letztlich sollen zwei einzelne DNA-Stränge vorliegen, an die nachher die komplementären Nukleotide angelagert werden können.

Um die Doppelhelix zu trennen, wird nun denaturiert. Das bedeutet, dass der Thermocycler die DNA erhitzt. Dies geschieht für etwa eine halbe Minute, wobei die DNA innerhalb des Thermocyclers Temperaturen von 95 Grad Celsius erreicht. Als Resultat brechen die Wasserstoffbindungen auseinander. Das Ergebnis der Denaturierung sind zwei einzelne Stränge der DNA, mit denen weitergearbeitet werden kann.

Phase 2: Hybridisierung

Im nächsten Schritt werden bei etwa 60 Grad Celsius die beiden Primer an die einzelnen DNA-Stränge angelegt. Die Temperatur ist jeweils von den verwendeten Primern abhängig und befindet sich etwa 5–10 Grad Celsius unter deren Schmelzpunkt. Diesen Teil der PCR nennt man auch Hybridisierung.

Bei den Primern handelt es sich um kurze DNA-Abschnitte, die sich an die Einzelstränge anlagern. Sie dienen der Taq-Polymerase als Startpunkt und flankieren die Zielsequenz der DNA, die vervielfältigt werden soll. Wichtig ist hierbei, dass die Primer komplementär zu den jeweiligen Basen des DNA-Abschnitts sind. Darüber hinaus dürfen die Primer nicht untereinander komplementär sein, damit sich die Primerpaare nicht selbst hybridisieren.

Phase 3: Elongation

Im letzten Schritt, der Elongation, setzt das hitzebeständige Enzym Taq-Polymerase an die Primer an. Von dort aus synthetisiert sie die komplementären Stränge zu den einzelnen DNA-Strängen.

Hierbei wandert die DNA-Polymerase in 5´-3´-Richtung und greift auf die Basen in der Lösung zurück. Diese werden mit dem Ausgangs-DNA-Strang verknüpft. Insgesamt werden also die komplementären Basen miteinander verbunden und der anfängliche Doppelstrang reproduziert.

Die DNA-Polymerase arbeitet bei einer Temperatur von etwa 70 Grad Celsius und kann mit einer Geschwindigkeit von 500 Basenpaaren in einer halben Minute schnell einen Komplementärstrang bilden.

Polymerase Kettenreaktion – Ergebnis

Nach der Elongation liegt ein verdoppelter DNA-Abschnitt vor. Wenn man den Prozess anschließend wiederholt, verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Einzelstränge bei jedem Zyklus. Somit liegen nach der zweiten Wiederholung vier Einzelstränge und nach der dritten Wiederholung acht Einzelstränge vor. Die Anzahl der DNA-Stränge steigt mit jedem Durchgang im Thermocycler exponentiell.

Um die Anzahl der DNA-Stränge zu berechnen, kann folgende Formel hinzugezogen werden:

Anzahl der DNA-Stränge = 2ⁿ

Das n bezieht sich hierbei auf die Anzahl der Durchgänge im Thermocycler.

Polymerase Kettenreaktion – Anwendungsbereiche

Die PCR spielt heute eine wichtige Rolle in der Forschung. Mithilfe der PCR können bei Infektionen zeitaufwendige Verfahren zum Nachweis der ursächlichen Erreger, etwa die Anzucht von Bakterienkulturen aus Proben, umgangen werden. Die PCR bietet hierzu eine schnellere und ebenso effiziente Alternative.

Genauso gut kann man mithilfe der PCR Erbkrankheiten nachweisen. Vor allem Mutationen können durch die Untersuchung des menschlichen Genoms festgestellt werden.

Forscher*innen gelang es bereits durch die PCR Fossilien zu reproduzieren, obwohl die Art schon längst ausgestorben war. Hierzu benutzten sie genetisches Material einer Insektenart aus Bernsteinfossilien und vervielfältigten dieses.

Bei polizeilichen Untersuchungen bietet sich die PCR an, wenn nur ein winziger Teil DNA am Tatort gefunden werden konnte. Dieser Abschnitt kann mit der PCR dann beliebig oft kopiert und anschließend für einen genetischen Fingerabdruck benutzt werden. Genauso kann die Polymerase-Kettenreaktion auch Vaterschaftstests ermöglichen.

Vergleich – Polymerase-Kettenreaktion und DNA-Replikation

Bei der Polymerase-Kettenreaktion und der DNA-Replikation handelt es sich um zwei verschiedene Prozesse, in denen die DNA jeweils verdoppelt wird. Dennoch sind diese Prozesse keinesfalls gleichzusetzen.

Der Unterschied zwischen der DNA Replikation und der Polymerase Kettenreaktion liegt darin, dass die DNA-Replikation im Körper des Menschen während der Interphase (S-Phase) stattfindet. Es handelt sich also um einen natürlichen Mechanismus.

Die PCR ist hingegen eine Methode, um DNA im Labor (in vitro) künstlich zu vervielfältigen.

Außerdem wird die Doppelhelixstruktur im Körper, also während der DNA-Replikation, nicht durch Denaturierung aufgespalten, sondern durch das Enzym Helicase.

Auch die Primer der beiden Mechanismen sind unterschiedlich. In der PCR handelt es sich um künstliche DNA-Primer und in der DNA-Replikation greift die Polymerase auf RNA-Primer zurück, welche durch Primate gesetzt werden.

In der PCR verläuft die Polymerase kontinuierlich vom 5´ zum 3´Ende. Bei der DNA-Replikation verläuft die Polymerase nur am Leitstrang kontinuierlich und am Folgestrang diskontinuierlich.

In der PCR wird zudem auf ein hitzebeständigeres Enzym zurückgegriffen, wie etwa die taq-Polymerase. Bei der DNA-Replikation ist dies nicht notwendig, da es zu keiner Erhitzung kommt.