Forschungspraktikum Metabolic Programming (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Im Forschungspraktikum Metabolic Programming wirst Du die Mechanismen und Prinzipien untersuchen, die den Stoffwechsel sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene steuern. Ein essentieller Aspekt der metabolischen Regulation ist die Rolle von Enzymen. Ihre Aktivität kann durch posttranslationale Modifikationen und allosterische Effekte modifiziert werden. Ein weiterer Faktor ist die Regulation der Genexpression, die durch Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikationen beeinflusst wird. Des Weiteren sind Signalwege, wie die Wirkung von Hormonen (z.B. Insulin und Glucagon) und sekundäre Botenstoffe (z.B. cAMP), von großer Bedeutung. Auch metabolische Schalter wie die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) und der mTOR-Signalweg spielen eine zentrale Rolle. Schließlich tragen Feedback-Mechanismen - sowohl positives als auch negatives Feedback - zur Feinregulation des Stoffwechsels bei.

a)

Beschreibe die Rolle von Insulin und Glucagon in der Regulation des Blutzuckerspiegels und erkläre, wie diese Hormone über sekundäre Botenstoffe wie cAMP wirken.

Lösung:

Die Rolle von Insulin und Glucagon in der Regulation des Blutzuckerspiegels

Insulin und Glucagon sind zwei zentrale Hormone, die wesentlich zur Regulierung des Blutzuckerspiegels beitragen. Ihre Wirkungsweisen und die Mechanismen, über die sie arbeiten, sind wie folgt:

• Insulin:
  • Wird in den Betazellen des Pankreas produziert.
  • Senkt den Blutzuckerspiegel, indem es die Aufnahme von Glukose in die Zellen fördert, insbesondere in Muskel- und Fettzellen.
  • Stimuliert die Speicherung von Glukose in Form von Glykogen in der Leber.
  • Hemmung der Glukoneogenese (Neubildung von Glukose) und der Glykolyse (Abbau von Glykogen zu Glukose) in der Leber.
• Glucagon:
  • Wird in den Alphazellen des Pankreas produziert.
  • Erhöht den Blutzuckerspiegel, indem es die Freisetzung von Glukose aus der Leber stimuliert.
  • Fördert den Abbau von Glykogen zu Glukose (Glykogenolyse) in der Leber.
  • Stimuliert die Glukoneogenese.

Wirkung über sekundäre Botenstoffe

Beide Hormone wirken über sekundäre Botenstoffe, um ihre Effekte zu vermitteln. Ein solcher sekundärer Botenstoff ist cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP).

• Insulin:
  • Insulin senkt cAMP-Spiegel durch Aktivierung der Phosphodiesterase, die cAMP abbaut.
  • Reduzierte cAMP-Spiegel führen zur Deaktivierung von Protein-Kinase A (PKA), was wiederum die Glukoseaufnahme durch Glukose-Transporter (GLUT4) erhöht und die Glykogenolyse hemmt.
• Glucagon:
  • Glucagon erhöht den cAMP-Spiegel durch Bindung an den Glucagon-Rezeptor, der die Adenylylcyclase aktivieren und die Produktion von cAMP steigern kann.
  • Erhöhte cAMP-Spiegel führen zur Aktivierung von PKA, die dann die Glykogenolyse und die Glukoneogenese in der Leber stimuliert.

Zusammengefasst lässt sich sagen: Insulin und Glucagon sind wesentliche Regulatoren des Blutzuckerspiegels, die über verschiedener Mechanismen, einschließlich der Beeinflussung von sekundären Botenstoffen wie cAMP, ihre Effekte ausüben.

b)

Erkläre, wie die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) als metabolischer Schalter wirkt und beschreibe die Bedingungen, unter denen AMPK aktiviert wird. Berücksichtige dabei die Einflüsse auf die Enzymaktivität und die Genexpression.

Lösung:

AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) als metabolischer Schalter

Die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) ist ein zentraler Regulator des Energiehaushalts der Zelle und wirkt als metabolischer Schalter. Sie reagiert auf Veränderungen des zellulären Energiezustands und hilft dabei, das Gleichgewicht zwischen Energieversorgung und -verbrauch zu wahren. Die Hauptfunktionen der AMPK umfassen:

• Förderung der Energiegewinnung: AMPK aktiviert katabole Prozesse, die ATP (Adenosintriphosphat) erzeugen, wie z.B. den Glukose- und Fettsäureabbau.
• Hemmung der Energieverbrauchenden Prozesse: AMPK hemmt anabole Prozesse, die ATP verbrauchen, wie die Synthese von Fettsäuren, Cholesterin und Proteinen.

Bedingungen für die Aktivierung von AMPK

AMPK wird hauptsächlich durch den Energiezustand der Zelle reguliert. Dies geschieht über das Verhältnis von AMP (Adenosinmonophosphat) zu ATP, sowie ADP (Adenosindiphosphat) zu ATP:

• Hohe AMP/ATP- und ADP/ATP-Verhältnisse: Diese Verhältnisse signalisieren einen niedrigen Energiezustand in der Zelle, was zur Aktivierung der AMPK führt, da AMP und ADP direkt an AMPK binden und ihre Aktivität steigern.
• Kinase und Phosphatase-Aktivität: Der Upstream-Kinase-LKB1 und -CAMKKβ phosphorylieren AMPK und aktivieren sie, während Phosphatasen die Dephosphorylierung und Deaktivierung von AMPK bewirken.

Einflüsse auf Enzymaktivität und Genexpression

Die Aktivierung von AMPK hat weitreichende Effekte auf die Zellaktivität, indem sie sowohl die Aktivität von Enzymen als auch die Genexpression reguliert:

• Einfluss auf Enzymaktivität:
  • AMPK phosphoryliert und aktiviert Enzyme, die am Abbau von Glukose und Fettsäuren beteiligt sind, wie z.B. die Glukose-Transporter (GLUT4) und Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC).
  • Sie phosphoryliert und deaktiviert Enzyme, die am Aufbau von Fettsäuren und Cholesterin beteiligt sind.
• Einfluss auf Genexpression:
  • AMPK reguliert die Transkriptionsfaktoren, die die Expression von Genen beeinflussen, die am Energiestoffwechsel beteiligt sind, wie z.B. PGC-1α.
  • Dies führt zu langfristigen Anpassungen der Zelle an veränderte Energiezustände, einschließlich der mitochondrialen Biogenese und der Expression von Enzymen des oxidativen Stoffwechsels.

Zusammengefasst lässt sich sagen: AMPK wirkt als entscheidender metabolischer Schalter, der auf niedrige Energieniveaus reagiert, indem er die Aktivität von Enzymen und die Genexpression anpasst, um die Energieproduktion zu steigern und den Energieverbrauch zu senken.

c)

Eine Zelle wird mit einem Stoff behandelt, der die posttranslationale Modifikation eines Schlüsselenzyms im Glykolyseweg unterdrückt. Diskutiere die möglichen Auswirkungen dieser Behandlung auf den Stoffwechsel der Zelle. Berücksichtige dabei sowohl die allosterische Regulation als auch das Feedback-Mechanismen.

Lösung:

Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Zelle durch Unterdrückung der posttranslationalen Modifikation eines Schlüsselenzyms im Glykolyseweg

Die posttranslationale Modifikation von Enzymen spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Enzymaktivität und somit des gesamten Stoffwechselweges. Wenn ein Schlüsselenzym im Glykolyseweg von der posttranslationalen Modifikation unterdrückt wird, könnten verschiedene Auswirkungen auf den zellulären Stoffwechsel auftreten:

1. Auswirkungen auf die Enzymaktivität

• Verminderte Aktivität des Schlüsselenzyms: Ohne die notwendigen Modifikationen könnte die katalytische Aktivität des Enzyms reduziert sein. Dies würde die Effizienz des Glykolysewegs insgesamt verringern und die Energieproduktion in der Form von ATP reduzieren.
• Veränderte Proteininteraktionen: Posttranslationale Modifikationen können die Fähigkeit eines Enzyms beeinträchtigen, mit anderen Proteinen und Regulatoren zu interagieren, was die Gesamtregulation des Stoffwechselweges stören könnte.

2. Allosterische Regulation

• Beeinträchtigte allosterische Effekte: Viele Enzyme im Glykolyseweg werden durch allosterische Effektoren reguliert, die ihre Aktivität durch Konformationsänderungen beeinflussen. Ohne posttranslationale Modifikationen könnte diese allosterische Regulation beeinträchtigt sein, was zu einer unzureichenden Anpassung der Enzymaktivität an die metabolischen Anforderungen der Zelle führt.

3. Feedback-Mechanismen

• Gestörtes Feedback: In vielen Stoffwechselwegen gibt es Feedback-Mechanismen, die die Synthese oder Inhibition von Enzymen regulieren. Ein deaktiviertes Schlüsselenzym könnte solch ein Feedback negativ beeinflussen, was möglicherweise eine übermäßige oder unzureichende Aktivität anderer Enzyme im Glykolyseweg zur Folge hätte.
• Veränderte Substrat- und Produktspiegel: Wenn ein Schlüsselenzym inaktiv ist, könnte das zur Akkumulation von Substraten und einer Verringerung der Produkte führen. Dies könnte die Zelle dazu veranlassen, alternative Stoffwechselwege zur Kompensation zu aktivieren.

Zusammenfassung

Die Unterdrückung der posttranslationalen Modifikation eines Schlüsselenzyms im Glykolyseweg kann weitreichende und komplexe Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Zelle haben. Dies umfasst eine verminderte Enzymaktivität, beeinträchtigte allosterische Regulation und gestörte Feedback-Mechanismen. Diese Veränderungen könnten letztendlich die Effizienz des Glykolysewegs und die Energieproduktion der Zelle negativ beeinflussen.

Aufgabe 2)

Einfluss von Ernährung auf die Genexpression: Du wirst gebeten, die Auswirkungen von verschiedenen Nährstoffen und Ernährungsweisen auf die Genaktivitätsmuster zu analysieren und zu verdeutlichen. Der Fokus liegt auf epigenetischen Modifikationen wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen, auf spezifischen Nährstoffen wie Vitaminen (B12, Folat), Fettsäuren und Polyphenolen sowie auf relevanten Signalwegen wie mTOR, AMPK und dem Insulinsignalweg. Berücksichtige zudem, wie Metaboliten als Transkriptionsfaktor-Aktivatoren wirken können und ziehe relevante Ergebnisse aus Studien an Tiermodellen und menschlichen Interventionsstudien heran.

Aufgabe 3)

Epigenetische Modifikationen sind kritische Prozesse, durch die Umweltfaktoren wie Ernährung, Stress und Toxine die Genexpression verändern können, ohne die DNA-Sequenz zu ändern. Diese Modifikationen umfassen Mechanismen wie DNA-Methylierung, Histon-Modifikation und die Aktivität nicht-kodierender RNAs. Solche Änderungen können stabile Effekte auf die Genexpression haben und in manchen Fällen über Generationen hinweg weitergegeben werden. Die Auswirkungen dieser Modifikationen sind besonders bedeutsam für Entwicklungsprozesse, Krankheitsanfälligkeit und Anpassungen an Umweltveränderungen.

a)

a) Erkläre den Mechanismus der DNA-Methylierung und beschreibe, wie Ernährung diesen Prozess beeinflussen kann. Diskutiere auch, welche langfristigen Effekte diese Änderungen auf die Genexpression haben können.

Lösung:

a)

Die DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus, bei dem eine Methylgruppe (\text{CH}_3) an den fünften Kohlenstoff eines Cytosin-Rests innerhalb eines CpG-Dinukleotids angehängt wird. Dieser Prozess wird durch Enzyme wie DNA-Methyltransferasen (DNMTs) katalysiert. Methylierte DNA beeinflusst die Genexpression, da sie die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA verhindern kann und dadurch die Transkription blockiert. Normalerweise führt eine erhöhte Methylierung von Promotorregionen zu einer Verringerung der Genexpression.

• Mechanismus der DNA-Methylierung:
  • Die Methylgruppe (\text{CH}_3) wird von S-Adenosylmethionin (SAM), dem Methylgruppendonor, auf das Cytosin übertragen.
  • Nach der Methylierung entsteht 5-Methylcytosin (5mC).
  • 5mC kann die Chromatinstruktur verändern, was wiederum die Genexpression beeinflusst.

Einfluss der Ernährung:

• Bestimmte Nährstoffe und Nahrungsbestandteile, wie z.B. Folsäure, Methionin, Cholin und Betain, sind Methylgruppendonor-Vorstufen und spielen eine wichtige Rolle im Methylierungszyklus.
• Eine Ernährung, die reich an diesen Nährstoffen ist, kann die Verfügbarkeit von SAM erhöhen und damit die DNA-Methylierung fördern.
• Umgekehrt kann ein Mangel an diesen Nährstoffen die Methylierung vermindern und so die Genexpression verändern.

Langfristige Effekte:

• Stabile epigenetische Modifikationen: DNA-Methylierungsmuster können stabil vererbt werden, was bedeutet, dass die Änderungen in der Genexpression über Zellgenerationen hinweg bestehen bleiben können.
• Entwicklungsprozesse: Änderungen in der DNA-Methylierung können während der Entwicklung wichtige Gene an- oder abschalten, was sich auf die Entwicklung von Organismen auswirkt.
• Krankheitsanfälligkeit: Abnormale Methylierungsmuster sind mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, verbunden. Beispielsweise kann eine Hypermethylierung von Tumor-Suppressor-Genen deren Expression verringern und zur Tumorbildung beitragen.
• Anpassungen an Umweltveränderungen: Durch die Veränderung der Genexpression kann die DNA-Methylierung Organismen helfen, sich an neue Umweltbedingungen anzupassen.

b)

b) Histon-Modifikationen sind eine weitere Form der epigenetischen Regulation. Erkläre, wie verschiedene Arten von Histon-Modifikationen (z.B. Acetylierung, Methylierung) die Chromatinstruktur und somit die Genexpression beeinflussen können. Gib konkrete Beispiele für Umwelteinflüsse, die diese Modifikationen auslösen können.

Lösung:

b)

Histon-Modifikationen sind Prozesse, bei denen chemische Gruppen an Histon-Proteine angehängt werden. Diese Modifikationen können die Struktur des Chromatins verändern, was wiederum die Zugänglichkeit der DNA für die Transkription beeinflussen kann. Zu den häufigsten Histon-Modifikationen gehören die Acetylierung und Methylierung.

• Acetylierung:
  • Bei der Acetylierung werden Acetylgruppen (\(\text{CH}_3\text{CO}\)) an spezifische Lysine in den Histon-Proteinen angehängt.
  • Dies führt zu einer Lockerung der Chromatinstruktur, da die positive Ladung der Lysine neutralisiert wird, was die Anziehungskräfte zwischen den Histonen und der negativ geladenen DNA verringert.
  • Durch diese Lockerung wird die DNA zugänglicher für Transkriptionsfaktoren und RNA-Polymerase, was die Genexpression erhöht.

• Methylierung:
  • Die Methylierung umfasst die Addition von Methylgruppen (\(\text{CH}_3\)) an Lysine oder Arginine der Histon-Proteine.
  • Die Auswirkungen der Methylierung hängen davon ab, welche Aminosäuren modifiziert werden und wie viele Methylgruppen hinzugefügt werden (Mono-, Di- oder Trimethylierung).
  • Histonmethylierung kann sowohl zur Aktivierung als auch zur Repression der Genexpression führen. Beispielsweise ist die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 4 (H3K4me3) mit aktiver Transkription assoziiert, während die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 27 (H3K27me3) zur Genrepression führt.

Beispiele für Umwelteinflüsse:

• Bestimmte Diäten: Eine Ernährung, die reich an bestimmten Nährstoffen ist, wie Vitamin B, kann die Acetylierung und Methylierung von Histonen beeinflussen.
• Stress: Chronischer Stress kann Histon-Modifikationen auslösen, die die Genexpression in Hirnregionen beeinflussen und so zur Entwicklung von psychischen Störungen beitragen können.
• Toxine: Umwelttoxine wie Schwermetalle (z.B. Cadmium) können die Aktivität von Enzymen beeinflussen, die an der Histon-Modifikation beteiligt sind, was epigenetische Veränderungen und potentielle Gesundheitsschäden verursacht.

c)

c) Nicht-kodierende RNAs spielen eine bedeutende Rolle bei der epigenetischen Regulation. Beschreibe die Funktion von microRNAs und long non-coding RNAs bei der Regulierung der Genexpression. Analysiere, wie Stress als Umweltfaktor diese nicht-kodierenden RNAs beeinflussen kann und welche Konsequenzen dies für die Zelle haben könnte.

Lösung:

c)

Nicht-kodierende RNAs (ncRNAs) sind RNA-Moleküle, die nicht in Proteine übersetzt werden, aber dennoch wichtige regulatorische Funktionen in der Zelle haben. Zwei Haupttypen von ncRNAs, die eine bedeutende Rolle bei der epigenetischen Regulation spielen, sind microRNAs (miRNAs) und long non-coding RNAs (lncRNAs).

• microRNAs (miRNAs):
  • miRNAs sind kurze, etwa 22 Nukleotide lange RNA-Moleküle, die die Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene regulieren.
  • Sie binden komplementär an messenger RNA (mRNA)-Moleküle und verhindern deren Translation, indem sie die mRNA entweder direkt abbauen oder die Translation blockieren.
  • Dies führt zu einer verringerten Proteinproduktion der Zielgene.

• long non-coding RNAs (lncRNAs):
  • lncRNAs sind länger als 200 Nukleotide und haben vielfältige Funktionen bei der Genregulation.
  • Sie können als Gerüste dienen, um Proteinkomplexe zu rekrutieren und die Chromatinstruktur zu modifizieren.
  • lncRNAs können auch direkt mit DNA oder mRNA interagieren, um die Genexpression zu regulieren.

Einfluss von Stress:

• Stress kann die Expression von ncRNAs verändern, einschließlich miRNAs und lncRNAs.
• Chronischer Stress kann die Expression bestimmter miRNAs erhöhen oder verringern, was zu einer veränderten Genregulation führt. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Stress die Expression von miR-34c erhöht, was die Produktion stress-assoziierter Proteine beeinflusst.
• Stress kann auch die Expression von lncRNAs modulieren, was wiederum die Chromatinstruktur und die Transkription bestimmter Gene beeinflussen kann.

Konsequenzen für die Zelle:

• Veränderungen in der ncRNA-Expression können weitreichende Auswirkungen auf die Zellfunktion haben.
• Eine Dysregulation von miRNAs kann zur Fehlregulation von Genen führen, die an Zellzyklus, Apoptose und Stressantwort beteiligt sind. Dies kann zu Zellschäden und Krankheiten wie Krebs beitragen.
• Änderungen in der lncRNA-Expression können die epigenetische Landschaft der Zelle verändern, was die Genexpression global beeinflusst und zu langfristigen Anpassungen oder Fehlfunktionen führt.

d)

d) Gegeben sei, dass eine Population durch die Exposition gegenüber einem Umweltgift eine Veränderung der DNA-Methylierungsprofile erfährt. Formuliere eine mathematische Modellgleichung, die den Zusammenhang zwischen der Konzentration des Umweltgifts und dem Methylierungsniveau beschreibt. Nehmen wir an, das Methylierungsniveau lässt sich als linear abhängig von der Giftkonzentration darstellen. Schätze die Parameter der Gleichung basierend auf der hypothetischen Datenreihe von Giftkonzentration (in µg/L) und Methylierungsniveau (%):

 Giftkonzentration: [0, 10, 20, 30, 40, 50] Methylierungsniveau: [5, 15, 25, 35, 45, 55] 

Lösung:

d)

Um den Zusammenhang zwischen der Konzentration des Umweltgifts und dem Methylierungsniveau mathematisch zu modellieren, können wir eine lineare Gleichung verwenden:

y = mx + b

Hierbei ist:

• yaas Methylierungsniveau (%)
• xaas Giftkonzentration (in µg/L)
• mder Steigungskoeffizient
• bder Y-Achsenabschnitt

Wir können die Parameter m und b bestimmen, indem wir eine lineare Regression auf die gegebenen Daten anwenden:

 Giftkonzentration (in µg/L): [0, 10, 20, 30, 40, 50] Methylierungsniveau (%): [5, 15, 25, 35, 45, 55] 

Der Zusammenhang wird also linear dargestellt durch die Daten:

Um die Parameter zu schätzen, verwenden wir die Methode der kleinsten Quadrate.

Rechenschritte:

• Zuerst berechnen wir die Steigung m:
• a= [Giftkonzentrationdurchschnittlich pro Wert 00 wie folgt: a=(0+10+20+30+40+50)/6=25 a=25a = 25durchnittl Methylierungydurchnittmethylierungs livello =0 y(5+15+25+35+45+55)=30 so (mean y=30Durschnitts

x,y. wir können uns das Mittelwert von x berechnen mit flge folge::methyl-% der x berechnet Xex Giftkon = [ (0-25)^2+(10-25)^2+(20-25)^2-(30-25)+(40-25)^2+(50-25)^2]=3125 durchdas =3125/90. Es gibt zusammenfge: 3125 priv 30-30 f= für Zahlen= 18. \bsteigung m dies stiegt y: Folge: xi-x followed sth : [xi=Xi2-zyt (0-25)

Aufgabe 4)

Du arbeitest in einem biochemischen Labor der TU München und hast die Aufgabe, ein spezifisches Protein aus einer Zellkultur zu isolieren und zu charakterisieren. Nutze die unten beschriebenen Techniken, um Dein Ziel zu erreichen.

a)

Beschreibe detailliert, wie Du das Protein unter Verwendung der Größenausschlusschromatographie und der Ionenaustauschchromatographie isolieren würdest. Erläutere die Prinzipien dieser Methoden und wie sie dazu beitragen, Dein Ziel zu erreichen. Welche Vorteile bietet die Kombinationsnutzung der beiden Methoden im Vergleich zur alleinigen Anwendung einer einzigen Methode?

Lösung:

Isolierung eines Proteins mit Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie

Um ein spezifisches Protein aus einer Zellkultur zu isolieren und zu charakterisieren, kann eine Kombination aus Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie verwendet werden. Beide Methoden haben spezifische Prinzipien und Vorteile, die zusammen eine effiziente und präzise Isolierung ermöglichen. Hier ist eine detaillierte Beschreibung, wie diese Methoden angewendet werden:

Größenausschlusschromatographie (SEC)

Prinzip: Die Größenausschlusschromatographie basiert auf der Trennung von Molekülen basierend auf ihrer Größe und ihrem Hydrodynamischen Volumen. Eine Säule ist mit porösen Polymerkügelchen gefüllt. Kleine Moleküle können in die Poren der Kügelchen eindringen und nehmen dadurch einen längeren Weg durch die Säule, während größere Moleküle schneller durch die Säule eluiert werden, da sie die Poren umgehen.

Prozess:

• Die Zellkultur wird zuerst durch Zentrifugation oder Filtration von Zelltrümmern befreit.
• Das geklärte Lysat wird auf die SEC-Säule aufgetragen.
• Die Elution erfolgt mit einem geeigneten Puffer, und die Absorption wird kontinuierlich überwacht (meist bei 280 nm für Proteine).
• Fraktionen, die das gesuchte Protein enthalten, werden gesammelt.

Vorteile: Diese Methode ermöglicht eine schonende Trennung ohne Denaturierung der Proteine und liefert Informationen über die Größe und das Aggregationsverhalten der Moleküle.

Ionenaustauschchromatographie (IEX)

Prinzip: Die Ionenaustauschchromatographie trennt Moleküle basierend auf ihrer Ladung. Proteine werden an einer Säule gebunden, die mit anionischen (für Kationenaustausch) oder kationischen (für Anionenaustausch) Gruppen funktionalisiert ist. Der Elutionsprozess erfolgt durch schrittweise Änderung der Salzkonzentration oder des pH-Werts, um die gebundenen Proteine zu verdrängen.

Prozess:

• Die SEC-Fraktionen, die das gesuchte Protein enthalten, werden auf die IEX-Säule aufgetragen.
• Ein geeigneter Puffer (abhängig vom pI des Proteins) wird verwendet, um das Protein an die Säule zu binden.
• Die Proteine werden durch schrittweise Erhöhung der Salzkonzentration oder Anpassung des pH-Werts eluiert.
• Fraktionen, die das Zielprotein enthalten, werden gesammelt und analysiert.

Vorteile: IEX bietet eine hohe Auflösung und Kapazität und ist besonders nützlich für die Trennung von Proteinen mit ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Ladung.

Kombinationsnutzung der Methoden

Die Kombination beider Methoden verstärkt ihre jeweiligen Vorteile und ermöglicht eine präzisere und effizientere Proteinreinigung:

• Die SEC kann als erster Reinigungsschritt verwendet werden, um grobe Verunreinigungen auf Basis der Größe zu entfernen.
• Die IEX folgt, um die Proteinprobe weiter aufzukonzentrieren und feiner zu trennen basierend auf der Ladung.

Vorteile der Kombination:

• Verbesserte Reinheit: Die kombinierte Anwendung erhöht die Reinheit des Zielproteins, da zwei verschiedene Trennprinzipien genutzt werden.
• Reduzierte Verunreinigungen: Verunreinigungen, die in der SEC nicht getrennt werden konnten, können durch die IEX effektiv entfernt werden.
• Optimierte Ausbeute: Die doppelte Reinigungsschritte minimieren Proteinverluste und verbessern die Gesamtausbeute des reinen Proteins.

Durch die Kombination dieser beiden chromatographischen Methoden kann eine hochreine und gut charakterisierte Proteinprobe aus einer komplexen Zellkultur gewonnen werden, was für nachfolgende biochemische Analysen und Anwendungen von großer Bedeutung ist.

b)

Nachdem Du Dein Zielprotein isoliert hast, musst Du seine Reinheit und Konzentration bestimmen. Lege dar, wie Du dabei vorgehen würdest, indem Du SDS-PAGE und einen Bradford-Assay verwendest. Beschreibe die theoretischen Grundlagen dieser Methoden und welche spezifischen Informationen Du aus jeder Methode gewinnen kannst. Berechne die Proteinkonzentration in Deiner Probe, wenn die Absorption bei 595 nm für die Bradford-Reaktion 0,650 beträgt, unter der Annahme, dass der Extinktionskoeffizient 0,050 µg/µl beträgt (Bradford-Standardkurve: y = 0,050x + 0,010).

Lösung:

Bestimmung der Reinheit und Konzentration des Proteins mittels SDS-PAGE und Bradford-Assay

Nach der Isolierung Deines Zielproteins ist es wichtig, dessen Reinheit und Konzentration zu bestimmen. Dazu eignen sich die SDS-PAGE und der Bradford-Assay hervorragend. Hier ist eine detaillierte Beschreibung, wie Du vorgehst:

SDS-PAGE

Prinzip: Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ermöglicht die Trennung von Proteinen basierend auf ihrer Molekülmasse. Dabei bindet SDS (Natriumdodecylsulfat), ein Detergens, an die Proteine und verleiht ihnen eine gleichmäßige negative Ladung, die proportional zur Länge des Proteinmoleküls ist. Unter Anwendung eines elektrischen Feldes wandern die Proteine durch ein Polyacrylamidgel, wobei kleinere Proteine schneller wandern als größere.

Prozess:

• Probevorbereitung: Dein Protein wird mit einem SDS-Puffer gemischt und erhitzt, um es zu denaturieren.
• Gelaufbereitung: Ein Polyacrylamidgel wird gegossen, und die Proteinprobe wird zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker aufgetragen.
• Elektrophorese: Unter Anlegen eines elektrischen Feldes wandern die Proteine durch das Gel.
• Färbung: Nach der Elektrophorese wird das Gel gefärbt (z.B. mit Coomassie Brilliant Blue) oder durch Western Blot analysiert, um die Proteine sichtbar zu machen.

Gewinnbare Informationen: Die SDS-PAGE erlaubt die Bestimmung der molekularen Masse der Proteine und die Evaluierung der Reinheit. Ein einzelnes, scharfes Band weist auf ein reines Protein hin.

Bradford-Assay

Prinzip: Der Bradford-Assay misst die Proteinkonzentration, indem der Coomassie Brilliant Blue G-250 Farbstoff an Proteine bindet und dabei von braun nach blau wechselt. Die Intensität dieser Farbveränderung, die bei 595 nm gemessen wird, ist proportional zur Proteinkonzentration. Der Extinktionskoeffizient und eine Standardkurve ermöglichen die Berechnung der Proteinmenge in der Probe.

Prozess:

• Probenvorbereitung: Kleine Aliquots der Proteinprobe werden in mehrere Röhrchen gegeben.
• Reaktionsansatz: Das Bradford-Reagenz wird zu den Proben hinzugefügt und eine kurze Inkubation (5-10 Minuten) durchgeführt.
• Messung der Absorption: Die Absorption der Reaktion bei 595 nm wird mittels eines Spektralphotometers gemessen.

Berechnung der Proteinkonzentration: Gegeben ist eine Absorption bei 595 nm von 0,650 und der Extinktionskoeffizient beträgt 0,050 µg/µl (Bradford-Standardkurve: y = 0,050x + 0,010). Wir berechnen die Proteinkonzentration (x) folgendermaßen:

1. Nettoabsorption: Absorptionswert (0,650) abzüglich Leerwert (0,010):A = 0,650 - 0,010 = 0,640
2. Berechnung von x:Setze die Nettoabsorption (0,640) in die Gleichung ein:0,640 = 0,050xLöse nach x auf:x = 0,640 / 0,050 = 12,8 µg/µl

Gewinnbare Informationen: Der Bradford-Assay liefert eine genaue Bestimmung der Proteinkonzentration in Deiner Probe.

Schlussfolgerung

Zusammengefasst ermöglicht die SDS-PAGE die Abschätzung der Reinheit und molekularen Masse des Proteins, während der Bradford-Assay eine genaue Bestimmung der Proteinkonzentration erlaubt. Durch die Kombination dieser Methoden erhältst Du ein umfassendes Bild über den Reinheitsgrad und die Menge des isolierten Proteins.