Aufgabe 1)

Im Kontext der Pflanzenbiotechnologie ist die CRISPR-Cas9 Technik eine revolutionäre Genomeditierungsmethode, die zur präzisen Modifikation von DNA-Sequenzen eingesetzt wird. Diese Technik nutzt die Cas9-Protein-Nuklease und eine spezifische Leit-RNA (gRNA), um gezielte DNA-Schnitte zu setzen. Dabei bestimmt die Leit-RNA genau die Stelle, an der Cas9 die DNA schneidet. Des Weiteren ermöglicht diese hohe Genauigkeit eine Vielzahl von Anwendungen in der Pflanzenzucht, einschließlich der Entwicklung krankheitsresistenter Sorten und der Verbesserung des Ertrags. Trotz dieser Vorteile gibt es jedoch auch ökologische und ethische Bedenken, die mit der Anwendung dieser Technik verbunden sind.

a)

Beschreibe den Mechanismus der CRISPR-Cas9 Technik in Pflanzenbiotechnologie. Erkläre, wie die Cas9-Protein-Nuklease und die Leit-RNA zusammenwirken, um DNA zu schneiden. Warum ist die Leiter-RNA ein entscheidender Faktor für die Genauigkeit des Prozesses?

Lösung:

Beschreibe den Mechanismus der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenbiotechnologie

• CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) ist ein System, das in Bakterien als adaptive Immunabwehr gegen Viren entdeckt wurde.
• Die Cas9-Protein-Nuklease ist ein Enzym, das gezielte DNA-Schnitte durchführen kann.

Zusammenspiel von Cas9-Protein-Nuklease und Leit-RNA:

• Die Leit-RNA (gRNA) besteht aus zwei Komponenten: der CRISPR-RNA (crRNA), die die Zielsequenz identifiziert, und der trans-aktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA), die zur Stabilität beiträgt.
• Das Cas9-Protein bindet an die gRNA und bildet einen Komplex.
• Die gRNA führt diesen Komplex zur Ziel-DNA-Sequenz aufgrund der komplementären Basenpaarung.
• Nach dem Erkennen der Zielsequenz verursacht Cas9 einen Doppelstrangbruch in der DNA.

Genauigkeit des Prozesses durch die Leit-RNA:

• Die gRNA bestimmt genau, an welcher Stelle die DNA geschnitten wird, da sie eine Sequenz enthält, die komplementär zur Ziel-DNA ist.
• Diese Präzision ist entscheidend, um spezifische Gene zu bearbeiten, ohne benachbarte DNA-Sequenzen zu beeinträchtigen.
• Durch die hohe Spezifität der gRNA wird das Risiko von Off-Target-Effekten minimiert.

Die CRISPR-Cas9 Technik hat große Bedeutung in der Pflanzenbiotechnologie, da sie ermöglicht, gezielt Gene zu bearbeiten, um verbesserte Pflanzensorten zu entwickeln.

c)

Diskutiere die möglichen Anwendungen der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenzucht. Nenne mindestens drei spezifische Beispiele und erläutere die potenziellen Vorteile und Herausforderungen jeder Anwendung.

Lösung:

Mögliche Anwendungen der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenzucht

Die CRISPR-Cas9 Technik hat das Potenzial, die Pflanzenzucht revolutionär zu verändern. Hier sind drei spezifische Beispiele für Anwendungen und die damit verbundenen Vorteile und Herausforderungen:

1. Entwicklung von krankheitsresistenten Sorten

• Vorteile:
  • Durch gezielte Modifikation von Genen, die für Krankheitsanfälligkeit verantwortlich sind, können Pflanzen resistent gegen Pilze, Viren und Bakterien gemacht werden.
  • Reduziert den Bedarf an chemischen Pestiziden, was Umwelt und Gesundheit zugutekommt.
  • Verbesserte Ernteerträge durch gesündere Pflanzen.
• Herausforderungen:
  • Ökologische Auswirkungen: Die Einführung krankheitsresistenter Pflanzen könnte die natürliche Umweltbalance stören.
  • Ethik: Es gibt Bedenken hinsichtlich der ethischen Aspekte der genetischen Modifikation und der möglichen langfristigen Auswirkungen auf die Biodiversität.

2. Verbesserung des Ertrags und der Nährstoffgehalte

• Vorteile:
  • Durch gezielte Veränderungen in den Genen, die das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze steuern, können höhere Erträge erzielt werden.
  • Erhöhung des Nährstoffgehalts in wichtigen Grundnahrungsmitteln wie Reis und Weizen kann zur Lösung von Nährstoffmangelproblemen beitragen.
  • Reduziert die Notwendigkeit für chemische Düngemittel und verbessert somit die Nachhaltigkeit der Landwirtschaft.
• Herausforderungen:
  • Regulatorische Hürden: Genetisch veränderte Pflanzen unterliegen strengen Tests und Genehmigungsverfahren.
  • Akzeptanz: Es gibt Widerstand gegen gentechnisch veränderte Organismen (GVO) in bestimmten Märkten und unter Konsumenten.

3. Anpassung an Klimawandel

• Vorteile:
  • Man kann Pflanzen so modifizieren, dass sie unter extremen klimatischen Bedingungen wie Dürre oder Überschwemmungen besser gedeihen.
  • Erhöht die Lebensmittelsicherheit in Regionen, die stark vom Klimawandel betroffen sind.
  • Fördert die Entwicklung nachhaltiger landwirtschaftlicher Praktiken, die weniger Wasser und andere Ressourcen benötigen.
• Herausforderungen:
  • Komplexität: Das Verständnis und die gezielte Modifikation aller Gene, die an der Stressresistenz beteiligt sind, ist komplex und zeitaufwändig.
  • Langfristige Auswirkungen: Die langfristigen ökologischen und genetischen Auswirkungen solcher Modifikationen sind noch nicht vollkommen verstanden.

Abschließend lässt sich sagen, dass die CRISPR-Cas9 Technik ein enormes Potenzial zur Verbesserung der Pflanzenzucht hat. Es ist jedoch wichtig, sowohl die Vorteile als auch die Herausforderungen sorgfältig abzuwägen, um nachhaltige und ethisch vertretbare Lösungen zu entwickeln.

d)

Analysiere und diskutiere die ökologischen und ethischen Bedenken, die mit dem Einsatz der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenbiotechnologie verbunden sind. Erörtere mögliche Risiken und wie diese gemildert werden könnten.

Lösung:

Ökologische und ethische Bedenken beim Einsatz der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenbiotechnologie

Die Anwendung der CRISPR-Cas9 Technik in der Pflanzenbiotechnologie bringt sowohl große Vorteile als auch Bedenken mit sich. Im Folgenden werden die ökologischen und ethischen Bedenken sowie mögliche Risiken und deren Minderung diskutiert:

Ökologische Bedenken

• Verdrängung natürlicher Arten:
  • Genetisch modifizierte Pflanzen könnten potenziell einheimische Arten verdrängen, was die Biodiversität negativ beeinflusst.
  • Minderung: Extensive Feldversuche und umfassende ökologische Bewertungen vor der Zulassung neuer Sorten können hierzu beitragen.
• Off-Target-Effekte:
  • Es besteht das Risiko, dass unbeabsichtigte Änderungen im Genom erfolgen, die unerwartete ökologische Auswirkungen haben können.
  • Minderung: Die Verbesserung der Spezifität und Genauigkeit der gRNA-Sequenzen sowie gründliche Labor- und Feldtests können helfen, dieses Risiko zu minimieren.
• Herbizidresistenz:
  • CRISPR-Cas9 könnte zur Entwicklung von Pflanzen führen, die gegen Herbizide resistent sind. Dies könnte zum vermehrten Einsatz von Herbiziden führen, was die Umweltbelastung erhöht.
  • Minderung: Die Regulierung des Einsatzes von Herbiziden und die Entwicklung von Alternativen zu chemischen Sprays sind essentiell.

Ethische Bedenken

• Eingriffe in die natürliche Ordnung:
  • Es gibt ethische Bedenken bezüglich des Eingriffs in die natürliche Genetik von Pflanzen, was als unnatürlich und beunruhigend empfunden werden kann.
  • Minderung: Eine offene Diskussion in der Gesellschaft und unter Einbeziehung ethischer Experten kann helfen, diese Bedenken zu adressieren.
• Sozioökonomische Auswirkungen:
  • Es besteht die Gefahr, dass kleine Landwirte durch den Anbau von patentierten CRISPR-veränderten Pflanzen benachteiligt werden.
  • Minderung: Faire Patentrichtlinien und die Förderung zugänglicher Technologien können hier Abhilfe schaffen.
• Transparenz und Information:
  • Konsumenten haben oft Bedenken hinsichtlich der Sicherheit und Herkunft genetisch veränderter Lebensmittel.
  • Minderung: Transparente Kennzeichnung und umfassende Informationen über die Vorteile und Risiken solcher Technologien sind notwendig.

Schlussfolgerung

Während die CRISPR-Cas9 Technik bedeutende Fortschritte in der Pflanzenbiotechnologie ermöglicht, dürfen ökologische und ethische Bedenken nicht ignoriert werden. Ein verantwortungsbewusster Umgang, einschließlich gründlicher wissenschaftlicher Forschung, regulatorischer Maßnahmen und gesellschaftlicher Diskussionen, ist essentiell, um die Risiken zu mindern und die Vorteile dieser Technologie voll auszuschöpfen.

Aufgabe 2)

Du hast eine neue Pflanzenart entdeckt und möchtest aus dieser Pflanzenzellen unter sterilen Bedingungen kultivieren. Der Fokus liegt auf der Etablierung einer stabilen Kalluskultur zur weiteren genetischen Transformation und Langzeitlagerung der Pflanzenlinien.

a)

Erkläre den grundlegenden Prozess der Sterilisation und beschreibe die zwei Hauptmethoden zur Mediensterilisation. Welche Bedeutung hat die Sterilisation in der Pflanzenzellkultur?

Lösung:

Grundlegender Prozess der Sterilisation:Sterilisation ist ein wichtiger Prozess zur Eliminierung von Mikroorganismen, wie Bakterien, Pilzen und Viren, die das Wachstum und die Gesundheit der Pflanzenkulturen beeinträchtigen könnten. In der Pflanzenzellkultur wird die Sterilisation verwendet, um sicherzustellen, dass die Nährmedien, Werkzeuge und Umgebung frei von Kontaminationen sind.

• Prozess der Sterilisation:
  • Vorbereitung: Alle benötigten Materialien und Medien werden vorbereitet.
  • Sterilisation: Materialien werden mit geeigneten Methoden sterilisiert.
  • Nachsterilisation: Materialien werden unter sterilen Bedingungen gehandhabt, um eine Kontamination zu vermeiden.

Zwei Hauptmethoden zur Mediensterilisation:1. Dampfsterilisation (Autoklavieren): Dieses Verfahren verwendet gesättigten Dampf unter hohem Druck. Der Standardparameter für die Autoklavierung ist 121°C bei 15 psi Druck für 15-20 Minuten.2. Filtersterilisation: Diese Methode wird für temperaturempfindliche Lösungen verwendet. Dabei werden Medien durch Membranfilter mit kleinen Porengrößen (z.B. 0,22 Mikrometer) geleitet, um Mikroorganismen zu entfernen.Bedeutung der Sterilisation in der Pflanzenzellkultur:Die Sterilisation hat wesentliche Bedeutungen in der Pflanzenzellkultur:

• Verhinderung der Kontamination von Kulturen durch Mikroorganismen.
• Förderung des ungestörten Wachstums der Pflanzenzellen.
• Sicherstellung der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Experimente.
• Erhöhung der Erfolgschancen bei der Etablierung von Kalluskulturen und genetischen Transformationen.

b)

Wähle ein geeignetes Explantat für die Kalluskultur einer verstärkt verholzten Pflanze aus und erläutere die Schritte zur Initiierung und Aufrechterhaltung der Kalluskultur unter Einsatz von Auxinen und Cytokininen.

Lösung:

Auswahl eines geeigneten Explantats:Für die Kalluskultur einer verstärkt verholzten Pflanze ist ein geeigneter Explantat die junge, noch nicht vollständig verholzte Blatt- oder Sprossachse. Diese Gewebe haben ein hohes Potenzial zur Zellteilung und sind daher gut für die Kallusbildung geeignet.Schritte zur Initiierung und Aufrechterhaltung der Kalluskultur:

• Vorbereitung des Explantats:
  • Wähle gesunde, unreife Blätter oder Sprossachsen.
  • Wasche das ausgewählte Explantat gründlich mit destilliertem Wasser.
  • Sterilisiere das Explantat, z.B. durch Eintauchen in 70% Ethanol für 30 Sekunden und anschließend in eine 10-20%ige Bleichlösung (Natriumhypochlorit) für 10-15 Minuten.
  • Spüle das Explantat mehrere Male mit sterilem destilliertem Wasser, um alle Rückstände des Sterilisationsmittels zu entfernen.
• Initiierung der Kalluskultur:
  • Schneide das sterilisierte Explantat in kleine Stücke (ca. 0,5-1 cm).
  • Platziere die Explantate auf einem Nährmedium, das mit einer geeigneten Konzentration an Auxinen und Cytokininen ergänzt ist. Ein gängiges Medium könnte Murashige und Skoog (MS) Medium sein.
  • Ein typisches Verhältnis von Auxin zu Cytokinin für die Kallusinduktion liegt bei 2,4-D (Auxin) 2 mg/L und BAP (Cytokinin) 0,5 mg/L.
  • Inkubiere die Kulturen im Dunkeln bei kontrollierter Temperatur (ca. 25°C) für mehrere Wochen, bis sich Kallusgewebe bildet.
• Aufrechterhaltung der Kalluskultur:
  • Überschiebe die gebildeten Kallusstücke regelmäßig (alle 3-4 Wochen) auf frisches Nährmedium, um ein gesundes Wachstum zu gewährleisten.
  • Überprüfe und passe die Konzentrationen von Auxinen und Cytokininen an, um das gewünschte Wachstumsmuster (proliferierend oder differenzierend) zu fördern. Wenn eine fortlaufende Proliferation gewünscht ist, halte das Verhältnis von Auxin zu Cytokinin konstant.
  • Lagere die Kulturen unter sterilen Bedingungen, um eine Kontamination zu vermeiden.
  • Falls erforderlich, lagere die Kalluskulturen langfristig durch Gefriertrocknung oder Lagerung in flüssigem Stickstoff.

c)

Die Transformation von Pflanzenzellen mittels Agrobakterien ist eine übliche Methode in der Pflanzenbiotechnologie. Beschreibe detailliert den Prozess des Agrobakterien-vermittelten T-DNA-Transfers und erkläre, wie dies zur genetischen Modifikation der Kalluskultur führen kann.

Lösung:

Prozess des Agrobakterien-vermittelten T-DNA-Transfers:Die Transformation von Pflanzenzellen mittels Agrobakterien ist eine weit verbreitete Methode zur genetischen Modifikation. Der Prozess des T-DNA-Transfers (Transfer-DNA) erfolgt wie folgt:

• Vorbereitung der Agrobakterien:
  • Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes enthalten ein spezielles Plasmid, das sogenannte Ti-Plasmid (Tumor-inducing Plasmid) oder Ri-Plasmid (Root-inducing Plasmid).
  • Das Ti-Plasmid enthält die T-DNA, das Segment, das in die Pflanzenzelle übertragen werden soll, sowie Vir-Gene (Virulenz-Gene), die für die Übertragung der T-DNA auf die Pflanzenzelle notwendig sind.
  • Die T-DNA wird durch eine Klonierung manipuliert und mit dem gewünschten Gen oder den gewünschten Genen versehen.
• Infektion der Pflanzenzellen:
  • Die präparierten Agrobakterien werden verwendet, um die Pflanzenexplantate, wie z.B. die Kalluskultur, zu infizieren.
  • Die Explantate werden in eine Suspension von Agrobakterien getaucht oder gemeinsam auf einem festen Medium ko-kultiviert.
• Transfer der T-DNA:
  • Bei Kontakt mit den Pflanzenzellen wird unter dem Einfluss der Vir-Gene die T-DNA aus dem Ti-Plasmid herausgeschnitten und als T-DNA-Komplex in die Pflanzenzelle übertragen.
  • Einmal in der Pflanzenzelle, wird die T-DNA in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
• Auswahl und Regeneration:
  • Nach der Infektion werden die Pflanzenexplantate auf ein Selektionsmedium übertragen, das ein Antibiotikum oder ein Herbizid enthält, das nur die transformierten Zellen überleben können.
  • Die überlebenden transgenen Kalluszellen werden dann auf ein Regenerationsmedium überführt, das das Wachstum und die Differenzierung der Pflanzenzellen fördert, um ganze transgene Pflanzen zu regenerieren.

Genetische Modifikation der Kalluskultur:Durch den Agrobakterien-vermittelten T-DNA-Transfer wird das gewünschte Gen oder die gewünschten Gene in das Erbgut der Pflanzenzellen integriert. Dies führt zu den folgenden Ergebnissen:

• Expression neuer Gene: Die integrierten Gene werden in der Pflanzenzelle exprimiert, was zu neuen oder veränderten Eigenschaften der Pflanze führen kann, wie z.B. Resistenz gegen Krankheiten, Herbizide oder verbesserte Wachstumsraten.
• Stabile Transformation: Da die T-DNA in das Genom der Pflanzen integriert wird, wird die genetische Modifikation an die Tochterzellen weitergegeben, wodurch eine stabile, genetisch veränderte Kalluskultur entsteht.

d)

Für die Langzeitlagerung der transformierten Pflanzenlinien entscheidest Du Dich für Kryokonservierung. Beschreibe den Ablauf dieser Methode und erkläre, warum -196°C in flüssigem Stickstoff verwendet werden.

Lösung:

Ablauf der Kryokonservierung:Kryokonservierung ist eine effektive Methode zur Langzeitlagerung von Pflanzenzellen, bei der lebende Zellen, Gewebe oder Organe bei extrem niedrigen Temperaturen aufbewahrt werden, um ihre Lebensfähigkeit über lange Zeiträume zu erhalten. Der Ablauf dieser Methode umfasst die folgenden Schritte:

• Vorbereitung der Zellen:
  • Ernte von gesundem und aktiv wachsendem Kallusgewebe oder anderen Pflanzenzellen.
  • Vorbehandlung der Zellen mit Kryoprotektoren (z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerin, oder Saccharose), um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, die die Zellmembranen zerstören könnten.
  • Konkret könnte dies durch Inkubation der Zellen in einer Lösung erfolgen, die den Kryoprotektor in geeigneter Konzentration enthält (typisch 5-10%).
• Vorkühlung:
  • Langsame Vorkühlung der Zellen auf etwa -40°C bis -80°C. Dieser Schritt dient dazu, eine kontrollierte Dehydration und eine Reduktion der Zellaktivität zu ermöglichen.
  • Dies kann durch Platzierung der Zellen in einem programmierbaren Gefrierschrank oder mithilfe eines isopropanolhaltigen Kühlblocks in einem normalen Gefrierschrank erreicht werden.
• Schockgefrierung:
  • Schnelles Abkühlen der Zellen auf die endgültige Lagerstemperatur von -196°C durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. Dies sorgt für eine sofortige Hemmung aller zellulären Stoffwechselvorgänge.
• Langzeitlagerung:
  • Langfristige Aufbewahrung der gekühlten Zellen in flüssigem Stickstoff oder im Dampfphase über flüssigem Stickstoff, um die Zellen über viele Jahre hinweg funktionsfähig zu halten.
• Aufwärmen und Wiederherstellung:
  • Zum Zeitpunkt der Nutzung werden die Zellen schnell aufgetaut, normalerweise durch schnelles Eintauchen in ein warmes Wasserbad (bei etwa 37°C), um Schäden durch Eiskristallbildung während des Auftauens zu minimieren.
  • Entfernung von Kryoprotektoren und allmähliche Rehydrierung durch Übertragung auf geeignete Kulturmedien.

Warum -196°C in flüssigem Stickstoff verwendet wird:Die Temperatur von -196°C in flüssigem Stickstoff wird verwendet, weil sie tief genug ist, um alle biologischen und chemischen Prozesse in den Zellen nahezu vollständig zu stoppen. Dies hat mehrere wichtige Vorteile:

• Minimierung des Stoffwechsels: Bei -196°C sind alle biochemischen Reaktionen praktisch zum Stillstand gekommen, was verhindert, dass die Zellen altern oder sich zersetzen.
• Verhinderung der Eiskristallbildung: Die extrem niedrige Temperatur sorgt dafür, dass kein freies Wasser in den Zellen existiert, das zu Eiskristallen gefrieren könnte. Eiskristalle könnten die Zellmembranen und andere zelluläre Strukturen zerstören.
• Langzeitstabilität: Die Zellen können in diesem Zustand über sehr lange Zeiträume hinweg unbeschadet gelagert werden, was sie ideal für Langzeitprojekte und die Erhaltung genetischer Ressourcen macht.

Aufgabe 3)

Du bist Forscher in einem Labor, das transgene Pflanzen entwickelt hat. Du sollst die phänotypischen Unterschiede zwischen den transgenen Pflanzen und einer Kontrollgruppe bewerten. Zu diesem Zweck untersuchst Du die Merkmale Wachstum, Blattform und Resistenz gegen einen spezifischen Pathogen. Du verwendest Bildgebungstechnologien zur quantitativen Phänotypisierung und statistische Methoden zur Analyse der Daten.

a)

Beschreibe den Prozess der quantitativen Phänotypisierung von Wachstum und Blattform mithilfe von Bildgebungstechnologien. Welche Schritte sind notwendig und welche Software könnte genutzt werden? Welche Messgrößen würdest Du erheben und wie würdest Du aus den Bildern eine zuverlässige Analyse ableiten?

Lösung:

Die quantitative Phänotypisierung von Wachstum und Blattform mithilfe von Bildgebungstechnologien erfordert mehrere sorgfältig geplante Schritte. Hier ist eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitung:

• Schritt 1: Bildaufnahme Zunächst machst Du Aufnahmen der Pflanzenproben. Dazu verwendest Du eine hochauflösende Kamera oder einen Scanner. Die Pflanzen sollten von verschiedenen Winkeln aufgenommen werden, um eine umfassende Analyse zu gewährleisten.
• Schritt 2: Bildvorverarbeitung Sobald die Bilder aufgenommen sind, müssen diese eventuell vorverarbeitet werden. Dazu gehört die Anpassung von Helligkeit, Kontrast und Farbabgleich sowie das Entfernen von Hintergrundrauschen. Software wie Adobe Photoshop oder kostenlose Alternativen wie GIMP können dabei hilfreich sein.
• Schritt 3: Bildsegmentierung Die Pflanzen müssen dann im Bild von ihrem Hintergrund getrennt werden. Dies kann durch automatisierte Algorithmen zur Bildsegmentierung erfolgen, die Du in Software wie ImageJ oder MATLAB finden kannst. Durch Segmentierung werden die relevanten Teile der Pflanze isoliert.
• Schritt 4: Merkmalsextraktion Aus den segmentierten Bildern extrahierst Du nun Merkmale wie Blattfläche, Anzahl der Blätter und das Wachstum. ImageJ verfügt über Plugins, die die Messung von Blattfläche und der Länge von Pflanzen erleichtern. Für komplexere Analysen kannst Du auch Python-Pakete wie OpenCV einsetzen.
• Schritt 5: Quantitative Messungen Wichtige Messgrößen könnten die Gesamthöhe der Pflanze, die durchschnittliche Blattfläche, die Anzahl der Blätter und die Biomasse sein. Diese werden entweder manuell oder automatisiert durch die Software berechnet.
• Schritt 6: Datenanalyse Die gesammelten Daten werden statistisch analysiert, um Unterschiede zwischen den transgenen Pflanzen und der Kontrollgruppe zu ermitteln. Software wie R oder Python mit pandas und scipy Bibliotheken kann für statistische Tests verwendet werden.
• Schritt 7: Ergebnisinterpretation Schließlich interpretierst Du die Ergebnisse und erstellst Berichte. Diagramme und Grafiken können in Tools wie R (ggplot2) oder Python (matplotlib, seaborn) erstellt werden, um die Unterschiede visuell darzustellen.

Zusammenfassung: Der gesamte Prozess der quantitativen Phänotypisierung besteht aus mehreren Schritten: Bildaufnahme, Vorverarbeitung, Segmentierung, Merkmalsextraktion, Quantifizierung und Datenanalyse. Erforderliche Software könnte unter anderem ImageJ, MATLAB, Python (mit OpenCV, pandas, scipy) sowie statistische Analysewerkzeuge wie R umfassen. Wichtige Messgrößen sind Pflanzenhöhe, Blattfläche, Anzahl der Blätter und Biomasse.

Aufgabe 4)

In Deiner Rolle als Pflanzenbiotechnologe an der TU München, wirst Du beauftragt eine Zellkultur zu entwickeln, die das Wachstum von Tabakzellen in vitro fördert. Dazu musst Du das richtige Kulturmedium formulieren und die optimalen Bedingungen für das Wachstum sicherstellen. Du hast folgende Informationen: Das Basismedium beinhaltet Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine sowie Zucker. Die Makronährstoffe umfassen die Elemente Stickstoff (N), Phosphor (P), Kalium (K), Schwefel (S), Calcium (Ca) und Magnesium (Mg). Die Mikronährstoffe umfassen Eisen (Fe), Mangan (Mn), Zink (Zn), Kupfer (Cu), Bor (B), Molybdän (Mo) und Chlor (Cl). An Vitaminen werden Thiamin, Nicotinsäure und Pyridoxin verwendet. Organische Zusätze wie Aminosäuren und Pflanzenwachstumsregulatoren (zum Beispiel Auxine und Cytokinine) sind ebenfalls wichtig. Der optimale pH-Wert des Mediums liegt zwischen 5.6 und 5.8 und Sterilität bei der Zubereitung und Handhabung ist notwendig.

a)

Berechne das Verhältnis der Makronährstoffe Stickstoff (N), Phosphor (P) und Kalium (K) im Kulturmedium, wenn das Verhältnis in der Lösung 3:1:2 sein soll. Geben Sie die jeweiligen Massen in g/L an, wenn insgesamt 6 g dieser drei Makronährstoffe im Medium vorhanden sein sollen.

Lösung:

Berechnung des Verhältnisses der Makronährstoffe

In dieser Übung musst Du das Verhältnis der Makronährstoffe Stickstoff (N), Phosphor (P) und Kalium (K) im Kulturmedium bestimmen, wenn das Verhältnis 3:1:2 sein soll und insgesamt 6 g dieser drei Makronährstoffe im Medium vorhanden sein sollen.

Schritte zur Lösung

• Schritt 1: Bestimme das gesamte Verhältnis der Anteile: 3 + 1 + 2 = 6 Teile
• Schritt 2: Berechne die Masse jedes Makronährstoffs anhand des Verhältnisses:

• Stickstoff (N):
• Verhältnisanteil: 3
• Masseanteil: \(\frac{3}{6} \) * 6 g = 3 g
• Phosphor (P):
• Verhältnisanteil: 1
• Masseanteil: \(\frac{1}{6} \) * 6 g = 1 g
• Kalium (K):
• Verhältnisanteil: 2
• Masseanteil: \(\frac{2}{6} \) * 6 g = 2 g

Endergebnis:

• Die Massenanteile der Makronährstoffe Stickstoff (N), Phosphor (P) und Kalium (K) im Kulturmedium sind:

• Stickstoff (N): 3 g/L
• Phosphor (P): 1 g/L
• Kalium (K): 2 g/L

b)

Erkläre die Bedeutung der Sterilität in der Kulturtechnik und beschreibe mindestens drei Methoden, die verwendet werden können, um Sterilität im Labor zu gewährleisten. Welche Konsequenzen könnten auftreten, wenn das Medium und die Geräte nicht steril sind?

Lösung:

Bedeutung der Sterilität in der Kulturtechnik

In der Zellkulturtechnik ist Sterilität von entscheidender Bedeutung, um Kontaminationen durch Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze und Viren zu verhindern. Diese Kontaminationen könnten das Wachstum der gewünschten Pflanzenzellen hemmen, sowohl durch direkten Befall als auch durch die Konkurrenz um Nährstoffe. Daher muss sichergestellt werden, dass sowohl das Kulturmedium als auch alle verwendeten Geräte steril sind.

Methoden zur Sicherstellung der Sterilität

• Autoklavieren: Dies ist eine weit verbreitete Methode zur Sterilisation, bei der hohe Temperaturen und Druck verwendet werden. Der Autoklav erreicht typischerweise Temperaturen von 121°C bei einem Druck von etwa 15 psi über einen Zeitraum von 15 bis 20 Minuten. Diese Methode tötet effektiv Sporen und pathogene Mikroorganismen ab.
• Filtrationssterilisation: Diese Methode wird häufig verwendet, um hitzeempfindliche Lösungen zu sterilisieren. Dabei werden Filter mit einer Porengröße von 0,22 Mikrometern verwendet, um Bakterien und Pilze aus der Flüssigkeit zu entfernen. Dies ist besonders nützlich für die Sterilisation von Nährmedien und Vitaminen.
• UV-Bestrahlung: UV-Strahlen werden eingesetzt, um Oberflächen und Luft im Labor zu desinfizieren. UV-Lampen können in Laminar-Flow-Hauben installiert werden, wo sie helfen, die Umgebung steril zu halten, indem sie Mikroorganismen in der Luft und auf der Arbeitsfläche abtöten.

Konsequenzen einer fehlenden Sterilität

Wenn das Kulturmedium und die Geräte nicht steril sind, können mehrere schwerwiegende Probleme auftreten:

• Kontamination: Bakterien, Pilze und andere Mikroorganismen können das Wachstum der Tabakzellen beeinträchtigen oder vollständig verhindern.
• Verfälschte Ergebnisse: Kontamination kann die Ergebnisse der Experimente beeinflussen, da die Daten durch das unkontrollierte Wachstum der Mikroorganismen verzerrt werden.
• Ressourcenverlust: Verunreinigte Kulturen müssen entsorgt werden, was zu einem Verlust von Zeit, Materialien und finanziellen Mitteln führt.
• Gesundheitsrisiken: Einige Mikroorganismen können potenziell gesundheitsschädlich für Laborpersonal sein, insbesondere wenn es sich um pathogenes Material handelt.

Daher ist die Einhaltung strenger steriler Techniken unerlässlich, um die Integrität der Forschung und die Sicherheit im Labor zu gewährleisten.