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Doch wie hat man das herausgefunden? Dafür machten sich Forschende die sogenannte Biuret-Reaktion zu Nutze. Doch was ist das eigentlich?
Grundlagen der Biuret-Reaktion
Die Biuret-Reaktion ist eine quantitative chemische Nachweisreaktion. Das heißt, sie zeigt, wie groß die Menge des Stoffs ist, die in der Probe vorhanden ist (quantitativ von lateinisch quantitas für "Menge"). Die Menge ist bei chemischen Analysen auf die Stoffmengenkonzentration bezogen.
Die Nachweisreaktion wird auch als Biruet-Assay oder als Biuret-Test bezeichnet. Die Biuret-Reaktion gilt als Nachweisreaktion für das Moleküls Biuret und Proteine (=Eiweiße) in wässriger Lösung.
Das Biuretmolekül
Biuret ist eine organische Verbindung mit der Summenformel C2H5N3O2. Es handelt sich um ein Carbonsäureamid, das auch als Carbamoylharnstoff bezeichnet wird. Der Feststoff ist farblos, kristallin und wasserziehend (hygroskopisch).
Abbildung 1: Strukturformel von Biuret
Aufgrund des Amids innerhalb des Moleküls bildet sich in Gegenwart von Kupferionen ein blau-violetter Komplex.
Falls du wissen möchtest, was ein Amid ausmacht, findest du alles Wichtige im StudySmarter Original zu diesem Thema!
Das Wort Komplex kommt aus dem lateinischen (lat.: complexum) und bedeutet so viel wie umgeben oder umarmt. Komplexe besitzen ein Zentralteilchen (oder mehrere), das meist ein Metallion ist. Im Fall der Biuret-Reaktion ist das Zentralteilchen das Kupferion.
Das Zentralteilchen geht mit umliegenden Molekülen oder Atomen in Bindung, man nennt diese umliegenden Moleküle oder Atome Liganden. Dabei geben, anders als bei kovalenten Bindungen, die Liganden alle Elektronen für die Reaktion ab. Bei kovalenten Bindungen steuern beide Reaktionspartner, jeweils ein Elektron, zur Reaktion bei.
Die Bindung eines Komplexes wird als Komplexbindung, koordinative Bindung, oder als Metallkomplex (wenn das Zentralteilchen ein Metall ist) bezeichnet.
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Biuret-Reagenz herstellen
Erhitzt man Harnstoff (Harnsäure) über den Schmelzpunkt von etwa 133° Celsius, so entsteht ein Biuretmolekül unter Abspaltung eines Ammoniakmoleküls. Durch die Entstehung des Ammoniaks bildet sich ein stechender Geruch.
Abbildung 2: Reaktionsgleichung zur Herstellung von Biuret
Wie du an der Reaktionsgleichung siehst, reagieren zwei Harstoffmoleküle zu einem Biuretmolekül (und einem Ammoniakmolekül).
Nachweisprinzip der Biuret-Reaktion
Anders als der Namen vermuten lässt, benötigt man für die Biuret-Reaktion kein Biuret. Die Reaktion heißt so, weil sie für Biuret ein "positives" Ergebnis liefert. Nun sind die Aminosäuren von Peptiden und Proteinen über sogenannte Peptidbindungen verknüpft. Dabei handelt es sich um Sonderfälle der Amidbindung.
Demnach dient die Biuret-Reaktion eigentlich zum Nachweis von Amiden. Damit sich ein Komplex ausbilden kann, muss die zu untersuchende Substanz mindestens zwei Peptidbindungen enthalten. Als Biuret-Reagenz wird Kupfersulfat (CuSO4) verwendet. Dabei muss ein alkalisches Milieu vorherrschen.
Um einen pH-Wert der Lösung im alkalischen Bereich zu erhalten, wird Natronlauge zur untersuchenden Substanz (in wässriger Lösung vorliegend) gegeben.
Enthält die zu testende Lösung weder Peptide/Proteine noch Biuret, so fällt schwerlösliches Kupferhydroxid aus. Sind jedoch Peptid- bzw. Amidbindungen vorhanden, so bilden diese mit den Kupferionen (Cu2+) der Kupfersulfatlösung einen Komplex, wodurch sich die Lösung blau-violett (teilweise auch rötlich) färbt.
Abbildung 3: Der bei der Biuret-Reaktion entstandene Komplex, der für die violette Färbung der Lösung verantwortlich ist
Prüft man eine Substanz wie bspw. Eiklar auf Peptidbindungen, so kann man den Versuch auch zusätzlich mit Biuret durchführen. Dadurch erhält man eine Kontrolllösung mit definierter Konzentration anhand derer die Farbintensität verglichen werden kann.
Abbildung 4: Biuret-Reaktion auf zwei Probelösungen angewandt
In diesem Beispielversuch untersuchst du zwei Stoffe auf Peptidbindungen. In Lösung 1 (links) liegt der erste Stoff in wässriger Lösung vor, in Lösung 2 (rechts) der zweite. Zum Vergleich verfügst du über eine Biuret-Lösung.
Nach der Hinzugabe von Natronlauge und der blauen Kupfersulfatlösung haben alle Lösungen eine leicht blaue Farbe. Nach kräftigem Schütteln entsteht in Lösung 2 und in der Kontrolllösung eine blau-violette Färbung, während in Lösung 1 immer noch die hellblaue Färbung durch die Kupfersulfatlösung zu sehen ist.
Das heißt, in Lösung 1 sind keine Peptidbindungen enthalten. In der zu untersuchenden Substanz der Lösung 2 hingegen befinden sich Peptidbindungen, die durch die blau-violette Färbung nachgewiesen werden konnten. Die Kontrolllösung, in der Biuret zugegeben wurde, hat sich ebenfalls blau-violett verfärbt.
Da die Bildung der farbigen Komplexe proportional zu der Ausgangskonzentration an Proteinen ist, kann mithilfe eines Photometers die Farbintensität gemessen werden. Mithilfe der Farbintensität kann man die Konzentration der Peptidbindungen berechnen. Daher ist die Biuret-Reaktion eine quantitative Nachweismethode.
Spezifität der Biuret-Reaktion
Die Empfindlichkeit der Reaktion ist gering, sodass für die Bestimmung ca. 1 – 10 mg Protein benötigt werden, damit sich eine Farbveränderung zeigt. Dafür besitzt die Biuret-Reaktion eine hohe Spezifität. Neben Proteinen bilden sich nur bei Peptiden auch farbige Komplexe.
Achtung, jedoch bei Anwesenheit von Ammoniumionen. Diese bilden mit Kupferionen tiefblau gefärbte Kupfer-Tetramin-Komplexe.
Biuret-Reaktion - Das Wichtigste
- Die Biuret-Reaktion ist eine quantitative chemische Nachweisreaktion.
- Sie gilt als Nachweisreaktion für Biuret und Proteine (Peptidbindungen).
- Sind genug Peptidbindungen in der zu untersuchenden Substanz vorhanden, so bildet sich bei der Biuret-Reaktion ein blau-violett farbiger Komplex.
- Mithilfe eines Photometers kann man die Konzentration der Peptidbindungen bestimmen.
- Die Empfindlichkeit der Nachweisreaktion ist gering, während ihre Spezifität hoch ist.
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Häufig gestellte Fragen zum Thema Biuret-Reaktion
Wie weißt man Eiweise nach?
Mithilfe der Biuret-Reaktion kann man Eiweiße nachweisen. Bei der Biuret-Reaktion entsteht ein blau-violetter Komplex, der die Lösung verfärbt. Mithilfe eines Photometers kann man die Farbintensität bestimmen und somit die Konzentration der Peptidbindungen der Eiweiße berechnen.
Wie funktioniert die Biuret-Probe?
Bei der Biuret-Probe geht man folgendermaßen vor:
Man gibt zu der in wässriger Lösung vorliegenden Substanz Natronlauge, um eine alkalische Lösung zu erhalten. Nach der Zugabe von Kupfersulfat schüttelt man das Reagenzglas mit der Lösung gut. Verändert sich die Farbe der Lösung zu blau-violett, so liegen Peptidbindungen, also Eiweiße, in der Substanz vor.
Was kann man mit der Biuret-Reaktion nachweisen?
Mit der Biuret-Reaktion kann man Peptidbindungen nachweisen. Das heißt neben Proteinen können auch Peptide nachgewiesen werden. Außerdem zeigt die Biuret-Reaktion auch beim Biuretmolekül ein positives Ergebnis. Dies besitzt zwar keine Peptidbindungen, sondern Amidbindungen, ist aber ähnlich aufgebaut, sodass es auch einen violettfarbigen Komplex mit Kupferionen bildet.
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