Introduction to Mammalian Cell Culture (Wahl Tierwissenschaften) - Cheatsheet.pdf

Sterile Arbeitsmethoden und deren Bedeutung

Definition:

Methoden zur Vermeidung von Kontaminationen in Zellkulturen.

Details:

• Verwendung steriler Werkzeuge und Arbeitsflächen.
• Arbeiten unter Laminar-Flow-Haube.
• Händedesinfektion und Tragen von Labormänteln und Handschuhen.
• Autoklavierung und Sterilisation von Materialien.
• Regelmäßige Reinigung der Laborumgebung.

Wachstumscharakteristika von Säugetierzellen

Definition:

Wachstum von Säugetierzellen beschreibt ihre Teilung und Vermehrung in Zellkultur.

Details:

• Wachstumsphasen: Lag-Phase, log-Phase (\textrm{exponentiell}), stationäre Phase
• Verdopplungszeit (\textrm{Doubling Time}): Zeitspanne, in der sich Zellzahl verdoppelt
• Substrathaftung: Viele Säugetierzellen benötigen Adhäsion an Oberflächen
• Medienbedürfnisse: Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Hormone
• Kontaminationsrisiken: Bakterien, Pilze, Mykoplasmen
• Serumzugabe: Häufig für Wachstum benötigt (z.B. FBS)
• Konfluenz: Grad der Flächenbedeckung durch Zellen

Passage von Zellen und Zelllinien

Definition:

Prozess des Transfers von Zellen aus einer Kultur auf frisches Medium, um optimales Wachstum zu gewährleisten.

Details:

• Zellpassage notwendig, um Überkonfluenz und Nährstoffmangel zu verhindern
• Trypsin oder EDTA zum Ablösen der Zellen vom Kulturgefäß
• Neue Kulturgefäße mit frischem Medium vorbereiten
• Wahl des richtigen Zeitpunkts entscheidend (Sub-Konfluenzphase)
• Serielle Passagen können genetische Veränderungen und Differenzierungsverluste verursachen

Kulturmedien und deren Zusammensetzung

Definition:

Kulturmedien sind speziell formulierte Nährlösungen, die das Wachstum und die Erhaltung von Säugetierzellen in vitro ermöglichen.

Details:

• Komponenten: Basalmedien (z.B. DMEM, RPMI-1640), Seren (z.B. FKS), Puffer (z.B. HEPES), Wachstumshormone und Wachstumsfaktoren (z.B. EGF).
• Basalmedien enthalten essentielle Aminosäuren, Vitamine, Ionen (Na\textsuperscript{+}, K\textsuperscript{+}, Ca\textsuperscript{2+}), Glucose und Pufferlösungen.
• Seren, insbesondere fetales Kälberserum (FKS), liefern zusätzliche Wachstumsfaktoren, Hormone, Anheftungsfaktoren und Transportproteine.
• Antibiotika und Antimykotika (z.B. Penicillin-Streptomycin, Amphotericin B) werden zur Kontaminationsvermeidung hinzugegeben.
• Osmolarität und pH-Wert müssen für optimale Zellkulturbedingungen kontrolliert werden (pH typischerweise ~7,4).

Kontamination und deren Vermeidung

Definition:

Kontamination: Unerwünschte Einführung von Mikroorganismen oder chemischen Stoffen in Zellkulturen, die deren Wachstum und Experimenteergebnisse beeinflusst.

Details:

• Kontaminationsquellen: Bakterien, Pilze, Viren, Mykoplasmen, Chemikalien.
• Hauptursachen: Unsaubere Arbeitsbedingungen, kontaminierte Reagenzien oder Geräte, nicht desinfizierte Oberflächen.
• Vermeidungsstrategien: Sterile Arbeitsweise (Laminar-Flow-Hot), regelmäßige Desinfektion, Verwendung von Filtersterilisation, Überprüfung von Reagenzien, Einwegmaterialien.
• Kontrollmethoden: Routinemäßige mikroskopische Überprüfung, mykoplasmen-Schnelltests, PCR-basierte Tests.

Primärkulturen vs. Zelllinien

Definition:

Primärkulturen: Zellen direkt aus Gewebe entnommen. Zelllinien: Unbegrenzt proliferierende Zellen.

Details:

• Primärkulturen behalten ursprüngliche Eigenschaften, begrenzte Lebensdauer.
• Zelllinien sind durch Transformation oder Unsterblichmachung unsterblich gemacht.
• Primärkulturen besser für physiologisch relevante Experimente.
• Zelllinien einfacher zu handhaben, replizierbar.
• Krebszellen oft als Zelllinien.

Genetische Manipulation und Transfektionstechniken

Definition:

Methoden zur Veränderung von genetischem Material in Säugerzellen für verschiedene Studienzwecke.

Details:

• Transfektion: Einbringen von Nukleinsäuren (DNA, RNA) in die Zelle.
• Methoden: Chemische Transfektion (Lipofektion), physikalische Transfektion (Elektroporation), virale Vektoren
• Stabile vs. Transiente Transfektion: Bei stabiler Integration ins Genom, bei transiente vorübergehender Expression.
• CRISPR/Cas9: Genschere zur präzisen Genom-Editierung.
• Selektion: Antibiotikaselektion zur Isolierung stabil transfizierter Zellen.
• Quantifizierung: Messung der Transfektionseffizienz durch Reporter-Gen-Assays (z.B. GFP, Luciferase).

Kryokonservierung von Zellen

Definition:

Langzeitkonservierung von Zellen durch Einfrieren in flüssigem Stickstoff (-196°C); Minimierung von Schäden durch schützende Substanzen wie DMSO.

Details:

• Zellen in Kryovialbehältern lagern.
• Kryoprotektive Agents (z.B. DMSO) verwenden, um Eiskristallbildung zu verhindern.
• Langsames Einfrieren: Abkühlrate ca. -1°C/min.
• Vitrifikation (ultraschnelles Einfrieren) für empfindliche Zellen.
• Lagerung in Flüssigstickstoff: entweder in der Gasphase oder direkt in der Flüssigphase.
• Für's Auftauen: schnelles Erwärmen auf 37°C.
• Nach dem Auftauen Zellen sofort in frisches Medium überführen.