Introduction to Mammalian Cell Culture (Wahl Tierwissenschaften) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

In der Zellkultur ist es von entscheidender Bedeutung, Kontaminationen zu vermeiden, um die Integrität und Validität der Experimente sicherzustellen. Dabei werden sterile Arbeitsmethoden angewendet, wie z.B. die Verwendung steriler Werkzeuge, Arbeiten unter einer Laminar-Flow-Haube, die Desinfektion der Hände sowie das Tragen von Labormänteln und Handschuhen. Zudem werden Materialien autoklaviert und generell gereinigt. Basierend auf diesen Methoden beantwortet die folgenden Fragen:

a)

Erkläre die Funktionsweise und den Nutzen einer Laminar-Flow-Haube in der Zellkultur. Wie trägt sie zur Vermeidung von Kontaminationen bei?

Lösung:

Funktionsweise und Nutzen einer Laminar-Flow-Haube in der Zellkultur

Eine Laminar-Flow-Haube ist ein wesentliches Gerät in der Zellkultur, das maßgeblich zur Vermeidung von Kontaminationen beiträgt. Im Folgenden wird die Funktionsweise und der Nutzen einer Laminar-Flow-Haube detailliert beschrieben:

• Funktionsweise:
  • Eine Laminar-Flow-Haube erzeugt einen gleichmäßigen, unidirektionalen Luftstrom (Laminar-Flow), der durch einen HEPA-Filter (High Efficiency Particulate Air) geleitet wird.
  • Der HEPA-Filter entfernt Partikel und Mikroorganismen aus der Luft mit einer Effizienz von 99.99% für Partikelgrößen von 0.3 Mikrometern und größer.
  • Die gefilterte Luft strömt entweder von oben nach unten (vertikaler Laminar-Flow) oder horizontal (horizontaler Laminar-Flow) über den Arbeitsbereich und verhindert das Eindringen von verunreinigten Luftströmen aus der Umgebung.
• Nutzen:
  • Kontaminationsschutz: Der gleichmäßige Luftstrom verhindert das Eindringen von kontaminierenden Partikeln und Keimen in den Arbeitsbereich, wodurch die Proben und Zellen geschützt bleiben.
  • Arbeitsplatzsterilität: Durch die dauerhafte Zuführung steriler Luft wird der Arbeitsplatz dauerhaft steril gehalten, was die Gesamtsterilität der Zellkulturumgebung erhöht.
  • Arbeitssicherheit: Besonders bei der Arbeit mit biologischen oder potenziell gefährlichen Substanzen schützt die Laminar-Flow-Haube den Anwender vor Exposition gegenüber diesen Substanzen.

Zusammengefasst ist die Laminar-Flow-Haube ein unverzichtbares Gerät in der Zellkultur, das durch die Bereitstellung eines sterilen Arbeitsumfeldes und den Schutz vor Kontaminationen die Integrität und Validität der Experimente sicherstellt.

b)

Beschreibe den Prozess der Autoklavierung. Welche physikalischen Parameter sind dabei entscheidend und wie wirken diese auf kontaminierende Mikroorganismen?

Lösung:

Der Prozess der Autoklavierung und seine physikalischen Parameter

Die Autoklavierung ist eine weit verbreitete Methode zur Sterilisation von Materialien in der Zellkultur. Dabei werden Mikroorganismen durch den Einsatz von gesättigtem Dampf unter hohem Druck abgetötet. Im Folgenden wird der Prozess der Autoklavierung sowie die entscheidenden physikalischen Parameter beschrieben:

• Prozess der Autoklavierung:
  • Materialien, die sterilisiert werden sollen, werden in einen Autoklaven eingebracht. Der Autoklav ist ein druckdichter Behälter, der in der Lage ist, Temperaturen über 100°C zu erzeugen.
  • Der Autoklav wird verschlossen, und Luft wird aus dem Gerät evakuiert, damit gesättigter Wasserdampf einströmen kann. Dies geschieht in der Regel durch einen Vorvakuum-Zyklus oder durch Durchspülen mit Dampf.
  • Sobald der Autoklav mit Dampf gefüllt ist, beginnt die eigentliche Sterilisationsphase, während der der Druck und die Temperatur für eine festgelegte Zeit konstant gehalten werden.
  • Nach Ablauf der Sterilisationszeit wird der Druck im Autoklaven abgebaut und das sterilierte Material kann entfernt werden.
• Entscheidende physikalische Parameter:
  • Temperatur: Die gebräuchlichste Temperatur für die Autoklavierung beträgt 121°C (250°F). In einigen Fällen werden auch Temperaturen von 134°C (273°F) verwendet.
  • Druck: Um die gewünschten Temperaturen zu erreichen, wird ein Druck von gewöhnlich 15 psi (ca. 1 atm über Normaldruck) bei 121°C und 30 psi bei 134°C angewendet.
  • Zeit: Die Zeit, die benötigt wird, um die Materialien vollständig zu sterilisieren, hängt von der Temperatur und dem Druck ab. Bei 121°C dauert der Prozess typischerweise 15-20 Minuten. Bei höherer Temperatur (134°C) kann die Sterilisationszeit auf 3-5 Minuten reduziert werden.
• Wirkung auf Mikroorganismen:
  • Der gesättigte Dampf bei hohen Temperaturen führt zur Denaturierung von Proteinen und Nukleinsäuren in den Mikroorganismen, was zu ihrem Tod führt. Diese Denaturierung ist irreversibel, wodurch die Mikroorganismen nicht mehr lebensfähig sind.
  • Der hohe Druck stellt sicher, dass der Dampf auch schwer zugängliche Bereiche der Materialien erreicht, wodurch eine vollständige Sterilisation sichergestellt wird.

Zusammengefasst spielt die Autoklavierung eine entscheidende Rolle bei der Sterilisation von Materialien in der Zellkultur, indem sie eine Kombination aus hohem Druck und hoher Temperatur verwendet, um Mikroorganismen effektiv abzutöten.

c)

Welche mathematischen Berechnungen sind notwendig, um die Effektivität einer Desinfektionslösung zu bestimmen? Gehe dabei auf die Verdünnungsformel und die relevanten Konzentrationen ein. Falls eine Lagerlösung mit einer Konzentration von 10% auf 0.5% verdünnt werden muss und 1 Liter benötigt wird, wie viel Lagerlösung und wie viel Wasser werden benötigt? Zeige alle Berechnungen.

Lösung:

Berechnung der Effektivität einer Desinfektionslösung

Um die Effektivität einer Desinfektionslösung zu bestimmen und eine Verdünnung korrekt durchzuführen, sind spezifische mathematische Berechnungen erforderlich. Dabei ist besonders die Verdünnungsformel von Bedeutung. Im Folgenden werden die notwendigen Schritte zur Berechnung im Detail beschrieben.

Verdünnungsformel

Die allgemeine Formel für die Verdünnung lautet:

C1 * V1 = C2 * V2

Hierbei bedeuten:

• C1: Konzentration der Lagerlösung (in Prozent)
• V1: Volumen der Lagerlösung (in Millilitern)
• C2: gewünschte Endkonzentration (in Prozent)
• V2: Gesamtvolumen der verdünnten Lösung (in Millilitern)

In unserem Beispiel: Eine Lagerlösung mit einer Konzentration von 10 % (C1) soll auf 0,5 % (C2) verdünnt werden, und es wird 1 Liter (1000 ml) der verdünnten Lösung benötigt (V2). Ziel ist es, das benötigte Volumen der Lagerlösung (V1) zu berechnen.

Setzen wir die bekannten Größen in die Verdünnungsformel ein:

C1 * V1 = C2 * V2 10 % * V1 = 0.5 % * 1000 ml

Um V1 zu berechnen, lösen wir die Gleichung nach V1 auf:

V1 = (C2 * V2) / C1  V1 = (0.5 % * 1000 ml) / 10 %  V1 = (0.005 * 1000 ml) / 0.10  V1 = 5 ml / 0.10  V1 = 50 ml

Es werden also 50 ml der 10%igen Lagerlösung benötigt. Um die Gesamtmenge von 1 Liter (1000 ml) zu erreichen, müssen wir auch die Menge an Wasser berechnen, die hinzugefügt werden muss:

Wasser = Endvolumen - Volumen der Lagerlösung  Wasser = 1000 ml - 50 ml  Wasser = 950 ml

Zusammenfassung

Um 1 Liter einer 0,5 %igen Desinfektionslösung aus einer 10 %igen Lagerlösung herzustellen, werden:

• 50 ml der 10 %igen Lagerlösung
• 950 ml Wasser

benötigt.

d)

Warum ist es wichtig, regelmäßig die Laborumgebung zu reinigen, und welche Rolle spielt die Händedesinfektion in diesem Kontext? Begründe Deine Antwort mit Beispielen aus der Zellkulturpraxis.

Lösung:

Wichtigkeit der regelmäßigen Reinigung der Laborumgebung und die Rolle der Händedesinfektion in der Zellkultur

In der Zellkultur ist die Vermeidung von Kontaminationen entscheidend für die Integrität und Validität der Experimente. Die regelmäßige Reinigung der Laborumgebung und die Händedesinfektion spielen dabei eine zentrale Rolle. Hier sind die Gründe und Beispiele aus der Zellkulturpraxis:

Regelmäßige Reinigung der Laborumgebung

Wichtigkeit:

• Reduzierung von Kontaminationsquellen: Der Arbeitsbereich im Labor kann durch Staub, Hautpartikel und Mikroorganismen kontaminiert werden. Regelmäßige Reinigung minimiert diese Kontaminationsquellen.
• Verlängerung der Lebensdauer von Equipment: Staub und Ablagerungen können Geräte beschädigen und deren Lebensdauer verkürzen. Regelmäßige Reinigung sorgt für eine lange Lebensdauer der Laborgeräte.
• Sicherstellung der Experimentintegrität: Jede Form von Verunreinigung kann die Ergebnisse deiner Experimente beeinflussen und verfälschen. Ein sauberes Arbeitsumfeld ist daher unerlässlich.

Beispiel aus der Zellkulturpraxis: Bei der Arbeit mit empfindlichen Zelllinien können kleinste Kontaminationen zu Zellverlusten oder zu Veränderungen in Wachstumsverhalten und Zellmorphologie führen, was die Interpretation von Ergebnissen stark beeinträchtigt.

Händedesinfektion

Wichtigkeit:

• Vermeidung persönlicher Kontamination: Deine Hände sind eine häufige Quelle für Mikroorganismen. Durch Desinfektion der Hände verhinderst Du, dass diese in den sterilen Arbeitsbereich oder auf die Zellkulturen gelangen.
• Unterbrechung der Kontaminationskette: Selbst wenn Du sterile Handschuhe trägst, müssen Hände vorher desinfiziert werden, um eine Übertragung von Keimen durch fehlerhaften Handschuhwechsel zu vermeiden.
• Schutz der Zellkultur: Handschuhe können durchbrochen oder kontaminiert werden, und eine gründliche Händedesinfektion bietet eine zusätzliche Sicherheitsbarriere für deine Zellkulturen.

Beispiel aus der Zellkulturpraxis: Bei der Passage von Zellen oder der Durchführung einer Transfektion sind Deine Hände häufig in der Nähe offener Zellkulturgefäße. Eine gründliche Händedesinfektion verringert das Risiko, dass Mikroben in die Kultur gelangen und die Zellkultur kontaminieren.

Zusammenfassung

Die regelmäßige Reinigung der Laborumgebung und die sorgfältige Händedesinfektion sind wesentliche Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen in der Zellkultur. Diese Praktiken gewährleisten die Integrität der Experimente und tragen entscheidend zu zuverlässigen und reproduzierbaren Ergebnissen bei.

Aufgabe 2)

Du arbeitest in einem Labor und untersuchst das Wachstum von Säugetierzellen. Du kultivierst die Zellen in verschiedenen Medien und beobachtest deren Wachstum über mehrere Tage. Dabei misst Du die Zellzahl und protokollierst die Wachstumsphasen sowie die benötigten Nährstoffe. Deine Aufgabe ist es, die Daten zu analysieren und die notwendigen Berechnungen durchzuführen, um die wichtigen Parameter des Zellwachstums zu bestimmen.

a)

Erkläre die verschiedenen Wachstumsphasen, die Du in einer typischen Zellkultur beobachten würdest. Beschreibe dabei die Lag-Phase, die log-Phase (exponentiell) und die stationäre Phase im Detail.

Lösung:

Das Zellwachstum in einer typischen Zellkultur lässt sich in mehrere Phasen unterteilen, die jeweils unterschiedliche Charakteristika aufweisen. Diese Phasen sind Lag-Phase, log-Phase (exponentiell) und stationäre Phase.

• Lag-Phase: In der Lag-Phase oder Anlaufphase passen sich die Zellen an die neuen Kulturbedingungen an. Dies umfasst die Anpassung an das Kulturmedium, die Temperatur und andere Umweltbedingungen. In dieser Phase findet nur wenig oder kein Zellwachstum statt, da die Zellen zuerst ihre Stoffwechselprozesse anpassen und notwendige Enzyme synthetisieren müssen. Diese Phase kann je nach Zelltyp und Kulturbedingungen unterschiedlich lang dauern.
• Log-Phase (exponentiell): Nach der Anpassungsphase treten die Zellen in die Log-Phase oder exponentielle Wachstumsphase ein. In dieser Phase teilen sich die Zellen regelmäßig und die Zellzahl verdoppelt sich in konstanten Zeitintervallen. Das Wachstum erfolgt exponentiell, was bedeutet, dass die Zellzahl im Verlauf der Zeit rapide zunimmt. Diese Phase ist durch optimale Nährstoffversorgung und minimale Abfallstoffakkumulation gekennzeichnet.
• Stationäre Phase: Irgendwann, wenn die Nährstoffe erschöpft sind und sich Abfallprodukte angesammelt haben, erreicht die Zellkultur die stationäre Phase. In dieser Phase ist die Teilungsrate der Zellen gleich der Sterberate, sodass die Gesamtzellzahl konstant bleibt. Die Zellen sind metabolisch aktiv, aber das Wachstum ist eingeschränkt durch die Verfügbarkeit von Nährstoffen und die Ansammlung von toxischen Metaboliten.

c)

Erläutere die Bedeutung der Substrathaftung für Säugetierzellen und bewerte, wie die Ausstellung von Nährstoffen und anderen Komponenten des Kulturmediums die Substrathaftung und das Zellwachstum beeinflussen.

Lösung:

Die Substrathaftung ist ein wichtiger Faktor für das Wachstum von Säugetierzellen in Kultur. Sie bezeichnet die Fähigkeit der Zellen, sich an die Oberfläche des Kulturgefäßes zu heften. Diese Haftung ist essenziell für die meisten Säugetierzellen, da sie auf adhärente Bedingungen angewiesen sind, um zu wachsen, zu proliferieren und ihre spezifischen Funktionen auszuführen.

Bedeutung der Substrathaftung:

• Zellproliferation: Viele Säugetierzellen benötigen die Interaktion mit einer festen Oberfläche, um Signale zu erhalten, die für die Zellteilung notwendig sind. Ohne diese Haftung können Zellen in den programmierten Zelltod (Apoptose) eintreten.
• Differenzierung: Die Haftung an einer Oberfläche kann auch die Differenzierung, also die Spezialisierung der Zellen, beeinflussen. Bestimmte Signale, die durch den Kontakt der Zellen mit dem Substrat vermittelt werden, können die Genexpression und somit die Zellfunktion verändern.
• Die Haftung beeinflusst die Zellform und Struktur. Angeheftete Zellen haben oft eine flächige, ausgebreitete Form, die notwendig ist, um engere Zell-Zell-Interaktionen und Gewebestrukturen zu bilden.

Einfluss von Nährstoffen und anderen Komponenten des Kulturmediums auf die Substrathaftung und das Zellwachstum:

• Ausreichende Mengen an essenziellen Nährstoffen wie Glukose, Aminosäuren, Vitaminen und Mineralstoffen sind entscheidend für das Wachstum und die Funktion von Säugetierzellen. Ein Mangel oder Ungleichgewicht dieser Nährstoffe kann die Zellproliferation beeinträchtigen und somit auch indirekt die Substrathaftung beeinflussen, da die Zellen möglicherweise nicht die nötige Energie oder Bausteine zur Verfügung haben.
• Wachstumsfaktoren wie EGF (Epidermal Growth Factor) oder FGF (Fibroblast Growth Factor) können die Zellhaftung und -proliferation signifikant beeinflussen. Diese Faktoren binden an spezifische Rezeptoren auf der Zelloberfläche und initiieren Signalwege, die das Zellwachstum und die Haftung fördern.
• Viele Kulturmedien enthalten Serum, das eine Vielzahl von Proteinen, Hormonen und Wachstumsfaktoren enthält, die das Zellwachstum und die Haftung fördern. Fibronektin und Kollagen sind Beispiele für adhäsionsproteine, die die Substrathaftung der Zellen verbessern.
• Bestandteile der extrazellulären Matrix (ECM) wie Kollagen, Laminin und Fibronektin im Kulturmedium oder als Beschichtung des Kulturgefäßes können die Adhäsion von Zellen verbessern. Diese Moleküle binden an spezifische Rezeptoren auf den Zelloberflächen und verstärken die Bindung der Zellen an das Substrat.
• Der pH-Wert und die Osmolarität des Kulturmediums müssen innerhalb bestimmter Grenzen gehalten werden, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten. Abweichungen können die Zelladhäsion und das Wachstum negativ beeinflussen.

Zusammengefasst ist die Substrathaftung entscheidend für das Wachstum von Säugetierzellen in Kultur, und die Nährstoffe sowie andere Komponenten des Kulturmediums spielen eine wesentliche Rolle bei der Unterstützung dieser Haftung und des Zellwachstums.

d)

Diskutiere die Risiken von Kontaminationen (Bakterien, Pilze, Mykoplasmen) in der Zellkultur. Welche Maßnahmen kannst Du ergreifen, um solche Kontaminationen zu vermeiden? Gehe auch auf die Bedeutung der Serumzugabe im Kulturmedium ein und erkläre, warum FBS (Fötales Kälberserum) häufig verwendet wird.

Lösung:

Risiken von Kontaminationen in der Zellkultur

Kontaminationen in der Zellkultur stellen ein erhebliches Risiko dar, da sie die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen und das Wachstum und die Gesundheit der Zellen negativ beeinflussen können. Zu den häufigsten Kontaminationsquellen zählen:

• Bakterien: Bakterielle Kontamination kann zu einer trüben Kulturflüssigkeit führen und das Zellwachstum hemmen oder vollständig verhindern. Bakterien vermehren sich schnell und können toxische Metaboliten freisetzen.
• Pilze (Schimmel und Hefen): Pilzkontaminationen manifestieren sich oft durch schwebende Sporen oder auffälligen Schimmelrasen auf der Oberfläche des Mediums. Sie können ebenfalls das Zellwachstum beeinträchtigen und Toxine freisetzen.
• Mykoplasmen: Mykoplasmen sind besonders gefährlich, da sie schwer zu erkennen sind. Sie beeinflussen das Zellwachstum und Zellstoffwechsel und können genetische und biochemische Eigenschaften der Zellen verändern.

Maßnahmen zur Vermeidung von Kontaminationen

Um Kontaminationen zu vermeiden, sollten folgende Maßnahmen beachtet werden:

• Aseptische Techniken: Arbeiten unter steril Bedingungen, zum Beispiel in einer sterilen Werkbank (Laminar-Flow-Haube), und die Verwendung von sterilen Instrumenten sind essenziell.
• Regelmäßige Desinfektion: Flächen, Geräte und Hände sollten regelmäßig desinfiziert werden. Ethanol (70 %) ist ein gängiges Desinfektionsmittel für diesen Zweck.
• Filtration von Medien: Medien und Lösungen sollten durch Bakterien-abweisende Filter (0,2 μm) filtriert werden, um mikrobiologische Verunreinigungen zu entfernen.
• Verwendung von Antibiotika: Die Zugabe von Antibiotika (z.B. Penicillin, Streptomycin) kann helfen, bakterielle Kontaminationen zu verhindern. Allerdings sollten Antibiotika nicht als Ersatz für gute aseptische Techniken verwendet werden.
• Regelmäßige Überprüfung: Regelmäßige mikroskopische Untersuchungen und spezifische Tests (PCR, DAPI-Färbung) sollten durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Mykoplasmen und anderen Kontaminanten zu überprüfen.

Bedeutung der Serumzugabe im Kulturmedium

Serum ist ein wichtiger Bestandteil vieler Kulturmedien, da es eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, Hormonen, Proteinen und anderen Komponenten enthält, die das Zellwachstum und die Zelladhäsion fördern.

Warum FBS (Fötales Kälberserum) häufig verwendet wird

Fötales Kälberserum (FBS) ist besonders beliebt, da es:

• Reich an Wachstumsfaktoren ist: FBS enthält eine hohe Konzentration an Wachstumsfaktoren, die für das Wachstum und die Proliferation der Zellen essenziell sind.
• Geringere Immunreaktionen hervorruft: Da FBS von fötalen Kälbern stammt, enthält es weniger Antikörper und andere immunologische Faktoren, die Zellkulturen stören könnten.
• Universell einsetzbar ist: FBS unterstützt das Wachstum einer Vielzahl von Zelltypen, was es zu einem vielseitigen Ergänzungsmittel in der Zellkultur macht.

Zusammengefasst sind eine strenge Einhaltung von aseptischen Techniken, regelmäßige Überprüfungen und die verantwortungsbewusste Verwendung von FBS zentrale Komponenten, um das Risiko von Kontaminationen zu minimieren und optimale Zellkulturbedingungen zu gewährleisten.

Aufgabe 3)

Du befindest Dich in einem Zellkulturlabor und bist dafür verantwortlich, die Zellpassage einer etablierten Zelllinie durchzuführen, um Überkonfluenz zu verhindern und das optimale Zellwachstum zu gewährleisten. Dabei musst Du die Methode des Transfers von Zellen aus einer Kultur auf frisches Medium anwenden.

• Der Einsatz von Trypsin oder EDTA ist notwendig, um Zellen vom Kulturgefäß abzutrennen.
• Es ist wichtig, den richtigen Zeitpunkt für die Zellpassage zu wählen, der in der Sub-Konfluenzphase liegt.
• Serielle Passagen können langfristig genetische Veränderungen und Differenzierungsverluste bei den Zellen verursachen.

a)

Teil A: Beschreibe den detaillierten Ablauf der Zellpassage und erläutere, wie Du den richtigen Zeitpunkt für die Zellpassage erkennst. Gehe dabei auf die Bedeutung der Sub-Konfluenzphase ein und erkläre, warum diese Phase optimal für die Zellpassage ist.

Lösung:

Teil A: Der detaillierte Ablauf der Zellpassage umfasst mehrere Schritte, die genau befolgt werden müssen, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Die Zellpassage ist eine wichtige Technik, die eingesetzt wird, um Zellen vom Kulturgefäß zu lösen und auf frisches Medium zu übertragen.

• 1. Vorbereitung: Stelle sicher, dass alle notwendigen Materialien wie Trypsin/EDTA, frisches Medium, Pipetten, Sterilfilter und Kulturgefäße griffbereit sind und unter sterilen Bedingungen arbeiten.
• 2. Sterilisation: Desinfiziere alle Arbeitsflächen und Arbeitsgeräte, um eine kontaminationsfreie Umgebung zu schaffen. Trage sterile Handschuhe und einen Laborkittel.
• 3. Medium entfernen: Entferne das alte Kulturmedium vorsichtig aus dem Kulturgefäß, ohne die Zellen zu stören.
• 4. Zellen waschen: Wasche die Zellen mit einer sterilen Lösung (z.B. PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung), um Reste des alten Mediums zu entfernen.
• 5. Trypsin/EDTA-Zugabe: Gib eine ausreichende Menge Trypsin-EDTA-Lösung hinzu, um die Zellen vom Kulturgefäß abzutrennen. Inkubiere für ein paar Minuten bei Temperaturen von etwa 37°C bis die Zellen abgerundet sind und sich ablösen.
• 6. Inaktivierung von Trypsin: Füge frisches Medium, das Serum enthält, hinzu, um die Trypsinwirkung zu stoppen.
• 7. Zellzählung und Verdünnung: Zähle die Zellen und verdünne sie auf die gewünschte Dichte mit frischem Medium.
• 8. Plattieren der Zellen: Überführe die Zellen in neue Kulturgefäße mit frischem Medium, und platziere sie in den Inkubator.

Die Bedeutung des richtigen Zeitpunkts für die Zellpassage liegt darin, dass die Zellen in der Sub-Konfluenzphase (bevor sie vollständig konfluenz sind) ihr optimales Wachstum und ihre Vitalität aufweisen. In dieser Phase teilen sich die Zellen aktiv, ohne dass es zu Platzmangel oder Nährstofferschöpfung kommt. Überkonfluente Zellen (d.h. wenn sie zu dicht wachsen) neigen dazu, sich weniger effizient zu teilen und können genetische Veränderungen oder Differenzierungsverluste aufweisen.

• Wie erkennt man die Sub-Konfluenzphase? Überwache das Zellwachstum regelmäßig mithilfe eines Mikroskops. Sub-konfluente Zellen bedecken etwa 70-80% der Oberfläche des Kulturgefäßes und haben ausreichend Platz, um sich weiter zu teilen.
• Warum ist die Sub-Konfluenzphase optimal? In dieser Wachstumsphase sind die Zellen am vitalsten und teilen sich regelmäßig. Passagen in dieser Phase stellen sicher, dass die Zellen auch nach der Passage ihre optimale Gesundheit und Wachstumsgeschwindigkeit beibehalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Zellpassage in der Sub-Konfluenzphase durchgeführt werden sollte, um eine hohe Zellvitalität und gleichmäßiges Wachstum sicherzustellen sowie genetische Stabilität und Differenzierungsfähigkeit der Zellpopulation zu bewahren.

Aufgabe 4)

Das Verständnis der Zusammensetzung und Funktion von Kulturmedien ist essenziell für die erfolgreiche Kultivierung von Säugetierzellen in vitro. Kulturmedien enthalten verschiedene Komponenten, darunter Basalmedien wie DMEM und RPMI-1640, die essentielle Aminosäuren, Vitamine, Ionen, Glucose und Pufferlösungen umfassen. Seren wie fetales Kälberserum (FKS) liefern zusätzliche Wachstumsfaktoren, Hormone, Anheftungsfaktoren und Transportproteine. Darüber hinaus werden häufig Antibiotika und Antimykotika zur Kontaminationsvermeidung hinzugefügt. Ein optimaler Zellkulturbedingungen erfordert die Kontrolle der Osmolarität und des pH-Werts, wobei letzterer typischerweise bei ~7,4 liegt.

a)

Erkläre die Rolle von Basalmedien in der Zellkultur und beschreibe die Funktionen der in ihnen enthaltenen Komponenten (essentielle Aminosäuren, Vitamine, Ionen, Glucose und Pufferlösungen).

Lösung:

Basalmedien spielen eine zentrale Rolle in der Zellkultur, da sie die grundlegende Nährstoffversorgung für das Zellwachstum und das Überleben bereitstellen. Hier sind die spezifischen Funktionen der in Basalmedien enthaltenen Komponenten:

• Essentielle Aminosäuren: Diese sind notwendig für die Proteinsynthese und den Zellstoffwechsel. Da Säugetierzellen nicht alle Aminosäuren selbst synthetisieren können, müssen sie über das Kulturmedium zugeführt werden.
• Vitamine: Vitamine wirken als Coenzyme und Kofaktoren in verschiedenen enzymatischen Reaktionen. Sie unterstützen grundlegende Zellfunktionen wie Wachstum, Differenzierung und Stoffwechselprozesse.
• Ionen: Ionen wie Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium sind essenziell für die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase, die Aktivität von Enzymen und die Aufrechterhaltung des Membranpotenzials. Sie tragen auch zur osmotischen Balance der Zellen bei.
• Glucose: Glucose dient als primäre Energiequelle für die Zellen. Sie wird durch Glykolyse und den Zitronensäurezyklus metabolisiert, um ATP zu produzieren, welches für verschiedene Zellfunktionen verwendet wird.
• Pufferlösungen: Pufferlösungen, wie zum Beispiel Natriumbikarbonat, helfen dabei, den pH-Wert des Kulturmediums zu stabilisieren. Ein stabiler pH-Wert ist entscheidend für die Zellaktivität und das Wachstum, typischerweise wird ein pH-Wert von ~7,4 angestrebt.

b)

Berechne die molare Konzentration von Natriumionen (Na\textsuperscript{+}) in einem Kulturmedium, wenn 1 Liter DMEM eine Natriumionenkonzentration von 140 mM aufweist.

Nutze die Beziehung:

n = C * V

wobei n die Stoffmenge in Mol, C die molare Konzentration in mol/L und V das Volumen in Litern ist.

Lösung:

Um die molare Konzentration der Natriumionen (Na\textsuperscript{+}) in einem Kulturmedium zu berechnen, wenn 1 Liter DMEM eine Natriumionenkonzentration von 140 mM aufweist, verwenden wir die Beziehung:

n = C * V

Hierbei ist:

• n die Stoffmenge in Mol
• C die molare Konzentration in mol/L (oder Molar)
• V das Volumen in Litern

Gegeben sind:

• C = 140 mM = 140 mmol/L = 0.140 mol/L
• V = 1 Liter

Setzen wir dies in die Gleichung ein:

n = 0.140 mol/L * 1 L

Ergibt:

n = 0.140 mol

Die molare Konzentration der Natriumionen (Na\textsuperscript{+}) in 1 Liter DMEM beträgt somit 0.140 mol.

c)

Diskutiere die Bedeutung von fetalem Kälberserum (FKS) für die Zellkultur und erläutere, welche Bestandteile von FKS speziell zur Förderung des Zellwachstums beitragen.

Lösung:

Fetales Kälberserum (FKS) spielt eine bedeutende Rolle in der Zellkultur, da es eine Vielzahl von Komponenten enthält, die das Zellwachstum und -überleben in vitro fördern. Hier sind die Hauptbestandteile und deren spezifische Funktionen:

• Wachstumsfaktoren: FKS enthält eine Reihe von Wachstumsfaktoren, wie z.B. epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF). Diese Faktoren stimulieren die Zellproliferation und Differenzierung.
• Hormone: Hormone wie Insulin und Hydrocortison sind in FKS enthalten. Sie regulieren den Zellstoffwechsel und unterstützen das Wachstum und die Anpassungsfähigkeit der Zellen.
• Anheftungsfaktoren: Anheftungsfaktoren wie Fibronektin und Vitronectin fördern die Anhaftung von Zellen an die Kulturoberfläche und tragen zur Bildung eines stabilen Zellrasens bei.
• Transportproteine: Serumalbumin und Transferrin sind Beispiele für Transportproteine, die essentielle Nährstoffe und Mineralien zu den Zellen transportieren und somit deren Verfügbarkeit sicherstellen.
• Zusätzliche Nährstoffe und Vitamine: FKS ergänzt das Basalmedium mit zusätzlichen Nährstoffen und Vitaminen, die für optimalen Zellstoffwechsel und Wachstum notwendig sind.

Durch diese vielfältigen Komponenten verbessert FKS deutlich die Lebensfähigkeit, das Wachstum und die Differenzierungsfähigkeit von Säugetierzellen in der Zellkultur. Es stellt eine nahezu unersetzliche Ergänzung dar, um optimale Kulturbedingungen zu schaffen.

d)

Warum ist die Kontrolle von Osmolarität und pH-Wert in der Zellkultur entscheidend? Beschreibe die möglichen Auswirkungen von Abweichungen dieser Parameter auf die Zellen.

Lösung:

Die Kontrolle von Osmolarität und pH-Wert in der Zellkultur ist entscheidend für das Wohlbefinden und die optimale Funktion von Säugetierzellen. Hier sind die Gründe und die Auswirkungen von Abweichungen dieser Parameter:

• Osmolarität: Die Osmolarität bezieht sich auf die Anzahl der gelösten Teilchen in der Lösung. Eine zu hohe oder zu niedrige Osmolarität kann osmotischen Stress verursachen, was zu Zellschäden oder -tod führen kann.
  • Wenn die Osmolarität zu hoch ist (hypertonische Bedingungen), kann Wasser aus den Zellen austreten, wodurch sie schrumpfen und dehydrieren. Dies kann die Zellfunktion beeinträchtigen und letztlich zum Zelltod führen.
  • Wenn die Osmolarität zu niedrig ist (hypotonische Bedingungen), kann Wasser in die Zellen eindringen, was zu einer Schwellung und möglicherweise zu einem Platzen der Zellen führt (Lyse).
• pH-Wert: Der pH-Wert ist ein Maß für den Säure- oder Basengehalt einer Lösung. Ein optimaler pH-Wert für die meisten Säugetierzellen liegt bei etwa 7,4.
  • Ein pH-Wert, der zu hoch ist (alkalisch), kann die Proteinfunktion und -struktur beeinträchtigen und die Enzymaktivität stören. Dies kann das Zellwachstum verlangsamen und den Stoffwechsel negativ beeinflussen.
  • Ein pH-Wert, der zu niedrig ist (sauer), kann ebenfalls die Aktivität und Stabilität von Enzymen und Proteinen beeinträchtigen, was zu schädlichen Veränderungen der Zellphysiologie und letztlich zum Zelltod führen kann.

Insgesamt können Abweichungen in der Osmolarität und im pH-Wert zu schwerwiegenden Zellschäden, einer verminderten Zellfunktionen und einer erhöhten Zellsterblichkeit führen. Daher ist die sorgfältige Kontrolle dieser Parameter entscheidend, um stabile und optimale Kulturbedingungen zu gewährleisten.