Enzyme Engineering (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Cheatsheet.pdf

Definition und Klassifikation von Enzymen

Definition:

Enzyme sind Biomoleküle, die als Katalysatoren chemische Reaktionen beschleunigen. Klassifikation: basierend auf der katalysierten Reaktion.

Details:

• Oxidoreduktasen: katalysieren Redoxreaktionen.
• Transferasen: übertragen funktionelle Gruppen.
• Hydrolasen: katalysieren Hydrolasenreaktionen.
• Lyasen: spalten chemische Bindungen ohne Hydrolyse oder Oxidation.
• Isomerasen: katalysieren Isomerisierungsreaktionen.
• Ligasen: verknüpfen zwei Moleküle unter ATP-Verbrauch.

Michaelis-Menten-Gleichung und Enzymkinetik

Definition:

Beschreibt die Beziehung zwischen der Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion und der Substratkonzentration.

Details:

• Michaelis-Menten-Gleichung: \[ v = \frac{{V_{max} [S]}}{{K_m + [S]}} \]
• Wichtige Parameter:
  • v: Reaktionsgeschwindigkeit
  • V_max: maximale Reaktionsgeschwindigkeit
  • K_m: Michaelis-Konstante, Substratkonzentration bei halbem V_max
  • [S]: Substratkonzentration
• Unterscheidung zwischen Katalyse und Bindung
• Linweaver-Burk-Diagramm zur linearen Darstellung: \[ \frac{1}{v} = \frac{K_m}{{V_{max} [S]}} + \frac{1}{V_{max}} \]

Spektroskopische Methoden zur Enzymanalyse

Definition:

Verwendung von Spektroskopie zur Untersuchung der Struktur und Funktion von Enzymen.

Details:

• UV/Vis-Spektroskopie: Analyse von Enzymaktivität durch Untersuchung der Absorption bei spezifischen Wellenlängen.
• Fluoreszenzspektroskopie: Untersuchung von Konformationsänderungen und Bindungsereignissen mittels Fluoreszenzsignalen.
• Kreis-Dichroismus (CD): Bestimmung der Sekundärstruktur von Enzymen.
• NMR-Spektroskopie: Gebräuchlich für die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Enzymen in Lösung.
• IR-Spektroskopie: Untersuchung von funktionellen Gruppen und Bindungsverhältnissen in Enzymen.

Arten und Mechanismen der Enzyminhibition

Definition:

Arten und Mechanismen der Enzyminhibition beziehen sich auf die verschiedenen Typen und Prozesse, durch die die Aktivität von Enzymen verringert oder gestoppt wird.

Details:

• Kompetitive Hemmung: Inhibitor konkurriert mit Substrat um aktives Zentrum
• Unkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet nur an Enzym-Substrat-Komplex
• Nicht-kompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an andere Stelle als das aktive Zentrum
• Irreversible Hemmung: Inhibitor bindet kovalent an Enzym und deaktiviert es dauerhaft
• Allosterische Hemmung: Inhibitor bindet an allosterisches Zentrum und verändert die Konformation des Enzyms
• Kompetitive Hemmung: . K_i .
Frequenz der Collisions zwischen Inhibitor und Enzym erhöht, Katalyse wird unterbrochen: V_MAX unverändert, K_M erhöht
• Unkompetitive Hemmung: . K_i _{i .K unnachgiebig}
• Nicht-kompetitive Hemmung: Ki ohne Änderung.
÷K _{i.k]=%K-Metaboliten oder Produktausnahme eines Kolleres.. M}

Gentechnologische Ansätze: Mutagenese und gerichtete Evolution

Definition:

Gentechnologische Ansätze zur Erzeugung genetischer Vielfalt und Optimierung von Enzymen durch gezielte oder zufällige Modifikation der DNA.

Details:

• Mutagenese: Erzeugung von Punktmutationen durch chemische, physikalische oder biologische Methoden.
• Gerichtete Evolution: Iterativer Prozess von Mutagenese und Selektion zur Optimierung von Enzymeigenschaften.
• Erhöhung der Mutationsrate mittels Error-prone PCR oder Zufallsinsertionsverfahren.
• Selektion der Varianten basierend auf gewünschte Merkmale.
• Rekombination vorteilhafter Mutationen durch DNA-Shuffling.
• Anwendung: Verbesserung der katalytischen Eigenschaften, Stabilität oder Spezifität von Enzymen.

Rekombinante Enzymproduktion

Definition:

Prozess der Herstellung von Enzymen unter Nutzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen.

Details:

• Expression von Enzymen in Wirtsorganismen (z. B. E. coli, Hefe)
• Verwendung von Expressionsvektoren mit Promotoren
• Optimierung der Genkodierung für die Wirtsspezies
• Induktion der Proteinexpression unter kontrollierten Bedingungen
• Reinigung des rekombinanten Enzyms z. B. durch Affinitätschromatografie
• Anwendung in Forschung, Industrie und Medizin

Regulatorische Enzyme und allosterische Kontrolle

Definition:

Regulatorische Enzyme sind Enzyme, deren Aktivität durch Interaktion mit spezifischen Molekülen moduliert werden kann, häufig im Kontext von Stoffwechselwegen.

Details:

• Allosterische Kontrolle: Regulierung von Enzymaktivität durch Bindung von Effektormolekülen an eine Stelle, die nicht das aktive Zentrum ist.
• Allosterische Stellen: Spezifische Bindungstaschen auf dem Enzym, getrennt vom aktiven Zentrum.
• Allosterische Effektoren können inhibitorisch oder aktivierend wirken.
• Homoallosterische Effekte: Effektormolekül ist das Substrat selbst.
• Heteroallosterische Effekte: Effektormolekül ist nicht das Substrat.
• Allosterische Enzyme zeigen häufig sigmoide Kinetik, anstelle der Michaelis-Menten-Kinetik.
• Typisches Beispiel: Phosphofruktokinase in der Glykolyse.

Industrielle Anwendungen: Optimierung von Biokatalysatoren

Definition:

Optimierung von Biokatalysatoren zur Steigerung der Effizienz und Wirtschaftlichkeit industrieller Prozesse.

Details:

• Gezielte Mutagenese zur Verbesserung der Enzymaktivität
• Richtungsweisende Evolution zur Steigerung der Stabilität und Katalyse-Effizienz
• Codon-Optimierung für höhere Expression in Produktionsorganismen
• Erstellung von Fusionsproteinen zur Erhöhung der Löslichkeit
• Immobilisierung von Enzymen zur Wiederverwendung und Prozesskontrolle
• Anpassung an spezifische Prozessbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Substratspezifität)