Methoden der Zellbiologie

Untersuchungsmethoden der Zellbiologie

Heutzutage werden Zellen auf sehr verschiedene Arten und Weisen untersucht, um ihre Funktion und ihren Aufbau sowie Reaktionen auf äußere Einflüsse näher zu verstehen. Dafür werden die biologischen Methoden der Zellbiologie auch oft mit chemischen Verfahren ergänzt.

Je nachdem, welche Methode zur Untersuchung angewendet wird, können verschiedene Mengen und Arten an Informationen erhalten werden. Während manche Methoden sogar erlauben, die Wege einzelner Proteine zu verfolgen, kann mit anderen Methoden lediglich die Zahl von Zellen in einer Probe bestimmt werden.

Unterschieden werden die Methoden der Zellbiologie auch darin, in welchem Zustand sich die untersuchten Zellen befinden. Nicht alle Methoden der Zellbiologie sind dafür geeignet, lebende Zellen zu untersuchen. Allerdings werden auch nicht in allen Experimenten zwingend lebende Zellen benötigt. Daher ist es wichtig, abzuwägen, was genau herausgefunden werden soll, bevor eine Methode angewandt wird.

Methoden der Zellbiologie: Methoden in der Mikroskopie

Es wird zwischen Elektronen- und Lichtmikroskopie unterschieden. Die Betrachtung verschiedenster Zellstrukturen unter dem Mikroskop – sei es zur Charakterisierung, zur Interaktionsuntersuchung oder zur Suche nach Abnormalitäten – gehört zu den Grundlagen der Untersuchungsmethoden der Zellbiologie.

Lichtmikroskopie

Bei der Lichtmikroskopie werden die zu untersuchenden Präparate, zum Beispiel Mikroskopzellen, mit Licht angestrahlt.

In der Lichtmikroskopie kann zwischen Durchlicht- und Auflichtmikroskopie unterschieden werden.

Bei der Durchlichtmikroskopie wird das Präparat von unten angestrahlt. Die Lichtstrahlen transmittieren durch die Probe und werden durch ein Linsensystem an das Auge weitergeleitet. Das Linsensystem leitet die Lichtstrahlen außerdem auf eine solche Weise, dass beim Betrachter ein vergrößertes Bild ankommt. Damit das Licht die Probe passieren kann, ist es nötig, dass die Probe sehr dünn präpariert wird.

Bei der Auflichtmikroskopie wird das Präparat nicht durchleuchtet, sondern von oben beleuchtet. Daher wird sie hauptsächlich dann genutzt, wenn die Probe lichtundurchlässig ist.

Aufbau eines Lichtmikroskops

In folgender Abbildung kannst Du den Aufbau eines konventionellen Lichtmikroskops (Durchlichtmikroskop) und seine verschiedenen Bestandteile erkennen.

Die Probe wird zwischen zwei Glasscheiben auf dem Objektträger platziert. Mit dem Kondensor kann eingestellt werden, wie viel Licht von der Lichtquelle unter dem Objektträger auf die Probe gestrahlt wird. Am Revolverkopf sind mehrere Objektive mit unterschiedlichen Vergrößerungsstufen befestigt. In diesen Objektiven befinden sich Linsen, die von den Probe stammende Lichtstrahlen bündeln und durch den Tubus zum Okular leiten.

Mithilfe des Grob- und Feintriebs wird der Abstand zwischen Objektträger und Objektiv verändert, sodass die Schärfe des entstehenden Bildes eingestellt werden kann.

Funktion des Lichtmikroskops

Um die Funktionsweise eines Mikroskops erklären zu können, sind vor allem zwei seiner Bestandteile wichtig: das Objektiv und das Okular.

Über die Blende wird das Licht genau auf die Probe fokussiert. Das darüberliegende Objektiv wirkt wie eine Sammellinse und führt die Strahlen weiter zusammen. Allerdings sind die Strahlen nach dem Objektiv nicht parallel zueinander, sondern wandern immer noch ein wenig auseinander. Genug, um eine Vergrößerung zu erzeugen, aber trotzdem so subtil, dass die Lichtstrahlen den langen Weg durch den Tubus nehmen können, ohne an die Wand zu geraten.

Wenn die Lichtstrahlen im Okular ankommen, sind sie viel weiter aufgespalten, als sie es noch bei der Probe waren. Das Bild, das dadurch entsteht, wird auch als reelles Zwischenbild bezeichnet – ein Bild, das zwar noch nicht zu sehen ist, aber in Form von Lichtstrahlen schon vorhanden ist. Das Okular bündelt die Lichtstrahlen zusammen, sodass sie vom Auge aufgenommen werden können. Der Winkel, in dem die Lichtstrahlen ins Auge fallen, sind dann der Grund für den vergrößerten Effekt, mit dem das Bild wahrgenommen wird. Was man sieht, ist das virtuelle Zwischenbild – die Strahlen treffen nicht in dieser Größe aufs Auge, es wird durch den Einfallwinkel aber eine vergrößerte Version des Bildes auf die Netzhaut projiziert.

Elektronenmikroskopie

Anstelle von Lichtstrahlen nutzt das Elektronenmikroskop einen Elektronenstrahl, um das Präparat abzubilden. Da sich Elektronen rasant bewegen und eine kurze Wellenlänge haben, sind Elektronenmikroskope dazu fähig, Bilder mit höherer Auflösung zu generieren als Lichtmikroskope. Außerdem können sie dadurch winzige Strukturen abbilden.

Aufbau und Funktion des Elektronenmikroskops

Im Unterschied zu Lichtmikroskopen wird hierbei eine Elektronenquelle genutzt. Ein Elektronenmikroskop ist ein geschlossenes System, in dem ein Vakuum erzeugt wird, um die Elektronen nicht in ihrer Flugbahn zu stören. Der im Folgenden beschriebene Aufbau entspricht einem Transmissionselektronenmikroskop.

Das Elektronenmikroskop beschießt das Präparat mit Elektronen, die daraufhin verschiedene Signale abgeben können. Je nachdem, was für ein Elektronenmikroskop verwendet wird, entstehen dabei verschiedene Arten von Strahlungen, die als Signale aufgenommen und interpretiert werden können. Anders als im Lichtmikroskop nimmt der Betrachter dabei nicht direkt das Licht auf, das von der Probe reflektiert wird. Die detektierten Signale werden zunächst umgewandelt, bevor sie vom Betrachter – meist auf einem Computerbildschirm – als Bild wahrgenommen werden können.

Methoden der Zellbiologie: Methoden der Färbung

Um Zellen und Gewebestrukturen deutlich zu erkennen, nachzuweisen oder voneinander abzugrenzen, können Färbungen genutzt werden. Die genutzten Farbstoffe dringen nur in bestimmte Strukturen der Zelle ein – sind also selektiv – und markieren dadurch ihre Positionen. Auf diese Weise können diese Strukturen von anderen, nicht eingefärbten Zellbestandteilen unterschieden werden.

Funktionsweise einer Färbung

Farbstoffe setzen sich in gewünschten Zellstrukturen fest und interagieren mit Licht, sodass beim Betrachter der Eindruck einer Färbung entsteht. Normales Tageslicht wird auch als weißes Licht bezeichnet und enthält alle Wellenlängen des sichtbaren Farbspektrums. Farbstoffe können manche der im weißen Licht enthaltenen Wellenlängen absorbieren und andere zurückwerfen (reflektieren). Wenn eine eingefärbte Probe daher mit weißem Licht bestrahlt wird, entsteht der Eindruck, dass die betroffenen Strukturen mit einer bestimmten Farbe markiert sind.

Markierung durch Farbstoffe

Je nachdem, welche Strukturen eingefärbt werden sollen, können unterschiedliche Farbstoffe verwendet werden. Farbstoffe sind meist Moleküle, die bei einem bestimmten pH-Wert ihrer Umgebung dissoziieren können.

Da jeder Farbstoff durch seinen atomaren Aufbau unterschiedliche Eigenschaften besitzt, können sich verschiedene Farbstoffe unterschiedlich gut durch die Kompartimente der Zelle bewegen und in einem davon dissoziieren. Die entstehenden Ionen setzen sich durch ihren geladenen Zustand an einer bestimmten Zellstruktur fest und markieren diese. Je nachdem welche Farbstoffe genutzt werden, können die Strukturen dann mit unterschiedlichen Arten von Mikroskopen sichtbar gemacht werden.

Arten von Farbstoffen

Farbstoffe können je nach Herkunft und Funktionsweise in verschiedene Arten unterteilt werden:

1. Primärfarbstoffe/ natürliche Farbstoffe: Diese Farbstoffe sind natürlicherweise in der Zelle enthalten; dazu zählen beispielsweise Hämoglobin, das dem Blut seine rote Farbe verleiht oder Chlorophyll, das die Blätter grün erscheinen lässt.
2. Sekundärfarbstoffe: Sekundäre Farbstoffe werden dem Objekt erst durch eine künstliche Färbung zugeführt. Es kommen oft natürliche Farbstoffe zum Einsatz, aber auch synthetisch hergestellte Farbstoffe können verwendet werden.
3. Vitalfarbstoffe: Farbstoffe, die für Strukturen lebender Zellen verwendet werden.
4. Fluoreszenz-Farbstoffe (Fluorochrome): Farbstoffe, die einfallendes Licht absorbieren und die Energie durch Fluoreszenz wieder ausstrahlen. Es wird ein Leuchteffekt erzielt.

Fluoreszenz-Farbstoffe

Fluoreszenzmikroskope werden vor allem dann genutzt, wenn die zu lokalisierende Strukturen zu klein für ein konventionelles Lichtmikroskop sind oder wenn Interaktionen zwischen bestimmten Strukturen oder Proteinen untersucht werden sollen. Auch hierfür gibt es verschiedene Farbstoffe, die je nach Art des Experiments ausgewählt werden. Diese basieren vorwiegend darauf, wie die Fluorophore an ihren Zielstrukturen angebracht werden sollen.

Immunhistochemie

Eine der häufigsten Methoden zur Befestigung von Fluorophoren an Zellbestandteilen ist die Immunhistochemie. Dabei werden Antikörper verwendet, um Proteine oder Moleküle an bestimmte Strukturen zu binden.

Für diese Methode ist es allerdings notwendig, die Zelle zu fixieren und zu permeabilisieren. Die Probe wird daher zur Fixierung in ein Material eingebettet und die Zellwand durchlässig gemacht (permeabilisiert). Das ist nötig, damit die Antikörper überhaupt in die Zelle gelangen. Da Zellen mit einer zerstörten Zellwand lebensunfähig sind, ist diese Methode nicht geeignet, um lebende Zellen einzufärben.

Die folgende Abbildung zeigt einen mit verschiedenfarbigen Fluorochromen versetzten Rattendarm. Die einzelnen Zellen sind mit grün abgegrenzt, die Zellkerne erleuchten Cyanblau und eine besondere Zellsorte des Darms wurde Magenta markiert.

Abbildung 1: Fluoreszenzfärbung eines Rattendarms

Markierung lebender Zellen

Um lebende Zellen markieren zu können, werden andere Methoden genutzt. GFP (green fluorescent protein) ist ein fluoreszierendes Protein, dessen Gensequenz mithilfe gentechnischer Methoden in die DNA eines Organismus eingebracht werden kann. Wird diese Gensequenz an der richtigen Stelle eingebaut, kann der Organismus GFP selbst herstellen. Außerdem wird das GFP gemeinsam mit der Zielstruktur hergestellt, weshalb die beiden immer aneinander gekoppelt vorliegen.

Die lebenden Zellen können dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, wobei die Zielstrukturen genauestens lokalisiert werden können. Die Betrachtung der lebenden Zellen unter einem Mikroskop und der dabei entstehende Zeitraffer, der den Ablauf von Prozessen in der Zelle abbildet, wird auch als live-cell imaging bezeichnet.