Enzyme Engineering (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Du bist Biochemie-Student an der Technischen Universität München und bereitest Dich auf Deine 'Enzyme Engineering' Prüfung vor. Stell Dir vor, Du bearbeitest folgende Aufgabe zur Definition und Klassifikation von Enzymen:

a)

• Stelle das Reaktionsschema einer Redoxreaktion dar. Nenne ein Beispiel für eine Oxidoreduktase und beschreibe kurz deren biochemische Rolle.
• Betrachte die Enzymklasse der Transferasen. Formuliere eine Reaktionsgleichung für eine typische Transferasereaktion, identifiziere das übertragene Molekül in deinem Beispiel und erläutere deren Bedeutung in der Zelle.

Lösung:

Du bist Biochemie-Student an der Technischen Universität München und bereitest Dich auf Deine 'Enzyme Engineering' Prüfung vor. Stell Dir vor, Du bearbeitest folgende Aufgabe zur Definition und Klassifikation von Enzymen:

• Stelle das Reaktionsschema einer Redoxreaktion dar. Nenne ein Beispiel für eine Oxidoreduktase und beschreibe kurz deren biochemische Rolle. Eine Redoxreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der Elektronen zwischen Molekülen übertragen werden. Ein allgemeines Reaktionsschema einer Redoxreaktion sieht wie folgt aus:
  • Oxidation: Ein Molekül verliert Elektronen
  • Reduktion: Ein anderes Molekül gewinnt diese Elektronen

    Reduktionsmittel (donates e-) + Oxidationsmittel (accepts e-) -> oxidiertes Reduktionsmittel + reduziertes Oxidationsmittel   

  Als Beispiel für eine Oxidoreduktase dient die Cytochrom-c-Reduktase (auch bekannt als Komplex III der Atmungskette). Diese Enzyme sind entscheidend für die Produktion von ATP in den Mitochondrien. Sie katalysieren die Übertragung von Elektronen von Cytochrom c auf Sauerstoffmoleküle, was zur Bildung von Wasser führt.
• Betrachte die Enzymklasse der Transferasen. Formuliere eine Reaktionsgleichung für eine typische Transferasereaktion, identifiziere das übertragene Molekül in deinem Beispiel und erläutere deren Bedeutung in der Zelle. Transferasen sind Enzyme, die die Übertragung einer funktionellen Gruppe von einem Molekül (Donor) auf ein anderes Molekül (Akzeptor) katalysieren. Ein typisches Beispiel ist die Hexokinase, die eine Phosphotransferase ist. Die Reaktionsgleichung sieht folgendermaßen aus:

    Glucose + ATP -> Glucose-6-Phosphat + ADP  

  In diesem Beispiel wird die Phosphatgruppe (das übertragene Molekül) vom ATP (Donor) auf die Glucose (Akzeptor) übertragen. Diese Phosphorylierung der Glucose ist ein entscheidender Schritt in der Glykolyse, einem zentralen Stoffwechselweg, durch den Zellen Energie in Form von ATP gewinnen. Transferasen spielen eine Schlüsselrolle in verschiedenen zellulären Prozessen, darunter Signaltransduktion, Metabolismus und Genexpression.

Aufgabe 2)

Du hast ein Enzym, das die folgende Michaelis-Menten-Gleichung befolgt:

• Michaelis-Menten-Gleichung:
  • Important Parameters:
    • v: Reaktionsgeschwindigkeit
    • V_max: maximale Reaktionsgeschwindigkeit
    • K_m: Michaelis-Konstante
    • [S]: Substratkonzentration
  • Unterscheidung zwischen Katalyse und Bindung
  • Linweaver-Burk-Diagramm zur linearen Darstellung:

a)

Gegeben seien die folgenden Werte: V_max = 100 µmol/min und K_m = 5 mM. Berechne die Reaktionsgeschwindigkeit v bei einer Substratkonzentration von 10 mM.

Lösung:

Um die Reaktionsgeschwindigkeit v zu berechnen, können wir die Michaelis-Menten-Gleichung verwenden:

• Michaelis-Menten-Gleichung:

\[v = \frac{V_{max} [S]}{K_m + [S]}\]

Gegeben sind:

• V_max = 100 µmol/min
• K_m = 5 mM
• [S] = 10 mM

Wir setzen die Werte in die Gleichung ein:

\[v = \frac{100 \, \text{µmol/min} \times 10 \, \text{mM}}{5 \, \text{mM} + 10 \, \text{mM}}\]

Das vereinfacht sich zu:

\[v = \frac{1000 \, \text{µmol/min}}{15 \, \text{mM}}\]

\[v = 66.67 \, \text{µmol/min}\]

Also beträgt die Reaktionsgeschwindigkeit v bei einer Substratkonzentration von 10 mM etwa 66.67 µmol/min.

b)

Zeichne das entsprechende Lineweaver-Burk-Diagramm unter Verwendung der angegebenen Werte. Stelle sicher, dass Du beide Achsen korrekt beschriftest.

Lösung:

Um ein Lineweaver-Burk-Diagramm zu zeichnen, müssen wir die Doppelreziproke der Michaelis-Menten-Gleichung verwenden und die Daten darauf basieren.

Die Lineweaver-Burk-Gleichung ist wie folgt definiert:

• Lineweaver-Burk-Gleichung:

\[\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{max} [S]} + \frac{1}{V_{max}}\]

Gegeben sind die Werte:

• V_max = 100 µmol/min
• K_m = 5 mM

Um das Diagramm zu zeichnen, folgen wir diesen Schritten:

• Erstellen einer Tabelle mit Werten für [S] und der dazugehörigen Reaktionsgeschwindigkeit v:

Mit diesen Werten können wir das Lineweaver-Burk-Diagramm zeichnen, wobei:

• die x-Achse als \(\frac{1}{[S]}\) (in mM^-1) beschriftet wird und
• die y-Achse als \(\frac{1}{v}\) (in min/µmol) beschriftet wird.

Hier ist eine schematische Darstellung des Lineweaver-Burk-Diagramms:

# Lineweaver-Burk Diagrammmin/µmol||                                 *|                      *       *(50 mM^-1, 0.011)|        *     *(20 mM^-1, 0.0111)   |   * (10 mM^-1, 0.015)   | *(5 mM^-1, 0.02)* (2 mM^-1, 0.035)|_________________________________________________           0.02   0.04   0.06   0.08   0.10  mM^-1  

Achte darauf, dass Punkte auf der Linie für verschiedene Substratkonzentrationen eingetragen sind.

c)

Erkläre, wie Du durch die Analyse des Lineweaver-Burk-Diagramms Schlüsselfaktoren wie K_m und V_max identifizieren kannst.

Lösung:

Das Lineweaver-Burk-Diagramm ist ein wichtiges Werkzeug zur Analyse und Bestimmung der kinetischen Parameter K_m und V_max eines Enzyms. Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Erklärung, wie Du diese Schlüsselfaktoren aus einem Lineweaver-Burk-Diagramm identifizieren kannst:

1. Lineweaver-Burk-Gleichung:

Die Lineweaver-Burk-Gleichung lautet:

\[\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{max} [S]} + \frac{1}{V_{max}}\]

Diese Gleichung hat die Form einer linearen Gleichung \(y = mx + b\), wobei:

• \(\frac{1}{v}\) der y-Wert ist
• \(\frac{1}{[S]}\) der x-Wert ist
• \(\frac{K_{m}}{V_{max}}\) die Steigung (m) ist
• \(\frac{1}{V_{max}}\) der y-Achsenabschnitt (b) ist

2. Identifikation von V_max:

• Bestimme den y-Achsenabschnitt (dort, wo die Linie die y-Achse schneidet) im Diagramm. Dieser Punkt entspricht \(\frac{1}{V_{max}}\).
• Berechne V_max als den Kehrwert dieses Wertes:

\[V_{max} = \frac{1}{y-Achsenabschnitt}\]

3. Identifikation von K_m:

• Die Steigung der Linie im Lineweaver-Burk-Diagramm entspricht dem Wert \(\frac{K_{m}}{V_{max}}\).
• Um K_m zu berechnen, multipliziere die Steigung mit V_max:

\[K_{m} = \text{Steigung} \times V_{max}\]

Beispiel:

Angenommen, Du hast ein Lineweaver-Burk-Diagramm mit den folgenden Angaben:

• Der y-Achsenabschnitt ist 0.01 min/µmol.
• Die Steigung der Linie ist 0.05 min/µmol.

Berechnung von V_max:

\[V_{max} = \frac{1}{0.01 \text{ min/µmol}} = 100 \text{ µmol/min}\]

Berechnung von K_m:

\[K_{m} = \text{Steigung} \times V_{max} = 0.05 \text{ min/µmol} \times 100 \text{ µmol/min} = 5 \text{ mM}\]

Durch die Analyse des Lineweaver-Burk-Diagramms kannst Du somit die Schlüsselfaktoren K_m und V_max bestimmen, was für das Verständnis der Enzymkinetik unerlässlich ist.

d)

Angenommen, es gibt ein Inhibitormolekül, das die Bindungsaffinität des Enzyms für das Substrat reduziert, ohne jedoch die maximale Reaktionsrate zu verändern. Beschreibe, welchen Einfluss dies auf die Michaelis-Menten-Kurve und das Lineweaver-Burk-Diagramm haben könnte.

Lösung:

Wenn ein Inhibitormolekül die Bindungsaffinität des Enzyms für das Substrat reduziert, ohne die maximale Reaktionsrate (V_max) zu verändern, spricht man von einem kompetitiven Inhibitor. Im Folgenden wird beschrieben, welchen Einfluss dies auf die Michaelis-Menten-Kurve und das Lineweaver-Burk-Diagramm hat:

• Einfluss auf die Michaelis-Menten-Kurve:

Ein kompetitiver Inhibitor führt zu einer Erhöhung der Michaelis-Konstanten (K_m), weil mehr Substrat benötigt wird, um dieselbe Halbmaximal-Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen. Dies liegt daran, dass der Inhibitor mit dem Substrat um die Bindungsstelle des Enzyms konkurriert. V_max bleibt jedoch unverändert, da bei sehr hoher Substratkonzentration das Enzym immer noch gesättigt werden kann, und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht wird.

Formel für kompetitive Inhibition:

\[v = \frac{V_{max} [S]}{K_m (1 + \frac{[I]}{K_I}) + [S]}\]

Dabei ist:

• [I]: Konzentration des Inhibitors
• K_I: Inhibitionskonstante

• Einfluss auf das Lineweaver-Burk-Diagramm:

Im Lineweaver-Burk-Diagramm zeigt sich die kompetitive Inhibition durch eine Erhöhung der Steigung (Änderung des Terms K_m/V_max), während sich der y-Achsenabschnitt (\(1/V_{max}\)) nicht verändert. Das bedeutet, dass sich die Gerade im Diagramm nach oben dreht, wobei der Schnittpunkt auf der y-Achse gleich bleibt.

Reziproke Form:

\[\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \left(1 + \frac{[I]}{K_I}\right) \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\]

Änderung im Lineweaver-Burk-Diagramm:

• Die Steigung der Linie (\(K_m/V_{max}\)) steigt an.
• Der y-Achsenabschnitt (\(1/V_{max}\)) bleibt unverändert.

Zusammengefasst:

• In der Michaelis-Menten-Kurve verschiebt sich die Kurve nach rechts, da eine höhere Substratkonzentration erforderlich ist, um dieselbe Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen.
• Im Lineweaver-Burk-Diagramm drehen sich die Linien um den y-Achsenabschnitt nach oben, was zu einer steileren Steigung führt.

In einem kompetitiven Inhibitionsszenario kannst Du die Effekte durch die Analyse dieser Diagramme und den Vergleich der Linien/ Kurven vor und nach der Zugabe des Inhibitors erkennen.

Aufgabe 3)

In einem Experiment sollen verschiedene spektroskopische Methoden genutzt werden, um die Struktur und Funktion eines neuen Enzyms zu untersuchen. Das Enzym zeigt eine Absorption im UV-Bereich bei 280 nm und kann durch ein bekanntes Substrat fluoreszenteigenschaften bei 340 nm induzieren. Weiterhin soll die Sekundärstruktur des Enzyms bestimmt werden sowie mögliche Konformationsänderungen bei der Substratbindung analysiert werden.

a)

1. Erkläre, wie die UV/Vis-Spektroskopie verwendet werden kann, um die Enzymaktivität zu analysieren. Welche Informationen erhältst Du bei einer Messung der Absorption bei 280 nm? Erstelle eine typische Absorptionskurve und erläutere die relevanten Höhenpunkte.

Lösung:

Erklärung zur Verwendung der UV/Vis-Spektroskopie zur Analyse der Enzymaktivität

• UV/Vis-Spektroskopie: Diese Methode wird verwendet, um die Absorptionsspektren von Molekülen zu messen. Sie basiert darauf, dass Moleküle spezifische Wellenlängen des Lichts absorbieren und somit Informationen über ihre Struktur und Konzentration liefern können.
• Absorption bei 280 nm: Das Enzym zeigt eine Absorption bei 280 nm, was hauptsächlich auf die Anwesenheit von aromatischen Aminosäureresten wie Tryptophan und Tyrosin zurückzuführen ist. Diese Reste haben spezifische Absorptionsmaxima im UV-Bereich und können zur Überwachung der Proteinquantität und -qualität verwendet werden.

Typische Absorptionskurve und Erklärung der relevanten Punkte

• Ordinate (y-Achse): Die Absorptionsintensität (Absorption) wird meist in Einheiten der Absorptionsbanden (OD - optische Dichte) angegeben.
• Abszisse (x-Achse): Die Wellenlänge des Lichts in Nanometer (nm).
• Absorptionsmaximum bei 280 nm: Dieses Maximum zeigt die Absorption der aromatischen Aminosäuren im Enzym an. Ein hoher Wert deutet auf eine hohe Konzentration oder Anwesenheit dieser Reste hin.
• Weitere Peaks: Falls vorhanden, können diese auf Verunreinigungen oder andere Moleküle hinweisen, die in der Probe vorhanden sind.

Im Folgenden ist eine typische Absorptionskurve dargestellt:

Diese Kurve zeigt das typische Absorptionsverhalten von Proteinen im UV-Bereich. Der höchste Punkt bei 280 nm (Peak) korrespondiert mit der Absorption der aromatischen Aminosäuren (Tryptophan, Tyrosin). Ein steiler Anstieg der Kurve bis zum Maximum weist auf eine hohe Konzentration dieser Reste hin.

Zusammenfassend liefert die UV/Vis-Spektroskopie bei einer Messung der Absorption bei 280 nm wertvolle Informationen über die Konzentration und Anwesenheit spezifischer Aminosäurereste im Enzym. Diese Daten sind entscheidend zur Beurteilung der Proteinqualität und -quantität sowie zur Analyse der Enzymaktivität.

b)

2. Du möchtest die Konformationsänderungen des Enzyms bei der Bindung des Substrates analysieren. Beschreibe, wie Du dabei die Fluoreszenzspektroskopie einsetzt. Was erwartet man bei der Bindung des Substrates bei 340 nm zu sehen? Erstelle eine hypothetische Fluoreszenzspektroskopie-Plot von Signalintensität gegen Wellenlänge und erläutere die Interpretation der Daten.

Lösung:

Verwendung der Fluoreszenzspektroskopie zur Analyse der Konformationsänderungen des Enzyms bei der Bindung des Substrates

• Fluoreszenzspektroskopie: Eine Methode, die auf der Emission von Licht durch ein Molekül nach Absorption von Photonen basiert. Nach der Anregung durch Licht einer bestimmten Wellenlänge emittiert das Molekül Licht einer längeren Wellenlänge, was gemessen werden kann.
• Fluoreszenz bei 340 nm: Das Enzym zeigt nach Bindung des bekannten Substrates eine Fluoreszenzemission bei etwa 340 nm. Diese Emission kann verwendet werden, um die Bindung direkt zu beobachten und darauf basierende Konformationsänderungen zu analysieren.

Erwartetes Verhalten bei Bindung des Substrates bei 340 nm: Bei der Bindung des Substrates an das Enzym erwartet man eine Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei 340 nm. Dies liegt daran, dass durch die Bindung des Substrates die Fluoreszenzeigenschaften des Enzyms aktiviert oder verstärkt werden.

Im Folgenden ist ein hypothetischer Plot der Fluoreszenzspektroskopie dargestellt:

• Ordinate (y-Achse): Signalintensität der Fluoreszenz
• Abszisse (x-Achse): Wellenlänge (nm)
• Peak bei 340 nm: Ein starker Anstieg der Signalintensität bei 340 nm zeigt die Fluoreszenzemission infolge der Substratbindung an. Je nach Konformationsänderungen und der Affinität des Substrates kann die Intensität variieren.

Interpretation der Daten:

• Ein deutlicher Peak bei 340 nm weist darauf hin, dass das Substrat erfolgreich an das Enzym gebunden hat und eine Konformationsänderung verursacht hat, welche die Fluoreszenzeigenschaften aktiviert.
• Die Höhe und Form des Peaks können Aufschluss über die Stärke der Bindung und die Ausmaß der Konformationsänderung geben.
• Vergleich der Fluoreszenzspektren vor und nach Zugabe des Substrates ermöglicht die Analyse der spezifischen Veränderungen und bietet wertvolle Informationen über die Funktion und Struktur des Enzyms.

Zusammenfassend ermöglicht die Fluoreszenzspektroskopie eine detaillierte Untersuchung der Konformationsänderungen des Enzyms bei der Bindung des Substrates, indem sie die Veränderungen in der Fluoreszenzemission bei 340 nm analysiert.

Aufgabe 4)

Arten und Mechanismen der Enzyminhibition

Arten und Mechanismen der Enzyminhibition beziehen sich auf die verschiedenen Typen und Prozesse, durch die die Aktivität von Enzymen verringert oder gestoppt wird:

• Kompetitive Hemmung: Inhibitor konkurriert mit Substrat um aktives Zentrum
• Unkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet nur an Enzym-Substrat-Komplex
• Nicht-kompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an andere Stelle als das aktive Zentrum
• Irreversible Hemmung: Inhibitor bindet kovalent an Enzym und deaktiviert es dauerhaft
• Allosterische Hemmung: Inhibitor bindet an allosterisches Zentrum und verändert die Konformation des Enzyms

a)

Du hast ein Enzym, das durch ein Substrat S eine Reaktion katalysiert. Die Michaelis-Menten-Konstante (K_M) für das Substrat beträgt 5 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX) beträgt 10 µM/min. Nun wird ein kompetitiver Inhibitor hinzugefügt. Beschreibe die Auswirkungen auf K_M und V_MAX unter Anwesenheit des Inhibitors. Wie könntest Du die Michaelis-Menten-Gleichung modifizieren, um die Kompetitive Hemmung zu berücksichtigen?

Hinweis: Der Kompetenzparameter wird als \textit{K_i} bezeichnet.

Lösung:

Unteraufgabe: Auswirkungen der kompetitiven Hemmung und Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung

Zu verstehen, wie ein kompetitiver Inhibitor die Reaktionskinetik beeinflusst, ist entscheidend, um biochemische Prozesse zu steuern und zu modifizieren. Im Folgenden wird der Einfluss auf die kinetischen Parameter und die notwendige Modifikation der Michaelis-Menten-Gleichung erläutert.

Auswirkungen von kompetitiver Hemmung auf K_M und V_MAX

• Michaelis-Menten-Konstante (K_M): Bei Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors erhöht sich die scheinbare Michaelis-Menten-Konstante. Das bedeutet, dass mehr Substrat benötigt wird, um die Hälfte der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen. Mathematisch wird dies durch die Beziehung K_M,app = K_M (1 + [I]/K_i) dargestellt, wobei [I] die Inhibitorkonzentration und K_i die Inhibitorkonstante ist.
• Maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX): Diese bleibt unverändert. Da der Inhibitor nur mit dem Substrat um das aktive Zentrum konkurriert und nicht die Anzahl der aktiven Enzymmoleküle beeinflusst, bleibt V_MAX gleich, aber es dauert länger (höhere Substratkonzentration), um diese Geschwindigkeit zu erreichen.

Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung

Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die kinetische Beziehung zwischen der Substratkonzentration ([S]) und der Reaktionsgeschwindigkeit (v) ohne Inhibitor. Sie lautet:

v = (V_MAX [S])/(K_M + [S])

Um die kompetitive Hemmung zu berücksichtigen, passen wir die Gleichung wie folgt an:

v = (V_MAX [S])/(K_M (1 + [I]/K_i) + [S])

Hierbei ist:

• [S]: Substratkonzentration
• [I]: Inhibitorkonzentration
• K_i: Inhibitorkonstante, die die Affinität des Inhibitors zum Enzym beschreibt
• K_M: Michaelis-Menten-Konstante ohne Inhibitor
• V_MAX: maximale Reaktionsgeschwindigkeit ohne Inhibitor

Mit dieser modifizierten Michaelis-Menten-Gleichung kannst Du die Effekte der kompetitiven Hemmung auf enzymatische Reaktionen analysieren und quantifizieren.

b)

In einem anderen Experiment wird das gleiche Enzym mit einem unkompetitiven Inhibitor behandelt. Die Konkurrenzkonstante (K_i) des Inhibitors beträgt 2 mM. Beschreibe die Auswirkungen dieser Inhibition auf die kinetischen Parameter K_M und V_MAX. Wie würde die Michaelis-Menten-Gleichung in diesem Fall aussehen?

Lösung:

Unteraufgabe: Auswirkungen der unkompetitiven Hemmung und Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung

Ein Verständnis der unkompetitiven Hemmung ist wichtig, um die verschiedenen Interaktionen zwischen Enzymen, Substraten und Inhibitoren in biochemischen Reaktionen zu analysieren. Im Folgenden wird beschrieben, wie sich ein unkompetitiver Inhibitor auf die kinetischen Parameter auswirkt und wie die Michaelis-Menten-Gleichung angepasst werden muss.

Auswirkungen der unkompetitiven Hemmung auf K_M und V_MAX

• Michaelis-Menten-Konstante (K_M): Bei unkompetitiver Hemmung bindet der Inhibitor nur an den Enzym-Substrat-Komplex. Dadurch wird die Affinität zwischen Enzym und Substrat scheinbar erhöht, was zu einer scheinbaren Verringerung von K_M führt. Dies lässt sich mit der folgenden Formel ausdrücken:

Formel für das scheinbare K_M:

\[ K_{M,app} = \frac{K_M}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} \]

• Maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX): Auch V_MAX verringert sich bei unkompetitiver Hemmung, da der Inhibitor die Gesamtzahl der aktiven Enzym-Komplexe reduziert, die am Umsatz beteiligt sind:

Formel für das scheinbare V_MAX:

\[ V_{MAX,app} = \frac{V_{MAX}}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} \]

Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung

Die Michaelis-Menten-Gleichung wird angepasst, um die Effekte der unkompetitiven Hemmung zu berücksichtigen. Die ursprüngliche Michaelis-Menten-Gleichung lautet:

\[ v = \frac{V_{MAX} [S]}{K_M + [S]} \]

Um die unkompetitive Hemmung zu berücksichtigen, ändern sich K_M und V_MAX gemäß den oben genannten Formeln. Die angepasste Michaelis-Menten-Gleichung lautet:

\[ v = \frac{V_{MAX} [S]}{K_{M,app} + [S]} \]

Indem wir K_{M,app} und V_{MAX,app} einsetzen, erhalten wir:

\[ v = \frac{\frac{V_{MAX}}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} [S]}{\frac{K_M}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} + [S]} \]

Nach Vereinfachung führt dies zu:

\[ v = \frac{V_{MAX} [S]}{\frac{K_M}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} + [S]} \]

Hierbei ist:

• [S]: Substratkonzentration
• [I]: Inhibitorkonzentration
• K_i: Inhibitorkonstante, die die Affinität des Inhibitors zum Enzym-Substrat-Komplex beschreibt
• K_M: Michaelis-Menten-Konstante ohne Inhibitor
• V_MAX: maximale Reaktionsgeschwindigkeit ohne Inhibitor

Mit dieser modifizierten Michaelis-Menten-Gleichung kannst Du die Effekte der unkompetitiven Hemmung auf enzymatische Reaktionen analysieren und quantifizieren.

c)

Erkläre, wie eine nicht-kompetitive Hemmung von einem Inhibitor verursacht wird und welche Auswirkungen dies auf die Enzymkinetik hat. Benutze sowohl die Michaelis-Menten-Gleichungen als auch spezifische kinetische Parameter, um diese Art der Hemmung zu analysieren.

Lösung:

Unteraufgabe: Nicht-kompetitive Hemmung und ihre Auswirkungen auf die Enzymkinetik

Die nicht-kompetitive Hemmung ist eine Form der Enzymhemmung, bei der der Inhibitor an einer anderen Stelle als das aktive Zentrum des Enzyms bindet. Dadurch wird die Enzymaktivität verringert, ohne dass der Inhibitor direkt mit dem Substrat um das aktive Zentrum konkurriert.

Mechanismus der nicht-kompetitiven Hemmung

Der nicht-kompetitive Inhibitor bindet an eine allosterische (andere) Stelle des Enzyms, unabhängig davon, ob das Substrat bereits an das Enzym gebunden ist oder nicht. Diese Bindung verursacht eine Konformationsänderung des Enzyms, die die katalytische Effizienz herabsetzt.

Auswirkungen auf die kinetischen Parameter

• Michaelis-Menten-Konstante (K_M): Die nicht-kompetitive Hemmung beeinflusst K_M in der Regel nicht, da der Inhibitor nicht an der Substratbindungsstelle ansetzt und somit die Affinität des Enzyms für das Substrat unverändert bleibt.
• Maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX): V_MAX wird allerdings verringert, da der Inhibitor die Anzahl der aktiven Enzymmoleküle reduziert. Dies bedeutet, dass weniger Enzymmoleküle für die Katalyse verfügbar sind, was die maximale Reaktionsgeschwindigkeit herabsetzt.

Die neuen, scheinbaren Werte für V_MAX und K_M sind:

• \( V_{MAX,app} = \frac{V_{MAX}}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} \)
• \( K_{M,app} = K_M \)

Anpassung der Michaelis-Menten-Gleichung

Die ursprüngliche Michaelis-Menten-Gleichung lautet:

\[ v = \frac{V_{MAX} [S]}{K_M + [S]} \]

Um die nicht-kompetitive Hemmung zu berücksichtigen, ändern sich K_M und V_MAX gemäß den oben genannten Formeln. Da K_M unverändert bleibt, lautet die angepasste Michaelis-Menten-Gleichung:

\[ v = \frac{\frac{V_{MAX}}{(1 + \frac{[I]}{K_i})} [S]}{K_M + [S]} \]

Nach weiterer Vereinfachung ergibt sich:

\[ v = \frac{V_{MAX} [S]}{(1 + \frac{[I]}{K_i}) (K_M + [S])} \]

Hierbei ist:

• [S]: Substratkonzentration
• [I]: Inhibitorkonzentration
• K_i: Inhibitorkonstante, die die Affinität des Inhibitors zum Enzym beschreibt
• K_M: Michaelis-Menten-Konstante ohne Inhibitor
• V_MAX: maximale Reaktionsgeschwindigkeit ohne Inhibitor

Fazit

Die nicht-kompetitive Hemmung führt zu einer Reduktion der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX), während die Michaelis-Menten-Konstante (K_M) unverändert bleibt. Dies liegt daran, dass der Inhibitor an einer separaten allosterischen Stelle des Enzyms bindet und die Funktion des aktiven Zentrums beeinträchtigt, ohne die Substratbindung direkt zu beeinflussen.

d)

Beschreibe, wie eine irreversible Hemmung im Vergleich zu einer allosterischen Hemmung funktioniert. Diskutiere die molekularen Mechanismen und die jeweiligen Auswirkungen auf die Enzymaktivität.

Lösung:

Unteraufgabe: Vergleich von irreversibler und allosterischer Hemmung

Die irreversible Hemmung und die allosterische Hemmung sind zwei verschiedene Mechanismen, durch die die Aktivität von Enzymen verringert oder gestoppt wird. Im Folgenden werden die molekularen Mechanismen und die jeweiligen Auswirkungen auf die Enzymaktivität beschrieben.

Irreversible Hemmung

Bei der irreversiblen Hemmung bindet der Inhibitor kovalent an das Enzym, wodurch dieses dauerhaft deaktiviert wird. Diese Art der Hemmung ist permanent und kann nicht durch Erhöhung der Substratkonzentration rückgängig gemacht werden. Typische Beispiele für irreversible Hemmstoffe sind:

• Schwermetalle (z.B. Quecksilber, Blei), die an Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten im Enzym binden.
• Spezifische Inhibitoren wie DIPF (Diisopropylfluorophosphat), das an Serinreste in der aktiven Stelle von Serinproteasen bindet.

Auswirkungen auf die Enzymaktivität:

• Die kovalente Bindung des Inhibitors führt zur endgültigen Inaktivierung des Enzyms.
• Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX) wird reduziert, weil die Anzahl der aktiven Enzymmoleküle verringert wird.
• Die Michaelis-Menten-Konstante (K_M) kann unverändert bleiben, da die Affinität des verbliebenen aktiven Enzyms für das Substrat unverändert ist.

Allosterische Hemmung

Allosterische Hemmung tritt auf, wenn der Inhibitor an eine spezifische allosterische Stelle des Enzyms bindet, die sich vom aktiven Zentrum unterscheidet. Diese Bindung verursacht eine Konformationsänderung des Enzyms, welche die Bindung oder Katalyse des Substrats beeinträchtigt. Wichtig ist hier:

• Die Bindung ist nicht kovalent und somit in der Regel reversibel.
• Die Konformationsänderung kann die Enzymaktivität sowohl hemmen als auch aktivieren, abhängig vom jeweiligen Inhibitor bzw. Effektor.

Auswirkungen auf die Enzymaktivität:

• Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_MAX) kann entweder erhöht oder vermindert werden, abhängig davon, ob der allosterische Effektor ein Aktivator oder Inhibitor ist.
• Die Michaelis-Menten-Konstante (K_M) kann ebenfalls variieren. Bei allosterischer Hemmung wird K_M in der Regel erhöht, was bedeutet, dass eine höhere Substratkonzentration erforderlich ist, um die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen.

Vergleich der molekularen Mechanismen

• Molekulare Bindung: Irreversible Hemmung erfolgt durch kovalente Bindung, während allosterische Hemmung durch nicht-kovalente, reversible Bindung erfolgt.
• Konformationsänderung: Allosterische Hemmung führt zu einer Konformationsänderung des Enzyms, während bei irreversibler Hemmung das Enzym dauerhaft deaktiviert wird, ohne notwendigerweise Konformationsänderungen zu verursachen.
• Dauer der Hemmung: Irreversible Hemmung ist permanent, allosterische Hemmung ist reversibel und kann durch Entfernen des Inhibitors oder durch Zugabe weiterer Effektoren rückgängig gemacht werden.