Rekombinante DNA

Rekombinante DNA – Technologie

Wie in den meisten gentechnologischen Methoden werden zur Herstellung von rekombinanter DNA unterschiedliche gentechnische Werkzeuge benötigt. Bei diesen gentechnologischen Werkzeugen handelt es sich meistens um unterschiedliche Enzyme, welche bestimmte Reaktionen begünstigen.

Rekombinante DNA – Benötigte Enzyme

• Restriktionsenzyme: Restriktionsenzyme binden an doppelsträngiger DNA und schneiden diese. Der Schnitt erfolgt an spezifischen Erkennungssequenzen.

• Ligasen: Ligasen sind der Gegenspieler zu Restriktionsenzymen. Ligasen sind Enzyme, welche doppelsträngige DNA-Fragmente unter bestimmten Voraussetzungen wieder miteinander verknüpfen.

• Polymerasen: Polymerasen sind Replikationsenzyme. Polymerasen ermöglichen die Replikation, also die Verdopplung, genauer gesagt die Vervielfältigung von DNA-Fragmenten.

Rekombinante DNA – Weitere Werkzeuge

• Vektoren: Vektoren dienen als Transportmittel für Nukleinsäuren (DNA-Fragmente). In der Gentechnik werden Vektoren genutzt, um rekombinante DNA in eine Wirtszelle beziehungsweise in einen Organismus zu integrieren. Ein typischer Vektor sind Plasmide. Plasmidvektoren sind kleine ringförmige DNA-Fragmente, welche aus Bakterien isoliert werden.

Rekombinante DNA – Anwendung & Beispiel

Die Herstellung von rekombinanter DNA ist Teil von vielen gentechnischen Standardverfahren. Diese Technik spielt eine bedeutende Rolle in der genetischen Grundlagenforschung, sowie in industriell relevanten und biotechnologischen Verfahren.

Nach der Herstellung von rekombinanter DNA wird diese in eine Wirtszelle oder Wirtsorganismus integriert. Es entsteht ein transgener Organismus.

Durch die Integrierung ausgewählter Gene in Bakterienzellen können gewünschte Proteine durch Bakterien hergestellt werden. In der Pflanzen- und Tierzucht versucht man genetisch modifizierte Individuen (transgene Organismen) hervorzubringen, welche eine stärkere Ausprägung gewünschter Merkmale aufweisen.

Rekombinante DNA – Herstellung

Zur Herstellung rekombinanter DNA werden verschiedene Schritte in einer bestimmten Reihenfolge durchgeführt. Dabei kommen die genannten gentechnischen Werkzeuge zum Einsatz. Im folgenden Abschnitt wird auf die einzelnen Schritte der Methode eingegangen.

1. Isolierung der DNA

Zur Isolierung von DNA wird die Membran und der Zellkern der Spenderzelle aufgelöst. Anschließend werden die enthaltenen Proteine durch Enzyme (Proteasen) abgebaut. Mithilfe von Ethanol kann die DNA von der Lösung separiert werden. Durch Restriktionsenzyme wird die DNA in Fragmente geschnitten, welche geeignet sind, um sie in einen Vektor zu integrieren.

2. Isolierung und Aufschneiden des Vektors

Häufig werden Plasmide aus Bakterien (Plasmidvektoren) isoliert, oder modifizierte Virus-Partikel als Vektoren genutzt. Diese werden isoliert und entsprechend modifiziert, um als Vektor funktionieren zu können. Im nächsten Schritt wird die Vektor-DNA an einer spezifischen Stelle geschnitten. Es entsteht eine Lücke, in welcher die Spender-DNA integriert werden kann.

Wichtig ist, dass beim Schneiden der Spender-DNA und der Vektor-DNA dieselben Restriktionsenzyme genutzt werden. Dadurch sind die Enden der Fragmente komplementär zueinander und können wieder miteinander verknüpft werden.

3. Hybridisierung

Die Hybridisierung ist der Schritt der Rekombination der DNA. Die Spender-DNA wird mit der Vektor-DNA, mithilfe von Ligasen, verknüpft. Als Produkt erhält man rekombinante DNA (Abbildung 1).

4. Integrierung in eine Wirtszelle

Im nächsten Schritt wird die rekombinante DNA in eine Wirtszelle eingeschleust. Hierbei handelt es sich um einen sogenannten Gentransfer. Je nachdem welcher Vektor genutzt wurde und in welchen Organismus die rekombinante DNA integriert werden soll, wurden unterschiedliche Verfahren zur Integrierung entwickelt.

Plasmidvektoren werden durch Transformation in die Wirtszelle integriert. Hierfür wird die Wirtszelle (Bakterien- oder Tierzelle), zum Beispiel Calciumionen, mit kurzen elektronischen Impulsen behandelt. Durch diese Behandlung wird die Membran für die Vektoren durchlässig gemacht. Die Plasmidvektoren können über die Zellmembran in die Wirtszelle integriert werden.

5. Selektive Identifizierung

Die Methode zur Herstellung von rekombinanter DNA und deren einzelne Teilschritte haben keine 100%ige Erfolgsquote. Am Beispiel der Plasmidvektoren hat das zur Folge, dass bei der Hybridisierung, die Spender-DNA nur von einem Teil der Plasmidvektoren integriert wird. Im Teilschritt der Transformation nimmt nur ein geringer Teil der Bakterienzellen ein Plasmid in sich auf.

Daher müssen die Wirtszellen, in denen die Spender-DNA erfolgreich integriert wurde, von den anderen unterschieden werden. Hierfür werden Eigenschaften genutzt, welche den Wirtszellen durch die integrierten Vektoren verliehen werden.

Am folgenden Beispiel kannst Du Dir ein Bild davon machen, wie ein Selektionsverfahren, zur Identifizierung von erfolgreich integrierter rekombinanter DNA, aussehen kann.

6. Vermehrung der transgenen Organismen

Sind die Zellen mit der integrierten DNA identifiziert, werden diese im nächsten Schritt vermehrt. Bei der Vermehrung der Zellen spricht man von einer sogenannten Klonierung. Durch die Replikationsenzyme der Wirtszelle (DNA-Polymerasen) wird der Vektor samt der integrierten DNA vervielfacht. Somit kann diese an die nächste Zellgeneration weitergegeben werden. Es entsteht eine Zellkolonie mit identischem Erbgut.