Forschungspraktikum Chemische Genetik (Wahl Genomik/Biostatistik) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

CRISPR/Cas9-Technik: Gezielte Genom-Editierung durch RNA-geleitete Endonuklease-Aktivität

• CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
• Cas9: CRISPR-associated protein 9, Endonuklease
• sgRNA (single guide RNA): Führt Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz
• Erzeugung von Doppelstrangbrüchen (Double-Strand Breaks, DSB)
• Reparaturmechanismen: Nicht-homologes End-Joining (NHEJ) oder Homologie-gerichtete Reparatur (HDR)
• Anwendung: Gen-Knockout, Gen-Knockin, Genom-Editierung

a)

Erkläre den Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technik zur Genom-Editierung.

• Beschreibe detailliert die Rolle von CRISPR und Cas9.
• Wie interagiert die sgRNA mit der Ziel-DNA-Sequenz?
• Was sind die Schritte, die zur Erzeugung eines Doppelstrangbruchs führen?

Lösung:

Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technik zur Genom-Editierung

• Rolle von CRISPR und Cas9:CRISPR steht für 'Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats' und ist ein natürlich vorkommendes bakterielles Abwehrsystem gegen Viren. Es besteht aus kurzen, wiederholten DNA-Sequenzen, die durch spacer-DNA unterbrochen werden, welche von früheren Virusinfektionen stammen. Cas9 ist ein 'CRISPR-associated protein 9', eine Endonuklease, die in der Lage ist, DNA-Stränge zu schneiden. In der CRISPR/Cas9-Technik wird das natürliche System modifiziert, um gezielte Genomveränderungen zu ermöglichen.
• Interaktion der sgRNA mit der Ziel-DNA-Sequenz:Die single guide RNA (sgRNA) besteht aus zwei Teilen: einem CRISPR-RNA (crRNA) -Teil, der komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist, und einem trans-activating crRNA (tracrRNA) -Teil, der zur Bindung und Aktivierung von Cas9 dient. Die sgRNA führt Cas9 zur spezifischen DNA-Sequenz, indem sie durch Basenpaarung an die komplementäre Zielsequenz bindet. Sobald die sgRNA die Ziel-DNA findet, bildet das sgRNA-Cas9-Komplex spezifische Wechselwirkungen mit der Ziel-DNA, die zur Positionierung der Cas9-Endonuklease führen.
• Schritte zur Erzeugung eines Doppelstrangbruchs:
  • 1. Design der sgRNA: Eine spezifische sgRNA wird entworfen, die komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist.
  • 2. Bildung des sgRNA-Cas9-Komplexes: Die sgRNA wird mit der Cas9-Protein assoziiert, um einen Komplex zu bilden.
  • 3. Bindung an die Ziel-DNA: Der sgRNA-Cas9-Komplex sucht nach der Ziel-DNA-Sequenz im Genom und bindet daran.
  • 4. Induktion des DSB: Nach der Bindung schneidet Cas9 beide Stränge der Ziel-DNA und erzeugt einen Doppelstrangbruch (DSB).
  • 5. Reparaturmechanismen: Der DSB wird entweder durch nicht-homologes End-Joining (NHEJ), das oft zu Mutationen führt, oder durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR), die präzise Änderungen ermöglicht, repariert.

b)

Reparaturmechanismen nach der Erzeugung eines Doppelstrangbruchs

• Erkläre die Unterschiede zwischen Nicht-homologem End-Joining (NHEJ) und Homologie-gerichteter Reparatur (HDR).
• Welche Vor- und Nachteile haben NHEJ und HDR in der Anwendung der Genom-Editierung?

Lösung:

Reparaturmechanismen nach der Erzeugung eines Doppelstrangbruchs

• Unterschiede zwischen Nicht-homologem End-Joining (NHEJ) und Homologie-gerichteter Reparatur (HDR):Nach der Erzeugung eines Doppelstrangbruchs (DSB) durch das CRISPR/Cas9-System gibt es zwei Hauptmechanismen zur Reparatur des DNA-Bruchs.
  • Nicht-homologes End-Joining (NHEJ): Bei NHEJ werden die gebrochenen DNA-Enden direkt wieder verbunden. Dieser Prozess ist schnell und effizient, jedoch fehleranfällig, da keine homologe DNA-Sequenz als Vorlage verwendet wird. Es können kleine Deletionen oder Insertionen an der Bruchstelle entstehen, die oft zur Inaktivierung des Gens führen.
  • Homologie-gerichtete Reparatur (HDR): Im Gegensatz dazu verwendet HDR eine homologe DNA-Sequenz als Vorlage für die Reparatur. Dies ermöglicht eine präzise Reparatur des DSB und kann zur Einführung spezifischer genetischer Änderungen genutzt werden. Die homologe Sequenz kann entweder von der Schwesterchromatide oder von einer extern bereitgestellten DNA-Matrix stammen.
• Vor- und Nachteile von NHEJ und HDR in der Anwendung der Genom-Editierung:
  • Vorteil von NHEJ: - Schneller und treibt die meisten Reparaturen in eukaryotischen Zellen an.
  • Nachteil von NHEJ: - Geringe Präzision: Es kann zu unbeabsichtigten Mutationen kommen.- Ungeeignet für präzise Geneditierung, wie das Einfügen spezifischer Sequenzen.
  • Vorteil von HDR:- Hohe Präzision: Ermöglicht die gezielte Einführung oder Korrektur spezifischer Sequenzen.- Besonders geeignet für Anwendungen, die präzise genetische Änderungen erfordern.
  • Nachteil von HDR:- Weniger effizient und tritt seltener als NHEJ auf, da HDR nur während spezifischer Phasen des Zellzyklus (S/G2-Phasen) aktiv ist.- Erfordert die Bereitstellung einer homologen DNA-Vorlage, was zusätzliche Komplexität in den Experimenten mit sich bringt.

Aufgabe 2)

Du planst ein Forschungsexperiment zur Herstellung von Knockout- und Knock-in-Organismen mittels CRISPR-Cas9. Dabei soll ein bestimmtes Gen entweder deaktiviert (Knockout) oder durch eine modifizierte Version ersetzt (Knock-in) werden. Dein Ziel ist es, die Auswirkungen dieser Genveränderungen auf zelluläre Prozesse und deren Potenzial für die Modellierung genetischer Krankheiten zu untersuchen.

a)

Beschreibe detailliert den Mechanismus, wie CRISPR-Cas9 verwendet wird, um ein Gen zu deaktivieren (Knockout). Berücksichtige dabei die Rolle von Guide-RNA (sgRNA), Cas9-Protein und den Prozessen der DNA-Reparatur.

Lösung:

• CRISPR-Cas9-System:CRISPR-Cas9 ist ein molekularbiologisches Werkzeug, das ursprünglich als Teil des adaptiven Immunsystems von Bakterien entdeckt wurde. Es besteht aus zwei Schlüsselteilen: einer spezifischen Guide-RNA (sgRNA) und dem Cas9-Protein.
• Guide-RNA (sgRNA):Die Guide-RNA ist ein synthetisches RNA-Molekül, das eine kurze, komplementäre Sequenz zum Zielgen enthält. Diese komplementäre Sequenz ermöglicht es der sgRNA, spezifisch an die DNA-Sequenz im Zielgen zu binden.
• Cas9-Protein:Das Cas9-Protein ist eine Endonuklease, die die DNA an der Stelle schneidet, an die die sgRNA gebunden ist. Cas9 erkennt und bindet an die sgRNA, um sie zur Ziel-DNA zu führen.
• Bindung der sgRNA:Die sgRNA erkennt und bindet an eine spezifische Sequenz auf der Ziel-DNA, die von der sgRNA vorgegeben wird. Dies geschieht durch basenpaarung zwischen der sgRNA und der Ziel-DNA.
• Schneiden der DNA:Nachdem die sgRNA an die Ziel-DNA gebunden hat, schneidet das Cas9-Protein beide DNA-Stränge an der spezifischen Zielstelle. Dieser Doppelstrangbruch (DSB) ist der erste Schritt zur Gen-Deaktivierung.
• DNA-Reparaturprozesse:Nach dem Schnitt durch Cas9 versucht die Zelle, diesen Doppelstrangbruch zu reparieren. Es gibt zwei Hauptwege der DNA-Reparatur:
• 1. Nicht-homologe End-Joining (NHEJ):Dieser Reparaturmechanismus ist fehleranfällig und führt oft zu Insertionen oder Deletionen (Indels) an der Bruchstelle. Diese Indels können zu einer Verschiebung des Leserahmens oder zur Erzeugung von Stop-Codons führen, was zur Deaktivierung des Gens führt.
• 2. Homologe Rekombination (HDR):Dieser Reparaturweg ist präziser und kann verwendet werden, um gezielte Veränderungen in die DNA einzufügen, ist aber weniger häufig. Für das Knockout eines Gens ist dies normalerweise nicht erforderlich.
• Ergebnis der Reparatur:Die fehlerhafte Reparatur durch NHEJ führt dazu, dass das Genprodukt (Protein) nicht mehr korrekt gebildet wird, was zu einem Knockout des Gens führt. Dies ermöglicht es, die Funktion des Zielgens zu untersuchen und seine Rolle in zellulären Prozessen und Krankheiten zu verstehen.

b)

Erkläre den Ablauf und die erforderlichen Schritte zur Erstellung eines Knock-in-Organismus mit CRISPR-Cas9, um eine spezifische Genmutation einzuführen. Gehe dabei auf die Homologe Rekombination und die Verwendung eines Donor-DNA-Templates ein.

Lösung:

• Einführung:Ein Knock-in-Organismus wird erstellt, um eine spezifische Genmutation an einer definierten Stelle in das Genom einzufügen. Dies geschieht durch die präzise Bearbeitung des Genoms mittels CRISPR-Cas9 und homologe Rekombination. Ein wichtiger Bestandteil dieses Prozesses ist die Verwendung eines Donor-DNA-Templates. Hier ist der detaillierte Ablauf:
• 1. Design der Guide-RNA (sgRNA):Die erste Schritt besteht darin, eine spezifische Guide-RNA (sgRNA) zu entwerfen, die gezielt an die Stelle im Genom bindet, an der die Mutation eingefügt werden soll. Die sgRNA enthält eine Sequenz, die komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz ist.
• 2. Konstruktion des Donor-DNA-Templates:Das Donor-DNA-Template enthält die gewünschte Mutation und flankierende homologe Sequenzen, die mit den Regionen um den Doppelstrangbruch (DSB) übereinstimmen. Diese homologen Sequenzen sind entscheidend für die homologe Rekombination.
• 3. Expression von Cas9 und sgRNA:Die Cas9-Endonuklease und die sgRNA werden in die Zielzellen eingeführt, meist durch Plasmide, virale Vektoren oder direkte RNA-Protein-Komplexe. Die sgRNA führt Cas9 zu der spezifischen Stelle im Genom, wo Cas9 einen Doppelstrangbruch erzeugt.
• 4. Einführung des Donor-DNA-Templates:Das Donor-DNA-Template wird gleichzeitig in die Zellen eingeführt. Es kann in Form von Plasmid-DNA, linearer DNA oder als einzelsträngige oligonukleotidische DNA (ssODN) vorliegen.
• 5. Homologe Rekombination (HDR):Nach dem Schnitt durch Cas9 erkennt das zelluläre Reparatursystem den Doppelstrangbruch. Die Zelle nutzt das Donor-DNA-Template, um den Bruch durch homologe Rekombination zu reparieren. Während dieses Prozesses wird die gewünschte Mutation in das Genom integriert.
• 6. Selektion und Identifikation:Nach dem Einfügen der Mutation müssen die Zellen, die erfolgreich die Mutation enthalten, selektiert und identifiziert werden. Dies kann durch PCR, Sequenzierung oder andere molekulare Methoden erfolgen.
• 7. Klonierung und Verifizierung:Die selektierten Zellen werden geklont, und die eingeführte Mutation wird durch Sequenzierung verifiziert. Dabei wird überprüft, ob die Mutation korrekt und ohne zusätzliche ungewollte Änderungen eingefügt wurde.
• 8. Analysen und Studien:Schließlich werden die Knock-in-Organismen auf ihre phänotypischen und molekularen Eigenschaften hin untersucht. Es wird analysiert, wie sich die eingeführte Mutation auf zelluläre Prozesse und das Potenzial für die Modellierung genetischer Krankheiten auswirkt.

c)

Diskutiere, wie du die Genotypisierung eines Knockout-Organismus, der mit CRISPR-Cas9 erzeugt wurde, durchführen könntest. Welche Methoden und welche Kontrollen würdest du verwenden, um sicherzustellen, dass das gewünschte Gen tatsächlich deaktiviert wurde?

Lösung:

• Einführung:Die Genotypisierung eines Knockout-Organismus ist entscheidend, um zu bestätigen, dass das Zielgen korrekt deaktiviert wurde. Folgende Methoden und Kontrollen sind empfehlenswert:
• 1. Polymerase-Kettenreaktion (PCR):Mit PCR kann die Zielregion des Gens amplifiziert werden, um festzustellen, ob Insertionen oder Deletionen (Indels) vorhanden sind, die durch den CRISPR-Cas9 induzierten Doppelstrangbruch und anschließende DNA-Reparatur entstanden sind.
• a. Design von spezifischen Primern:Entwerfe Primer, die flanking Sequenzen der Zielregion amplifizieren.
• b. Gel-Elektrophorese:Analysiere die PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese, um Veränderungen in der Größe der amplifizierten DNA zu erkennen.
• c. Sequenzierung:Sequenziere die PCR-Produkte, um die genaue Art der Indels zu bestimmen und sicherzustellen, dass der Leserahmen verändert oder ein Stop-Codon eingeführt wurde.
• 2. T7E1 (T7 Endonuclease I) Assay:Dieser Assay detektiert Heteroduplex-DNA, die aus der Hybridisierung von mutierten und Wildtyp-DNA-Strängen nach dem PCR entsteht. Die T7E1-Endonuklease schneidet mismatched Basenpaare, was auf Indels hinweist.
• a. Durchführung:Mische und hybridisiere PCR-Produkte und verdau sie mit T7E1. Analysiere dann die Produkte mittels Gel-Elektrophorese.
• 3. Western Blot:Dieser Test detektiert das Vorhandensein des Zielproteins. Ein Fehlen des Proteins bestätigt, dass das Gen von der Zelle nicht transkribiert oder translatiert wird.
• a. Design spezifischer Antikörper:Verwende Antikörper, die spezifisch gegen das Zielprotein gerichtet sind.
• b. Durchführung:Extrahiere Proteine aus Zelllysaten, trenne sie durch SDS-PAGE und übertrage sie auf eine Membran. Detektiere das Vorhandensein des Zielproteins mittels spezifischer Antikörper.
• 4. Quantitative PCR (qPCR):Mit qPCR kann die Expression des Zielgens auf mRNA-Ebene quantifiziert werden.
• a. Extraction von mRNA:Isoliere RNA aus den Zellen und transkribiere sie in cDNA.
• b. Durchführung:Führe qPCR mit spezifischen Primern durch, die gegen das Zielgen gerichtet sind. Ein Fehlen von mRNA bestätigt die Knockout-Effizienz.
• Kontrollen:
• a. Wildtyp-Kontrolle:Vergleiche die Ergebnisse mit Wildtyp-Organismen, um sicherzustellen, dass die Veränderungen spezifisch für die behandelte Zielregion sind.
• b. Positivkontrolle:Verwende eine bekannte Knockout-Linie als Kontrolle für erfolgreiche Gen-Deaktivierung.
• c. Negativkontrolle:Verwende eine nicht-edierte Zelllinie, um sicherzustellen, dass es keine unspezifischen Bindungen oder Amplifikationen gibt.
• Zusammenfassung:Durch die Kombination dieser Methoden und Kontrollen kann die erfolgreiche Genotypisierung eines Knockout-Organismus gewährleistet werden. Es wird bestätigt, dass das Zielgen deaktiviert wurde und keine ungewollten Veränderungen eingetreten sind.

Aufgabe 3)

In der Welt der modernen Molekularbiologie sind Next-Generation Sequencing (NGS) Technologien unverzichtbar geworden. Diese Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechnologien ermöglichen die schnelle und kosteneffiziente Analyse von Genomen, Exomen oder RNA. Zu den wichtigsten Techniken zählen Illumina (SBS), Ion Torrent (Halbleiter-Sequenzierung), PacBio (SMRT) und Oxford Nanopore. Diese Technologien werden in verschiedenen Anwendungsbereichen wie Genomik, Transkriptomik, Mutationsanalyse und Epigenomik eingesetzt. Der Output dieser Sequenzierungsmethoden sind Rohdaten (reads), die anschließend bioinformatisch analysiert werden. Zu den typischen Schritten eines NGS-Prozesses gehören die Template Preparation, Sequencing und Data Analysis. Die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse variieren je nach verwendeter Technik und spezifischer Anwendung.Stelle dir vor, du arbeitest in einem Forschungslabor, das auf NGS-Technologien spezialisiert ist. Deine Aufgabe besteht darin, die Unterschiede zwischen Illumina Sequenzierung und PacBio SMRT Sequenzierung sowohl in theoretischer als auch in praktischer Hinsicht zu beurteilen und anhand einer gegebenen biologischen Fragestellung (z.B. die Identifizierung von Mutationen in einem humanen Genom) die am besten geeignete Sequenzierungstechnologie zu wählen.

a)

Vergleiche die Illumina Sequenzierung und die PacBio SMRT Sequenzierung hinsichtlich der folgenden Kriterien:

• Zuverlässigkeit und Genauigkeit
• Read-Länge
• Kosten und Durchsatz
• Fehlerrate und Korekturstrategien

Lösung:

Vergleich der Illumina Sequenzierung und PacBio SMRT Sequenzierung

Im Folgenden werden die Illumina Sequenzierung und die PacBio SMRT Sequenzierung anhand der Kriterien Zuverlässigkeit und Genauigkeit, Read-Länge, Kosten und Durchsatz sowie Fehlerrate und Korrekturstrategien verglichen. Dabei wird erläutert, wie diese Aspekte die Wahl der Sequenzierungstechnologie für die Identifizierung von Mutationen in einem humanen Genom beeinflussen könnten.

• Zuverlässigkeit und Genauigkeit:
  • Illumina Sequenzierung: Diese Technologie ist für ihre hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit bekannt. Sie liefert präzise Basenaufrufe mit einer Fehlerrate von weniger als 0,1%. Die Technologie verwendet die Sequenzierung durch Synthese (SBS) Methode, die eine hohe konsistente Genauigkeit bei jedem Durchlauf gewährleistet.
  • PacBio SMRT Sequenzierung: Diese Technologie bietet ebenfalls hohe Genauigkeit, insbesondere bei langen Reads. Allerdings weisen Einzelreads eine höhere Fehlerrate auf. Durch mehrfache reads einer DNA-Sequenz (Circular Consensus Sequencing, CCS) kann die Genauigkeit verbessert werden, jedoch kostet dies Zeit und Ressourcen.
  • Einfluss auf die Wahl: Für die Identifizierung von Mutationen in einem humanen Genom ist eine hohe Genauigkeit entscheidend. Illumina wäre hier aufgrund seiner geringeren Fehlerrate und hohen Zuverlässigkeit oft die bevorzugte Wahl.
• Read-Länge:
  • Illumina Sequenzierung: Die typische Read-Länge beträgt bis zu 300 Basenpaare (bp) für Paired-End-Reads. Dies ist ausreichend für viele Anwendungen, aber kann bei komplexen genomischen Regionen oder strukturellen Varianten Einschränkungen haben.
  • PacBio SMRT Sequenzierung: Diese Technologie bietet wesentlich längere Reads, oft zwischen 10.000 bis 15.000 bp oder mehr. Diese langen Reads sind besonders nützlich für die Analyse komplexer genomischer Regionen und struktureller Varianten.
  • Einfluss auf die Wahl: Wenn lange Reads benötigt werden, um komplexe oder wiederholte Regionen des Genoms abzudecken, wäre PacBio eine vorteilhafte Option. Für die Identifizierung von Mutationen in weniger komplexen Regionen könnte Illumina ausreichend sein.
• Kosten und Durchsatz:
  • Illumina Sequenzierung: Die Kosten pro Basenpaar sind bei Illumina-Sequenzierungen relativ niedrig und der Durchsatz ist hoch, wodurch große Datenmengen innerhalb kurzer Zeit generiert werden können. Dies macht Illumina kosteneffizient für große Projekte.
  • PacBio SMRT Sequenzierung: Diese Methode hat höhere Kosten pro Basenpaar und einen niedrigeren Durchsatz im Vergleich zu Illumina. Die höheren Kosten resultieren aus der Komplexität und den langen Reads.
  • Einfluss auf die Wahl: Für Projekte mit großem Budget und speziellen Anforderungen an lange Reads kann PacBio eine gute Wahl sein. Wenn Budgetrestriktionen bestehen und ein hoher Durchsatz erforderlich ist, wäre Illumina vorzuziehen.
• Fehlerrate und Korrekturstrategien:
  • Illumina Sequenzierung: Die Technologie hat eine sehr niedrige Fehlerrate und verwendet verschiedene Strategien zur Fehlerkorrektur, wie z.B. die Verwendung von Überlappungen und Paired-End-Reads.
  • PacBio SMRT Sequenzierung: Die Fehlerrate ist bei Einzelreads höher (bis zu 15%), kann jedoch durch CCS deutlich reduziert werden. Durch mehrfache Sequenzierung derselben DNA-Moleküle lässt sich die Genauigkeit auf über 99% erhöhen.
  • Einfluss auf die Wahl: Für eine hohe initiale Genauigkeit bei der Identifizierung von Mutationen wäre Illumina wegen seiner niedrigeren Fehlerrate ideal. Wenn jedoch die lange Read-Länge von PacBio einen wesentlichen Vorteil bietet, können zusätzliche Korrekturstrategien angewendet werden, um die Genauigkeit zu erhöhen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl der Sequenzierungstechnologie stark von den spezifischen Anforderungen des Projekts abhängt. Für die Identifizierung von Mutationen in einem humanen Genom wäre in vielen Fällen die Illumina Sequenzierung aufgrund ihrer hohen Genauigkeit, niedrigen Kosten und hohen Durchsatz vorteilhaft. Bei Bedarf an langen Reads zur Überwindung komplexer genomischer Regionen könnte PacBio SMRT Sequenzierung eine ausgezeichnete Alternative darstellen.

b)

Angenommen, du hast Dich aufgrund der höheren Read-Länge der PacBio SMRT Sequenzierung entschieden. Beschreibe die wesentlichen Schritte der Template Preparation und Sequencing Prozedur für die PacBio SMRT Technologie. Welche bioinformatischen Techniken würdest Du anwenden, um die Rohdaten (reads) zu analysieren und Mutationen in einem humanen Genom zu identifizieren? Verweise dabei auf konkrete Software oder Algorithmen und beschreibe kurz deren Funktionsweise.

Lösung:

Template Preparation und Sequencing mit PacBio SMRT

Wenn die Entscheidung zugunsten der PacBio SMRT Sequenzierung aufgrund der höheren Read-Länge getroffen wurde, umfasst der Prozess der Template Preparation und Sequencing folgende wesentliche Schritte:

• Template Preparation:
  • DNA-Extraktion: Zunächst wird das Genom aus den Zellen extrahiert. Es ist wichtig, hochmolekulare und unfragmentierte DNA zu erhalten, da die Sequenzierungslängen stark korrelieren mit der Integrität der DNA.
  • SMRTbell Library Preparation: Die extrahierte DNA wird zu SMRTbells verarbeitet. Dies sind spezielle DNA-Konstrukte, die aus einem doppelsträngigen DNA-Molekül bestehen, das durch hairpin-Adapter in einen geschlossenen Ringschluss (Zirkularisierung) umgewandelt wird. Diese hairpin-Adapter bieten ein Template für die Polymerase.
  • Polymerase-Bindung: Eine spezialisierte Polymerase wird an die SMRTbell-Moleküle gebunden. Diese Polymerase kann kontinuierlich um den Ring herumlesen, was lange Reads ermöglicht.
  • Magnetische Partikel Reinigung: Die SMRTbell Templates werden gereinigt, um verbleibende Enzyme oder freie adapterlose DNA zu entfernen.
• Sequencing Prozedur:
  • SMRT Zellen Laden: Die vorbereiteten SMRTbell Templates werden in die SMRT Zellen geladen. Jede SMRT Zelle enthält tausende winziger Nanometerlöcher, sogenannte Zero-Mode Waveguides (ZMWs).
  • Sequenzierung: Jede ZMW enthält ein einzelnes DNA-Molekül und eine Polymerase. Real-Time Sequencing wird durchgeführt, bei dem fluoreszierend markierte Nukleotide erkannt werden, wenn sie in die wachsende DNA-Kette eingebaut werden. Die kontinuierliche Beobachtung der Fluoreszenzsignale ermöglicht eine Echtzeit-Sequenzierung mit sehr langen Reads.
  • Daten Extraktion: Die Signale werden in Rohdaten umgewandelt, die „Reads“ genannt werden.

Bioinformatische Techniken zur Datenanalyse und Mutationsidentifikation

Für die Analyse der Rohdaten (reads) und die Identifizierung von Mutationen im humanen Genom wären folgende bioinformatische Techniken und Tools einzusetzen:

• Preprocessing und Fehlerkorrektur:
  • CCS (Circular Consensus Sequencing): Die CCS-Technologie von PacBio wird verwendet, um die Fehlerrate zu senken. Durch mehrmaliges Lesen der gleichen Sequenz (also mehrfache Rundläufe im Zirkularen Template) kann eine konsensuelle und genaue Sequenz gewonnen werden.
  • Canu: Ein spezialisierter Software-Algorithmus für die Fehlerkorrektur und De-novo Assemblierung von langen Reads. Er ist besonders für die PacBio und Nanopore Daten entwickelt.
• Alignment und Assemblierung:
  • Minimap2: Ein schnelles Alignierungs-Tool speziell für lange Reads, das effizient die Reads gegen ein Referenzgenom ausrichtet.
  • Flye: Eine Software zur De-novo-Assemblierung von langen Reads, die gut mit den langen, ungebrochenen Sequenzen der PacBio-Daten arbeitet.
• Variant Calling:
  • FreeBayes: Ein populärer Variant Caller, der auf Bayesian Modellen basiert und zur Identifikation von SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und kleinen Indels (Insertionen und Deletionen) verwendet wird.
  • DeepVariant: Eine Machine-Learning basierte Software, die als nauwkeurig und sensitiv für die Identifikation von Variationen in den NGS-Daten bekannt ist.
• Visualisierung und Interpretation:
  • Integrative Genomics Viewer (IGV): Ein weithin verwendetes Tool zur Visualisierung genomischer Daten und zur manuellen Überprüfung der identifizierten Mutationen.
  • SnpEff: Ein Tool zur Annotations von Effekten der identifizierten SNPs und Indels, welches die Auswirkungen von Mutationen auf die proteinkodierenden Gene bewertet.

Durch die Kombination dieser Verfahren und Werkzeuge ist es möglich, eine umfassende und genaue Analyse der Rohdaten durchzuführen und Mutationen im humanen Genom zu identifizieren.

Aufgabe 4)

In einem Forschungspraktikum zur chemischen Genetik an der TU München führst Du ein Hochdurchsatz-Screening durch. Dabei testest Du eine große Bibliothek von Molekülen auf ihre Fähigkeit, eine bestimmte biochemische Wirkung zu erzeugen. Um die Effizienz des Hochdurchsatz-Screenings zu maximieren, werden automatisierte Verfahren und Multi-Well-Platten verwendet. Die Sensitivität und Spezifität der Tests sind entscheidend, und die Analyse der Daten erfolgt durch bioinformatische Methoden.

a)

Teilaufgabe 1: Beschreibe, wie Multi-Well-Platten zur Erhöhung der Effizienz und des Durchsatzes in einem Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Warum wird die Verwendung von Multi-Well-Platten in verschiedenen Formaten (z.B. 96-, 384-, oder 1536-Well) bevorzugt? Welche Vor- und Nachteile haben die verschiedenen Formate?

Lösung:

Teilaufgabe 1: Beschreibe, wie Multi-Well-Platten zur Erhöhung der Effizienz und des Durchsatzes in einem Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Warum wird die Verwendung von Multi-Well-Platten in verschiedenen Formaten (z.B. 96-, 384-, oder 1536-Well) bevorzugt? Welche Vor- und Nachteile haben die verschiedenen Formate?

Lösung:

• Effizienz und Durchsatz bei Multi-Well-Platten: Multi-Well-Platten sind wichtige Werkzeuge in Hochdurchsatz-Screenings, da sie die gleichzeitige Testung einer großen Zahl von Proben ermöglichen. Durch die Anordnung von Hunderten bis Tausenden von Wells auf einer einzelnen Platte können Forscher eine Vielzahl von Experimenten parallel durchführen. Dies spart Zeit und Ressourcen erheblich.
• Vorteile der verschiedenen Formate der Multi-Well-Platten:
  • 96-Well-Platten: Diese Platten sind Standard in vielen Laboren und bieten eine gute Balance zwischen Probenmenge und Handhabbarkeit. Die relativ große Well-Größe erlaubt eine einfache Handhabung und zuverlässige Pipettierung. Allerdings ist der Durchsatz im Vergleich zu dichteren Formaten begrenzt.
  • 384-Well-Platten: Diese Platten bieten eine vierfach höhere Anzahl an Wells im selben Formfaktor wie eine 96-Well-Platte. Dies erhöht den Durchsatz erheblich und spart gleichzeitig Reagenzien, weil die Well-Größe kleiner ist. Allerdings erfordert die Handhabung präzise Pipettiergeräte und genaue Liquid-Handling-Systeme, was die Komplexität erhöhen kann.
  • 1536-Well-Platten: Diese Platten maximieren den Durchsatz weiter und ermöglichen die Testung einer sehr großen Anzahl von Bedingungen auf kleiner Fläche. Sie sind besonders nützlich in sehr großen Screening-Kampagnen. Der Nachteil ist, dass sie eine hochpräzise und teure Ausrüstung für das Handling und Pipettieren benötigen. Zudem kann die Verdunstung der Flüssigkeit in den kleinen Wells problematisch sein.
• Nachteile der verschiedenen Formate:
  • 96-Well-Platten: Der Hauptnachteil ist der begrenzte Durchsatz. Für sehr große Bibliotheken und umfangreiche Screenings sind sie weniger effizient.
  • 384-Well-Platten: Obwohl sie einen höheren Durchsatz als 96-Well-Platten bieten, erfordern sie eine präzisere Handhabung, was die Anschaffung von spezialisierter Ausrüstung nötig macht.
  • 1536-Well-Platten: Trotz des maximalen Durchsatzes können Probleme wie Verdunstung und die Notwendigkeit hochpräziser Technologien zu erheblichen Herausforderungen führen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl des Formats der Multi-Well-Platte eine Abwägung zwischen Durchsatz, Handhabbarkeit und technischer Ausrüstung erfordert. Jedes Format hat seine spezifischen Vor- und Nachteile, die je nach Größe und Ziel des Screenings sorgfältig abgewogen werden müssen.

b)

Teilaufgabe 2: Automatisierte Verfahren sind ein wesentlicher Bestandteil des Hochdurchsatz-Screenings. Erkläre, wie diese automatisierten Systeme funktionieren und welche speziellen Herausforderungen bei ihrer Implementierung und Wartung auftreten können. Nenne einige Beispiele für automatisierte Techniken, die in Hochdurchsatz-Screenings eingesetzt werden.

Lösung:

Teilaufgabe 2: Automatisierte Verfahren sind ein wesentlicher Bestandteil des Hochdurchsatz-Screenings. Erkläre, wie diese automatisierten Systeme funktionieren und welche speziellen Herausforderungen bei ihrer Implementierung und Wartung auftreten können. Nenne einige Beispiele für automatisierte Techniken, die in Hochdurchsatz-Screenings eingesetzt werden.

Lösung:

• Funktionsweise automatisierter Systeme:Automatisierte Verfahren im Hochdurchsatz-Screening beinhalten den Einsatz von Robotik und computergesteuerten Systemen, um manuelle Arbeitsschritte zu ersetzen. Dies umfasst das Pipettieren, Inkubieren, Messen und Analysieren von Proben. Diese Systeme sind darauf ausgelegt, Präzision und Konsistenz zu maximieren, prozessbedingte Fehler zu minimieren und die Geschwindigkeit des Screenings erheblich zu erhöhen.
• Herausforderungen bei Implementierung und Wartung:
  • Komplexität und Kosten: Die Implementierung von automatisierten Systemen erfordert eine beträchtliche Anfangsinvestition. Die Einrichtung solcher Systeme ist komplex und erfordert oft maßgeschneiderte Lösungen.
  • Wartung und Kalibrierung: Automatisierte Systeme müssen regelmäßig gewartet und kalibriert werden, um eine präzise und zuverlässige Leistung zu gewährleisten. Dies kann zeitaufwendig und kostspielig sein.
  • Software-Integration: Die Systeme müssen mit der existierenden Laborsoftware integriert werden, was Kompatibilitätsprobleme verursachen kann. Eine robuste Datenverwaltung ist ebenfalls erforderlich, um die große Menge an Daten zu handhaben.
  • Technische Störungen: Jeder Systemausfall oder technische Störung kann zu signifikanten Verzögerungen im Screening-Verfahren führen. Zuverlässigkeit und schnelle Behebung von Problemen sind entscheidend.
• Beispiele für automatisierte Techniken:
  • Automatisierte Pipettierroboter: Diese Roboter können präzise Flüssigkeitsmengen in die Wells der Multi-Well-Platten transferieren. Sie sind für hohe Genauigkeit und Wiederholbarkeit optimiert.
  • Kolonieroboter: Diese Roboter automatisieren die Handhabung und den Transfer von Mikroorganismen oder Zellkolonien, um eine gleichmäßige Verteilung und möglichst hohe Effizienz zu erreichen.
  • Plattenleser: Automatisierte Plattenleser messen die biochemischen Reaktionen in den Wells der Platten. Sie können verschiedene Detektionsmethoden einsetzen, wie Absorptions-, Fluoreszenz-, oder Lumineszenz-Messungen.
  • Liquid Handling-Systeme: Diese Systeme automatisieren das Handling von Flüssigkeiten, inkl. das Mischen, Verdünnen und Verteilen von Proben und Reagenzien auf den Multi-Well-Platten.
  • Inkubatoren und Shaker: Automatisierte Inkubatoren und Shaker gewährleisten kontrollierte Umgebungsbedingungen für die Platten, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.

Zusammengefasst ermöglichen automatisierte Systeme eine signifikante Effizienzsteigerung im Hochdurchsatz-Screening, bringen jedoch auch Herausforderungen mit sich, die sorgfältige Planung und laufende Wartung erfordern.

c)

Teilaufgabe 3: Um die Ergebnisse eines Hochdurchsatz-Screenings korrekt zu interpretieren, ist eine gründliche Datenanalyse erforderlich. Erkläre die Schritte und Methoden, die bei der bioinformatischen Analyse von Hochdurchsatz-Daten angewendet werden. Welche Rolle spielen Sensitivität und Spezifität bei dieser Analyse? Wie können diese beiden Parameter berechnet und optimiert werden?

Hinweis: Nutze die folgenden Formeln zur Berechnung von Sensitivität und Spezifität:

• Sensitivität: \(\text{Sensitivität} = \frac{\text{Wahr-Positiv}}{\text{Wahr-Positiv} + \text{Falsch-Negativ}}\)
• Spezifität: \(\text{Spezifität} = \frac{\text{Wahr-Negativ}}{\text{Wahr-Negativ} + \text{Falsch-Positiv}}\)

Lösung:

Teilaufgabe 3: Um die Ergebnisse eines Hochdurchsatz-Screenings korrekt zu interpretieren, ist eine gründliche Datenanalyse erforderlich. Erkläre die Schritte und Methoden, die bei der bioinformatischen Analyse von Hochdurchsatz-Daten angewendet werden. Welche Rolle spielen Sensitivität und Spezifität bei dieser Analyse? Wie können diese beiden Parameter berechnet und optimiert werden?

Lösung:

• Schritte und Methoden der bioinformatischen Analyse:Bioinformatische Methoden sind entscheidend für die Verarbeitung und Interpretation der großen Datenmengen, die bei Hochdurchsatz-Screenings generiert werden. Die Schritte umfassen:
• Datenvorverarbeitung: Reinigung und Normalisierung der Rohdaten, um Rauschen zu entfernen und die Daten auf ein einheitliches Format zu bringen.
• Qualitätskontrolle: Überprüfung der Daten auf Konsistenz und Genauigkeit, um fehlerhafte Datenpunkte zu identifizieren.
• Datenintegration: Kombinieren von Daten aus verschiedenen Quellen oder Experimenten, um umfassendere Analysen zu ermöglichen.
• Datenanalyse: Anwendung statistischer und maschineller Lernmethoden zur Identifizierung signifikanter Muster und Zusammenhänge in den Daten.
• Ergebnisinterpretation: Interpretation der Ergebnisse im biologischen Kontext, um potenzielle Hits oder signifikante biochemische Effekte zu identifizieren.
• Visualisierung: Darstellung der Daten und Ergebnisse in leicht verständlichen grafischen Formaten, um die Kommunikation der Ergebnisse zu erleichtern.
• Rolle von Sensitivität und Spezifität:Sensitivität und Spezifität sind zentrale Kennzahlen bei der Bewertung der Leistungsfähigkeit eines Hochdurchsatz-Screenings. Sie helfen dabei, die Genauigkeit und Verlässlichkeit der Testverfahren zu bewerten und sicherzustellen, dass die identifizierten Hits tatsächlich relevant sind.
• Sensitivität: Dies ist das Maß dafür, wie gut der Test wahre positive Ergebnisse erkennt, also Hits korrekt identifiziert. Je höher die Sensitivität, desto weniger wahre Hits werden übersehen. Formel zur Berechnung der Sensitivität: \(\text{Sensitivität} = \frac{\text{Wahr-Positiv}}{\text{Wahr-Positiv} + \text{Falsch-Negativ}}\)
• Spezifität: Dies misst, wie gut der Test wahre negative Ergebnisse erkennt, also Nicht-Hits korrekt identifiziert. Eine hohe Spezifität bedeutet, dass der Test wenig falsch-positive Ergebnisse liefert. Formel zur Berechnung der Spezifität: \(\text{Spezifität} = \frac{\text{Wahr-Negativ}}{\text{Wahr-Negativ} + \text{Falsch-Positiv}}\)
• Optimierung von Sensitivität und Spezifität:Die Optimierung dieser Parameter erfolgt durch Anpassung der Screening-Bedingungen und Algorithmen:
• Schwellwert-Anpassung: Die Wahl des geeigneten Schwellwerts für die Entscheidung, ob ein Testresultat als positiv oder negativ gilt, kann das Gleichgewicht zwischen Sensitivität und Spezifität beeinflussen.
• Validierung und Kalibrierung: Regelmäßiges Testen und Kalibrieren der Screening-Methoden, um sicherzustellen, dass sie präzise und zuverlässig arbeiten.
• Algorithmen-Anpassung: Verfeinerung der Algorithmen zur Datenanalyse, um die Trennschärfe zwischen positiven und negativen Ergebnissen zu erhöhen.
• Kontrollgruppen: Einbeziehung adäquater Kontrollgruppen, um falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse zu minimieren.

Zusammenfassend ist die bioinformatische Analyse von Hochdurchsatz-Daten ein mehrstufiger Prozess, der maßgeblich von der Genauigkeit der verwendeten Methoden abhängt. Sensitivität und Spezifität spielen hierbei eine zentrale Rolle und müssen sorgfältig berechnet und optimiert werden, um die Zuverlässigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

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Teilaufgabe 4: Hochdurchsatz-Screenings sind ein bedeutendes Werkzeug in der Wirkstoffentdeckung und funktionellen Genomik. Diskutiere, wie die Ergebnisse eines Hochdurchsatz-Screenings genutzt werden können, um neue Wirkstoffe zu identifizieren. Beziehe Dich dabei auf den Prozess von der Identifikation eines Hits bis zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls. Welche Herausforderungen und Schritte sind in diesem Prozess involviert?

Lösung:

Teilaufgabe 4: Hochdurchsatz-Screenings sind ein bedeutendes Werkzeug in der Wirkstoffentdeckung und funktionellen Genomik. Diskutiere, wie die Ergebnisse eines Hochdurchsatz-Screenings genutzt werden können, um neue Wirkstoffe zu identifizieren. Beziehe Dich dabei auf den Prozess von der Identifikation eines Hits bis zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls. Welche Herausforderungen und Schritte sind in diesem Prozess involviert?

Lösung:

• Von der Identifikation eines Hits zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls:Der Prozess der Wirkstoffentdeckung beginnt oft mit einem Hochdurchsatz-Screening, um potenzielle Hits zu identifizieren, die eine gewünschte biochemische Wirkung haben. Die Schritte und Herausforderungen auf dem Weg zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls umfassen:
• 1. Identifikation von Hits: Das Hochdurchsatz-Screening liefert eine Liste von Molekülen, die positive Ergebnisse (Hits) in den Tests gezeigt haben. Diese ersten Treffer dienen als Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen.
• 2. Hit-Bestätigung und -Validierung: Die identifizierten Hits müssen in sekundären Assays erneut getestet und validiert werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse wiederholbar und robust sind. Dies hilft, falsch-positive Resultate zu eliminieren.
• 3. Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR)-Analyse: Eine detaillierte Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehungen wird durchgeführt, um zu verstehen, welche strukturellen Eigenschaften der Hits für die beobachtete Aktivität verantwortlich sind. Dies ermöglicht die systematische Modifikation der Molekülstruktur, um die Wirkung zu optimieren.
• 4. Optimierung der Leitstruktur: Basierend auf der SAR-Analyse werden chemische Modifikationen an den Hits vorgenommen, um deren Wirksamkeit, Selektivität und pharmakokinetische Eigenschaften zu verbessern. Dies führt zur Identifikation von Leitstruktur-Molekülen, die eine vielversprechende Wirksamkeit in präklinischen Modellen zeigen.
• 5. Präklinische Tests: Die potenziellen Leitstruktur-Moleküle durchlaufen eine Reihe von präklinischen Tests, einschließlich In-vitro- und In-vivo-Studien zur Bewertung der Toxizität, Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit. Dies ist ein kritischer Schritt, um sicherzustellen, dass die Moleküle sicher und wirksam sind.
• 6. Kandidatenauswahl: Basierend auf den präklinischen Tests wird ein Molekül als klinischer Kandidat ausgewählt, das die besten Eigenschaften hinsichtlich Wirksamkeit und Sicherheit aufweist. Dies markiert den Übergang von der präklinischen Phase zur klinischen Entwicklung.
• Herausforderungen im Prozess:
  • Hit-to-Lead (H2L)-Phase: Die Umwandlung eines Hits in eine Leitstruktur kann herausfordernd sein, da viele Untersuchungen und Modifikationen notwendig sind, um die gewünschten Eigenschaften zu erreichen. Dabei ist oft eine interdisziplinäre Zusammenarbeit erforderlich.
  • Balance zwischen Wirksamkeit und Toxizität: Eine zentrale Herausforderung ist die Optimierung der Moleküle, um eine hohe Wirksamkeit gegen das Ziel zu erreichen, während gleichzeitig Nebenwirkungen und Toxizität minimiert werden.
  • Kosten und Zeit: Der gesamte Prozess von der Identifikation eines Hits zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls ist zeitaufwendig und kostspielig. Es bedarf signifikanter finanzieller und personeller Ressourcen.
  • Regulatorische Anforderungen: Die entwickelten Moleküle müssen strenge regulatorische Anforderungen und Richtlinien erfüllen, um für klinische Studien und letztendlich für die Marktzulassung zugelassen zu werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Hochdurchsatz-Screenings ein mächtiges Werkzeug zur Identifizierung potenzieller neuer Wirkstoffe sind. Der Übergang von der Identifikation eines Hits zur Entwicklung eines Leitstruktur-Moleküls umfasst jedoch zahlreiche Schritte und stellt vielfältige Herausforderungen dar, die sorgfältige Planung und übergreifende Expertise erfordern.