Sequenzanalyse

Sequenzierung Biologie: Verfahren

Im Anschluss findest du einen Überblick über die wichtigsten Methoden zur Sequenzanalyse. Während ältere Verfahren v.a. basenspezifische Brüche im DNA-Strang nutzen , sucht man bei modernen Methoden nach noch effizienteren Alternativen.

DNA Sequenzanalyse: Maxam-Gilbert-Methode

Im Jahre 1977 entwickelten die beiden amerikanischen Forscher Allan Maxam und Walter Gilbert eine der ersten Methoden zur DNA-Sequenzierung. Ihr Verfahren beruhte auf einer basenspezifischen, chemischen Spaltung der DNA.

Der zu untersuchende DNA-Abschnitt wurde an einem Ende radioaktiv markiert und in vier Reaktionsgefäße aufgeteilt. In jedem der Gefäße wurden andere Basen(-kombinationen) chemisch modifiziert (entweder Guanin allein, Adenin und Guanin, Cytosin oder Cytosin und Thymin).

An den Stellen in der Abfolge, an denen eine der modifizierten Basen vorkam, entstand ein Bruch im DNA-Strang. Da in jedem der vier Reaktionsgefäße andere Basen zu den Brüchen führten, ergaben sich vier charakteristische Mischungen unterschiedlich langer DNA-Stücke. Diese wurden im Anschluss vervielfältigt.

Die Proben aus den vier Reaktionsgefäßen wurden nun auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel gegeben und entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.

DNA Sequenzanalyse: Ablauf

Zunächst gingen ihre Untersuchungen von einer doppelsträngigen DNA aus, die auf jeder Seite des Einzelstrangs mit einem radioaktiven Primer markiert und schließlich durch Denaturierung in zwei Einzelstränge aufgetrennt wird.

Die Einzelstränge werden dann in vier verschiedenen Reaktionsvorgängen mit Lösungen bestimmter Chemikalien behandelt. Diese haben die Aufgabe spezifische Nukleotide zu zerstören. Am Ende wird erreicht, dass eine der vier Basen abgespalten wird und DNA-Fragmente entstehen. Folgendes Beispiel hilft dir, dir diesen Vorgang konkreter vorzustellen:

Zum Schluss werden mithilfe der Gelelektrophorese die DNA-Fragmente der Länge nach sortiert. Kurze Fragmente wandern hierbei weiter als lange. Nach den vier Abspaltungsvorgängen kann der Standort der einzelnen Basen abgelesen werden, da sie radioaktiv markiert sind. Sie schwärzen das Gel, welches mit einem strahlenempfindlichen Film bedeckt ist.

DNA Sequenzanalyse: nach Sanger

Die ursprünglich von Sanger und Coulson entwickelte Sequenzanalyse wird auch als Didesoxymethode oder Kettenabbruch-Synthese bezeichnet. Sie wird häufiger angewendet, da dazu heutzutage keine gefährlichen chemischen Stoffe mehr genutzt werden.

DNA Sequenzanalyse: Ablauf

Zunächst wird aus der zu untersuchenden doppelsträngigen DNA eine einzelsträngige DNA erzeugt. Dafür wird die reine DNA-Probe bei 94 °C für 1 min erwärmt. Nun liegen lediglich DNA-Einzelstränge vor, an denen weitere DNA-Stränge mit unterschiedlichen Längen synthetisiert werden können.

Da die DNA aus vier unterschiedlichen Nukleotiden gebildet wird, werden vier getrennte Reaktionsansätze gestartet. In jedem Reaktionsansatz befindet sich die gleiche DNA-Polymerase und der gleiche sequenzspezifische-Primer.

Dabei bestimmt die Primersequenz den Beginn für die Synthese des neuen DNA-Strangs. Der Primer bindet an eine bereits bekannte Sequenz der DNA. Neben Primer und DNA-Polymerase befinden sich auch freie Nukleotide (dNTPs) in der Reaktionslösung, mit denen die Polyermase komplementäre DNA-Stränge bilden kann.

Als nächstes wird in jeden Ansatz je eines von vier Didesoxynukleotiden (kurz ddNTPs) hinzugefügt. Sie gleichen dem Aufbau der unmodifizierten Nukleotidbasen (dNTPs). Bei den Didesoxynukleotiden fehlt allerdings eine 3‘-OH-Gruppe, sodass kein weiteres dNTP oder ddNTP angehängt werden kann.

Zu Beginn der Verfahrensentwicklung wurden ddNTPs radioaktiv markiert, später stieg man auf gesundheitsschonendere Fluoreszenz-Farbstoffe um.

Wird ein Didesoxynukleotid eingebaut führt es dazu, dass die Strangsynthese abgebrochen wird. Deshalb hat man diesem Verfahren auch den Namen des Kettenabbruchverfahrens gegeben.

• Eine einzelsträngige DNA wird genutzt. Ein dazu passender DNA-Strang wird synthetisiert. Ein Primer wird dazu gegeben, der den Anfangspunkt für die Synthese durch die DNA-Polymerase liefert.
• Hinzu werden Didesoxynukleotide gefügt, die radioaktiv markiert sind. Beim Einbau dieser Didesoxynukleotide während der Synthese, kommt es zu einem Kettenabbruch.

Zum Schluss erhält man unterschiedlich lange DNA-Fragmente mit verschiedenen Enden, ähnlich wie bei der Maxam- und Gilbert- Methode. Sie werden mithilfe der Gelelektrophorese der Länge nach geordnet. Die Abbruchstellen durch die Didesoxynukleotide, sind zu erkennen, da sie durch die ddNTPs markiert sind. Anschließend werden die Informationen von einem Detektor abgelesen und der Computer berechnet aus den Daten die Basensequenz im DNA-Molekül aus. Die Informationen können dann in der Wissenschaft genutzt werden, um Genome zu untersuchen.

DNA Sequenzanalyse – Moderne

Da die DNA-Sequenzanalyse ziemlich häufig in der Forschung verwendet wird, wurden im Laufe der Zeit automatisierte und effizientere Verfahren entwickelt. Diese neueren Methoden werden auch unter dem Begriff Next Generation Sequencing zusammengefasst. Eines dieser Verfahren ist die Pyrosequenzierung:

DNA Sequenzanalyse: Pyrosequenzierung

Bei der Pyrosequenzierung werden Lichtsignale gemessen, die bei dem Einbau von Nukleotiden in den DNA-Strang entstehen. Genauer entsteht ein Lichtsignal, wenn Pyrophosphationen während des Einbaus des Nukleotids abgespalten werden. Das Lichtsignal wird von einem Detektor aufgefangen und in eine Basensequenz umgerechnet.

Zuerst wird das zu untersuchende DNA-Fragment über eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt. Nun werden gleich große Anteile an DNA-Fragmenten in viele einzelne Reaktionskammern gegeben, in denen die DNA an kleine Glaskugeln anheftet. Da es sich um die gleichen DNA-Fragmente handelt, wird nicht ein einzelnes Lichtsignal aus einem Einbau in einer Reaktionskammer gemessen, sondern direkt ein Vielfaches aus allen DNA-Strängen in allen Reaktionskammern.

Während der Reaktion werden kontrolliert einzelne Nukleotide in die Reaktionskammern gegeben, bis keine weiteren Lichtsignale erhalten werden. Dabei ist die freiwerdende Energie in Form von Licht direkt abhängig von abgespaltenem Pyrophosphat. So können auch aufeinander folgende Mehrfacheinbauten wahrgenommen werden. Bleiben Lichtsignale aus, wird das nächste Nukleotid hinzugegeben. Überschüssige Nukleotide werden über ein spezielles Enzym abgebaut.

Abbildung 3: Aufbau der Pyrosequenzierung.

DNA Sequenzanalyse – Nutzung

In der medizinischen Diagnostik wird die Sequenzanalyse genutzt um Erbkrankheiten zu erkennen und sie mit DNA-Sequenzen gesunder Patienten zu vergleichen. Das Ziel ist es die Mutation in der DNA-Sequenz zu finden, um bei Ungeborenen oder Neugeborenen eine Erbkrankheit zu detektieren und frühzeitig zu therapieren.

Ein weiterer Bereich in der Medizin ist die Erforschung von DNA-Mutationen, wie zum Beispiel bei Antibiotika Resistenzen. Die Sequenzanalyse trägt im Endeffekt dazu bei, entsprechende Medikamente entwickeln zu können.

In der Phylogenetik (Gebiet welches sich mit der Stammesgeschichte der Lebewesen beschäftigt) wird die Sequenzanalyse ebenfalls genutzt um Verwandtschaftsgrade zu untersuchen. Aus diesen Informationen können dann Stammbäume erstellt werden.