Forschungspraktikum Metabolic Programming (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Cheatsheet.pdf

Grundlagen der metabolischen Regulation

Definition:

Mechanismen und Prinzipien, die den Stoffwechsel auf zellulärer und molekularer Ebene steuern.

Details:

• Regulation durch Enzyme: Aktivität durch posttranslationale Modifikationen und Allosterie beeinflusst
• Genexpression: Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikationen
• Signalwege: Hormone (z.B. Insulin, Glucagon) und sekundäre Botenstoffe (\textit{z.B. cAMP})
• Metabolische Schalter: AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK), mTOR-Signalweg
• Feedback-Mechanismen: Negatives und positives Feedback zur Feinregulation

Einfluss von Ernährung auf die Genexpression

Definition:

Einfluss von Nährstoffen und Diät auf Genaktivitätsmuster.

Details:

• Epigenetische Modifikationen: DNA-Methylierung, Histonmodifikation.
• Nährstoffe: Vitamine (B12, Folat), Fettsäuren, Polyphenole.
• Signalwege: mTOR, AMPK, Insulinsignalweg.
• Metaboliten als Transkriptionsfaktor-Aktivatoren.
• Studien: Tiermodelle, menschliche Interventionsstudien.

Epigenetische Modifikationen durch Umweltfaktoren

Definition:

Epigenetische Modifikationen durch Umweltfaktoren: Veränderungen der Genexpression ohne DNA-Sequenzänderung, oft induziert durch Umwelteinflüsse wie Ernährung, Stress, Toxine.

Details:

• Mechanismen: DNA-Methylierung, Histon-Modifikation, nicht-kodierende RNAs
• Einfluss: Können Genexpression stabil modifizieren, teils über Generationen weitergegeben.
• Umweltfaktoren: Ernährung, Temperatur, Stress, Schadstoffe, Lebensstil
• Relevanz: Wichtiger für Entwicklungsprozesse, Krankheitsanfälligkeit, Anpassungen

Proteinaufreinigung und -charakterisierung

Definition:

Isolierung und Analyse von Proteinen zur Bestimmung ihrer Struktur und Funktion.

Details:

• Chromatographie: Auftrennung basierend auf Größe (Größenausschlusschromatographie), Ladung (Ionenaustauschchromatographie), Hydrophobie (Hydrophobe Interaktionschromatographie) oder Affinität (Affinitätschromatographie).
• Elektrophorese: Auftrennung nach Größe und/oder Ladung, z.B. SDS-PAGE.
• Massenspektrometrie: Bestimmung der Masse und Sequenz von Proteinen.
• Spektroskopie: UV/Vis, Fluoreszenz, Circular Dichroism (CD) zur Analyse der Proteinstruktur.
• Western Blot: Nachweis spezifischer Proteine mittels Antikörper.
• Proteinassays: Bestimmung der Proteinkonzentration, z.B. Bradford- oder BCA-Assay.

Enzymatische Assays und Kinetik

Definition:

quantitative Bestimmung der Aktivität von Enzymen und deren Kinetik

Details:

• Michaelis-Menten Kinetik: \[ v = \frac{{V_{max} [S]}}{{K_m + [S]}} \]
• Lineweaver-Burk Plot: doppelt reziproke Darstellung
• Parameter:
  • \(V_{max}\): maximale Reaktionsgeschwindigkeit
  • \(K_m\): Michaelis-Konstante
  • \(k_{cat}\): Umsatzzahl (\(k_{cat} = \frac{{V_{max}}}{{[E_t]}}\))
• Inhibitoren-Typen: kompetitiv, unkompetitiv, nicht-kompetitiv
• Beispiel für kompetitive Hemmung: \[ v = \frac{{V_{max} [S]}}{{K_m (1 + \frac{{[I]}}{{K_i}}) + [S]}} \]
• Experimenteller Ablauf: Enzym + Substrat mischen, Reaktionsverlauf messen (z.B. Absorption/Fluoreszenz)

CRISPR-Cas9 für Geneditierung

Definition:

CRISPR-Cas9 eine Methode zur gezielten Geneditierung, die Bakterien zur Abwehr von Viren verwenden.

Details:

• Cas9-Protein: Schneidet DNA an spezifischen Stellen
• Guide-RNA (gRNA): Bindet an Ziel-DNA-Sequenz
• Doppelstrangbruch (DSB) durch Cas9, repariert durch zelleigene Mechanismen
• NHEJ (Nicht-homologe End-Verknüpfung): Kann zu Indels führen
• HDR (Homologie-gerichtete Reparatur): Ermöglicht präzise Einfügung von DNA-Sequenzen
• Anwendung: Krankheitsforschung, Landwirtschaft, Biotechnologie

Massenspektrometrie für die Proteinanalyse

Definition:

Massenspektrometrie (MS) zur Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen durch Messung des Verhältnisses Masse/Ladung (m/z) von Peptidfragmenten.

Details:

• Probenvorbereitung: Proteinextraktion, Verdau mit Trypsin
• Ionisationsmethoden: MALDI, ESI
• Massenspektrometer-Typen: TOF, Orbitrap, Ionenfallen
• Analyse: Peptid-Massenfingerprinting (PMF), Tandem-MS (MS/MS)
• Datenbankabgleich für Proteinidentifikation: z.B. Mascot
• Quantifizierung: Label-free, SILAC, TMT

Zellkulturtechniken

Definition:

Techniken, um Zellen außerhalb ihres natürlichen Umfelds unter kontrollierten Bedingungen zu kultivieren.

Details:

• Wichtig für Studien zur Zellphysiologie, Genexpression und Medikamententests.
• Erfordert sterile Bedingungen und spezielle Ausrüstung.
• Häufige Zellkulturen: Primärkulturen und Zelllinien.
• Parameter: Temperatur, pH, CO2, Nährstoffe.
• Methoden: Trypsinieren, Passagieren, Kryokonservierung.
• Verwendete Medien: DMEM, RPMI, FBS.
• Kontaminationskontrolle essenziell (z.B. Antibiotika).