Plant Epigenectics and Epigenomics (Wahl Genomik/Biostatistik) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression, genomischen Prägung und X-Inaktivierung. Diese Methylierungen, die oft an CpG-Dinukleotiden vorkommen, können durch verschiedene Mechanismen und Enzyme wie DNA-Methyltransferasen vererbt werden. In Pflanzen können die Methylierungsmuster nicht nur durch Zellteilung, sondern auch durch Generationswechsel weitergegeben werden. Dabei kombinieren sich Prozesse der De-novo-Methylierung und der Erhaltungsmethylierung, um Methylierungsmuster zu erhalten und anzupassen. Besonders wichtig sind diese Mechanismen für Entwicklungsprozesse und Stressantworten in Pflanzen.

a)

Beschreibe den Mechanismus der De-novo-Methylierung und benenne mindestens ein Enzym, das daran beteiligt ist. Gehe auch darauf ein, in welchem Kontext solche De-novo-Methylierungen in Pflanzen auftreten können.

Lösung:

Mechanismus der De-novo-Methylierung:

• Bei der De-novo-Methylierung wird eine neue Methylgruppe an die DNA angehängt, ohne dass vorher eine Methylierung an dieser Stelle vorhanden war.
• Dieser Vorgang wird von spezifischen Enzymen, den sogenannten DNA-Methyltransferasen, durchgeführt.
• Ein wichtiges Enzym, das an der De-novo-Methylierung beteiligt ist, ist die DNA Methyltransferase 3 (DNMT3). Bei Pflanzen wird diese Funktion oft von den Enzymen DRM2 (Domains Rearranged Methyltransferase 2) übernommen.

Kontext der De-novo-Methylierung in Pflanzen:

• De-novo-Methylierungen treten häufig während der embryonalen Entwicklung auf, um spezifische Gene zu aktivieren oder zu silenzieren.
• Diese Methylierungsmuster können auch als Reaktion auf Umweltstress aufgebaut werden, um die Pflanze besser auf zukünftige Stresssituationen vorzubereiten.
• Ein weiteres Beispiel ist die genomische Prägung, bei der bestimmte Gene je nach elterlicher Herkunft unterschiedlich methyliert und somit verschieden exprimiert werden.
• De-novo-Methylierungen tragen zur Anpassung der Pflanze an veränderte Umweltbedingungen bei, indem sie zur Regulierung wichtiger Gene beitragen.

b)

Erkläre den Unterschied zwischen De-novo-Methylierung und Erhaltungsmethylierung. Welches Enzym ist hauptsächlich für die Erhaltungsmethylierung verantwortlich? Wie garantiert dieses Enzym die Vererbung der Methylierungsmuster während der Zellteilung?

Lösung:

Unterschied zwischen De-novo-Methylierung und Erhaltungsmethylierung:

• De-novo-Methylierung: Bei der De-novo-Methylierung werden neue Methylgruppen an nicht methylierten DNA-Stellen hinzugefügt. Dies passiert oft während der frühen Entwicklung oder als Reaktion auf Umweltveränderungen, um neue Methylierungsmuster zu etablieren. Ein Beispiel für ein Enzym, das an diesem Prozess beteiligt ist, ist DRM2 (Domains Rearranged Methyltransferase 2).
• Erhaltungsmethylierung: Die Erhaltungsmethylierung sorgt dafür, dass bestehende Methylierungsmuster bei der Zellteilung beibehalten werden. Diese Methylierung tritt an Stellen auf, die bereits methyliert waren, und stellt sicher, dass die „Methylierungssignatur“ von der Mutterzelle an die Tochterzellen weitergegeben wird.

Enzym für Erhaltungsmethylierung:

• Das Hauptenzym, das für die Erhaltungsmethylierung verantwortlich ist, ist DNA Methyltransferase 1 (DNMT1).

Vererbung der Methylierungsmuster während der Zellteilung:

• Während der DNA-Replikation werden die DNA-Stränge aufgeteilt und kopiert, wobei eine neue Tochter-DNA gebildet wird. Die ursprünglichen Methylierungsstellen befinden sich nur auf dem ursprünglichen Mutter-DNA-Strang.
• DNMT1 erkennt diese hemimethylierten Stellen, das heißt, Stellen, an denen der Mutterstrang methyliert ist und der Tochterstrang noch nicht. Es fügt eine Methylgruppe an den Tochterstrang gegenüber der bereits methylierten Cytosin-Stelle im Mutterstrang hinzu.
• Durch diese Aktivität stellt DNMT1 sicher, dass die Methylierungsmuster exakt auf die Tochterzellen übertragen werden, wodurch die epigenetische Information während der Zellteilung beibehalten wird.

c)

Die genomische Prägung ist ein epigenetisches Phänomen, das stark von DNA-Methylierung abhängt. Erläutere, was genomische Prägung ist und wie Methylierungsmuster dabei eine Rolle spielen. Nenne ein Beispiel für ein Prägungsgen in Pflanzen oder Tieren.

Lösung:

Genomische Prägung:

• Genomische Prägung ist ein epigenetisches Phänomen, bei dem bestimmte Gene abhängig von ihrer elterlichen Herkunft unterschiedlich exprimiert werden.
• Dies bedeutet, dass nur das Allel eines bestimmten Elternteils aktiv ist, während das andere Allel stillgelegt oder „geprägt“ ist.
• Diese Prägung ist eine Form der Genregulation, die ohne Veränderungen der DNA-Sequenz erfolgt und durch epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung und Modifikationen von Histonen gesteuert wird.

Rolle der Methylierungsmuster bei der genomischen Prägung:

• DNA-Methylierung spielt eine Schlüsselrolle bei der genomischen Prägung, indem sie spezifische Gene inaktiviert.
• Die Methylgruppen werden an CpG-Dinukleotide in der DNA hinzugefügt, was die Bindung von Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen verhindert, die zur Genexpression notwendig sind.
• Durch die Methylierung wird das prägungsabhängige Gen stillgelegt, während das unprägende Allel aktiv bleibt.
• Diese Methylierungsmuster werden während der Gametogenese etabliert und in den Nachkommen im Verlauf der Zellteilung beibehalten.

Beispiel für ein Prägungsgen:

• Ein bekanntes Prägungsgen in Tieren ist das Igf2 (Insulin-like growth factor 2)-Gen bei Mäusen.
• Bei Pflanzen gibt es auch Beispiele wie das FIS2 (Fertilization Independent Seed 2)-Gen bei Arabidopsis thaliana.
• Das Igf2-Gen wird nur vom väterlichen Allel exprimiert, während das mütterliche Allel durch Methylierung stillgelegt ist. Dies spielt eine wichtige Rolle im Wachstum und in der Entwicklung des Fötus.

d)

Die Methylierung von CpG-Dinukleotiden ist statistisch betrachtet nicht zufällig über das Genom verteilt. Wenn Du eine Pflanze hast, bei der bekannt ist, dass 70% der CpG-Stellen methyliert sind, berechne die Wahrscheinlichkeit, dass in einem Segment von 10 aufeinander folgenden CpG-Stellen genau 7 methyliert sind. Nutze dazu die Binomialverteilung.

Lösung:

Berechnung der Wahrscheinlichkeit mit der Binomialverteilung:

• Wir wollen die Wahrscheinlichkeit berechnen, dass in einem Segment von 10 aufeinander folgenden CpG-Stellen genau 7 methyliert sind.
• Hierbei verwenden wir die Binomialverteilung, die durch die folgende Formel beschrieben wird:

 \[ P(X = k) = \binom{n}{k} \times p^k \times (1 - p)^{n - k} \] 

• In dieser Formel bedeuten:
• P(X = k): Die Wahrscheinlichkeit, dass genau k Erfolge in n Versuchen auftreten.
• n: Die Anzahl der Versuche (in diesem Fall 10).
• k: Die Anzahl der Erfolge (hier 7).
• p: Die Erfolgswahrscheinlichkeit in einem einzelnen Versuch (70% oder 0,7).
• \( \binom{n}{k} \): Der Binomialkoeffizient, berechnet als:

 \[ \binom{n}{k} = \frac{n!}{k!(n - k)!} \] 

• Setzen wir die Werte ein:

 \[ \binom{10}{7} = \frac{10!}{7!(10 - 7)!} = \frac{10 \times 9 \times 8}{3 \times 2 \times 1} = 120 \] 

• Nun setzen wir die Werte in die Hauptformel ein:

 \[ P(X = 7) = 120 \times (0.7)^7 \times (0.3)^3 \] 

• Berechnen der Einzelwerte:

 \[ (0.7)^7 \approx 0.0823543 \] \[ (0.3)^3 = 0.027 \] 

• Multiplikation der Einzelwerte:

 \[ P(X = 7) = 120 \times 0.0823543 \times 0.027 \approx 0.2668 \] 

• Die Wahrscheinlichkeit, dass in einem Segment von 10 CpG-Stellen genau 7 methyliert sind, beträgt also etwa 26,68%.

Aufgabe 2)

Histon-Modifikationen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression, indem sie die Chromatinstruktur modifizieren und die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine verändern. Zu den wichtigsten Modifikationen gehören die Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung von Histonen. Diese Modifikationen können je nach Art, Muster und Ort unterschiedliche Auswirkungen auf die Genexpression haben. Die Histon-Code-Hypothese besagt, dass eine spezifische Kombination von Histonmodifikationen für bestimmte chromatinbezogene Funktionen verantwortlich ist.

a)

Beschreibe den Einfluss der Acetylierung von Histon-Proteinen auf die Chromatinstruktur und die Genexpression. Gehe dabei auch auf die biochemischen Veränderungen ein, die durch die Acetylierung hervorgerufen werden.

Lösung:

Acetylierung von Histon-Proteinen und ihre Auswirkungen auf die Chromatinstruktur und die Genexpression:

• Biochemische Veränderungen:
• Die Acetylierung von Histonen erfolgt hauptsächlich an den Lysinresten der Histon-Tails. Spezifische Enzyme, die Histonacetyltransferasen (HATs), fügen Acetylgruppen (-COCH₃) an diese Lysinreste hinzu.
• Dieses biochemische Ereignis neutralisiert die positive Ladung der Lysinreste, da Acetylgruppen keine Ladung tragen. Durch die Reduktion der positiven Ladung verringert sich die elektrostatische Bindung der Histone an die negativ geladene DNA.
• Auswirkungen auf die Chromatinstruktur:
• Durch die verringerte positive Ladung der Histone wird die Bindung an die DNA gelockert. Dies führt zu einer weniger dichten Chromatinstruktur, die als euchromatin bezeichnet wird.
• Lockereres Chromatin ist zugänglicher für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine, die für die Genexpression notwendig sind.
• Auswirkungen auf die Genexpression:
• Die Acetylierung fördert im Allgemeinen die Genexpression, da die lockerere Chromatinstruktur es den Transkriptionsfaktoren und der RNA-Polymerase ermöglicht, leichter auf die DNA zuzugreifen und die Transkription zu initiieren.
• Histon-Acetylierung wird oft als Aktivierungsmarker für die Genexpression angesehen.

b)

Erläutere den Unterschied zwischen der Methylierung an den Histon-Proteinen bezüglich der Aktivierung und Repression der Genexpression. Wie beeinflusst der unterschiedliche Methylierungsort und das -muster die Genexpression? Gib konkrete Beispiele, wenn möglich.

Lösung:

Unterschied zwischen der Methylierung an den Histon-Proteinen bezüglich der Aktivierung und Repression der Genexpression:

• Biochemische Grundlagen:
• Die Methylierung von Histonen erfolgt hauptsächlich an den Lysin- (K) und Argininresten (R) der Histon-Tails. Spezifische Enzyme, die Histonmethyltransferasen (HMTs), fügen Methylgruppen (CH₃) an diese Aminosäuren hinzu.
• Histone können mono-, di- oder trimethyliert werden, was zu unterschiedlichen funktionellen Effekten führt.
• Unterschiedliche Auswirkungen auf die Genexpression:
• Aktivierung der Genexpression:
• Die Methylierung von Histon H3 an Lysin 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3) ist meist mit aktiver Genexpression assoziiert. Diese Modifikationen dienen als Bindungsstellen für Proteine, die die Transkription fördern.
• Zum Beispiel dient H3K4me3 als Erkennungsstelle für den Chromodomänen-Teil der Transkriptionselongationsfaktoren, die die Transkription durch RNA-Polymerase II unterstützen.
• Repression der Genexpression:
• Die Methylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me2, H3K9me3) und Histon H3 an Lysin 27 (H3K27me2, H3K27me3) ist mit Genrepression assoziiert. Diese Modifikationen ziehen Proteine an, die die Chromatinstruktur verdichten und die DNA unzugänglich machen.
• Konkretes Beispiel: H3K27me3 rekrutiert Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), der die Chromatinverdichtung und Genstillege fördert.
• Einfluss des Methylierungsorts und -musters:
• Der spezifische Ort und das Muster der Methylierung bestimmen, welche Proteine an das Chromatin binden können und wie die Struktur verändert wird.
• Beispiel: H3K4me3 führt zur Aktivierung von Genen in Promotorregionen, während H3K9me3 zur Stilllegung von Genen in perizentrischen Heterochromatinbereichen führt.

c)

Die Histon-Code-Hypothese besagt, dass eine spezifische Kombination von Histonmodifikationen für bestimmte Funktionen verantwortlich ist. Diskutiere diese Hypothese und beschreibe, wie Phosphorylierung und Ubiquitinierung an den Histonen zur Regulation der Genexpression und anderen zellulären Prozessen beitragen. Verwende dabei auch Beispiele aus aktuellen Studien.

Lösung:

Diskussion der Histon-Code-Hypothese:

• Die Histon-Code-Hypothese besagt, dass spezifische Kombinationen von chemischen Modifikationen an den Histon-Tails eine bestimmte biologische Wirkung haben. Diese Modifikationen könnten als ein 'Code' betrachtet werden, der die Chromatinstruktur und somit die Genexpression reguliert.
• Besondere Kombinationen von Modifikationen, wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung, interagieren miteinander und beeinflussen die Bindung von Chromatin-assoziierten Proteinen.
• Gemäß dieser Hypothese könnten bestimmte 'Codes' gezielt für aktivierende oder repressierende Zustände verantwortlich sein und somit vielfältige biologische Prozesse steuern.

Beitrag der Phosphorylierung zur Regulation der Genexpression und anderer zellulärer Prozesse:

• Die Phosphorylierung von Histonen erfolgt hauptsächlich an Serin- (S), Threonin- (T) und Tyrosinresten (Y), vermittelt durch spezifische Enzyme namens Kinasen.
• Ein bekanntes Beispiel ist die Phosphorylierung von Histon H3 an Serin 10 (H3S10ph), die aktivitätsabhängig mit Genexpression assoziiert ist.
• Phosphorylierung von H3S10 ist während der Mitose signifikant und trägt zur Chromosomenkondensation bei. Sie wird durch die Aurora-B-Kinase vermittelt.
• Studien zeigen, dass die Phosphorylierung von H2AX an Serin 139 (γ-H2AX) eine frühe Antwort auf DNA-Schäden ist und die Rekrutierung von DNA-Reparaturproteinen fördert.

Beitrag der Ubiquitinierung zur Regulation der Genexpression und anderer zellulärer Prozesse:

• Die Ubiquitinierung betrifft typischerweise die K48- und K63-Lysine der Histon-Tails. Sie wird durch DUBs (deubiquitylating enzymes) wieder rückgängig gemacht.
• Ein Beispiel ist die Monoubiquitinierung von Histon H2B an Lysin 120 (H2Bub1), die mit Transkriptionselongation und DNA-Reparatur assoziiert ist. Sie erleichtert ebenfalls die nachfolgende Methylierung von H3K4 und H3K79, was zu aktiver Genexpression beiträgt.
• Die Ubiquitinierung von H2A an Lysin 119 (H2Aub1) hingegen ist häufig mit der Repression der Genexpression verknüpft und wird durch das Polycomb-Repressive-Complex 1 (PRC1) vermittelt.
• Aus titand aktueller Studien geht hervor, dass die Ubiquitinierung von Histonen eine Rolle bei der DNA-Schadensantwort und Chromosomendynamik spielt.

Aufgabe 3)

Chromatin-Remodellierung und deren Bedeutung: Chromatin-Remodellierung beschreibt die dynamische Umstrukturierung des Chromatins, welche die Genexpression, DNA-Reparatur und Replikation ermöglicht. Chromatin kann zwischen dicht gepacktem Heterochromatin und lockerem Euchromatin wechseln. Zu den wichtigsten Mechanismen zählen ATP-abhängige Chromatin-Remodellierungskomplexe, Histon-Modifikationen (wie Methylierung und Acetylierung) sowie der Austausch von Histonvarianten. Diese Prozesse regulieren die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und andere DNA-bindende Proteine. In der Pflanzenepigenetik ist die Chromatin-Remodellierung besonders bedeutsam, da sie Pflanzen ermöglicht, flexibel auf Umweltveränderungen zu reagieren und die epigenetische Regulation der Genexpression zu kontrollieren. Zu den wichtigen experimentellen Techniken zur Untersuchung der Chromatinstruktur gehören ChIP-Seq und ATAC-Seq. Epigenetische Markierungen sind erblich, aber reversibel, sie können verändert werden, ohne die DNA-Sequenz zu ändern.

a)

Erläutere, wie ATP-abhängige Chromatin-Remodellierungskomplexe die Struktur des Chromatins verändern. Gehe dabei insbesondere auf die energetischen Aspekte ein, die diesen Prozess ermöglichen.

Lösung:

ATP-abhängige Chromatin-Remodellierungskomplexe:

• Funktionsweise: ATP-abhängige Chromatin-Remodellierungskomplexe sind spezielle Proteinkomplexe, die die Struktur des Chromatins verändern, indem sie Energie aus der Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) nutzen. Diese Energie wird verwendet, um die Position von Nukleosomen zu verändern, die Wicklung der DNA um Histone zu lockern oder zu verdichten und somit die Zugänglichkeit der DNA für verschiedene zelluläre Prozesse zu regulieren.
• Energiebereitstellung:
  • ATP besteht aus Adenin, Ribose (einem Zucker) und drei Phosphatgruppen. Bei der Hydrolyse von ATP wird eine der Phosphatgruppen abgespalten, wodurch Adenosindiphosphat (ADP) und anorganisches Phosphat (Pi) entstehen.
  • Diese Reaktion setzt eine erhebliche Menge an Energie frei:

     ATP + H2O -> ADP + Pi + Energie 

  • Diese Energie wird von den Chromatin-Remodellierungskomplexen genutzt, um mechanische Arbeit zu leisten.
• Mechanismen:
  • Sliding: Die Position der Nukleosomen auf der DNA kann verschoben werden, was als ''Nukleosomen-Sliding'' bezeichnet wird. Diese Verschiebung ermöglicht es, dass bestimmte DNA-Sequenzen zugänglich oder unzugänglich für Transkriptionsfaktoren und andere DNA-bindende Proteine werden.
  • Ejektieren: Nukleosomen können vollständig von der DNA entfernt werden, was zu einer vollständigen Freilegung der darunter liegenden DNA führt.
  • Verändern: Die Struktur der Nukleosomen kann verändert werden, indem die DNA transient von den Histonen abgezogen wird, was die Rezeptivität der DNA für regulatorische Proteine erhöht.
• Bedeutung: Diese Remodellierungsprozesse sind unerlässlich für die Regulation der Genexpression, die DNA-Reparatur und die DNA-Replikation. Sie erlauben es der Zelle, schnell auf Umweltveränderungen zu reagieren und Anpassungen in der Genexpression vorzunehmen ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern. Besonders in der Pflanzenepigenetik sind diese Mechanismen von großer Bedeutung, da sie Pflanzen erlauben, flexibel auf Umweltbedingungen zu reagieren.

b)

Diskutiere den Einfluss von Histonmodifikationen wie Methylierung und Acetylierung auf die Genexpression. Beziehe Dich in Deiner Antwort auf konkrete Beispiele von Pflanzen, bei denen diese Modifikationen eine Rolle spielen.

Lösung:

Einfluss von Histonmodifikationen auf die Genexpression:

• Grundprinzipien der Histonmodifikationen:Histonmodifikationen sind chemische Veränderungen, die an den Histonproteinen vorgenommen werden. Diese Modifikationen können die Struktur des Chromatins und damit die Zugänglichkeit der DNA beeinflussen. Zwei zentrale Arten von Histonmodifikationen sind die Methylierung und die Acetylierung.
• Methylierung:
  • Methylgruppen (CH₃) werden an Aminosäuren der Histone (meist an Lysin oder Arginin) angehängt.
  • Die Wirkung der Methylierung hängt von der spezifischen Position und Anzahl der Methylgruppen ab:
  • Histon H3K4me3 (Trimethylierung an Lysin 4 des Histon H3) ist oft mit aktiver Genexpression assoziiert.
  • Histon H3K27me3 (Trimethylierung an Lysin 27 des Histon H3) ist oft mit reprimierter Genexpression assoziiert.
  • Beispiel aus Pflanzen:In Arabidopsis thaliana (Modellpflanze) spielt die H3K27me3-Modifikation eine zentrale Rolle bei der silencen relevanter Entwicklungsgene. Ein spezifisches Gen, FLOWERING LOCUS C (FLC), wird durch H3K27me3 reprimiert, was die Blütezeit kontrolliert. FLC verhindert Blüte, wenn es aktiv ist, und die Repression durch H3K27me3 erlaubt der Pflanze, zu blühen, wenn die Umweltbedingungen günstig sind.
• Acetylierung:
  • Bei der Acetylierung werden Acetylgruppen (COCH₃) an Lysinreste der Histone angehängt.
  • Histonacetylierung neutralisiert die positive Ladung der Lysine, was die Bindung zwischen DNA und Histonen lockert, wodurch die DNA zugänglicher für Transkriptionsfaktoren wird.
  • Allgemein ist Histonacetylierung mit aktiver Transkription verbunden.
  • Beispiel aus Pflanzen:In Mais (Zea mays) ist die Acetylierung des Histons H3K9Ac wichtig für die Aktivierung des Gens ZmLG1, das an der Entwicklung der Blätter beteiligt ist. Eine erhöhte H3K9-Acetylierung fördert die Expression dieses Gens und beeinflusst somit die Blattentwicklung positiv.
• Zusammenfassung:Histonmodifikationen wie Methylierung und Acetylierung sind wesentliche Mechanismen zur Regulierung der Genexpression. Sie ermöglichen es Pflanzen, flexibel auf Umweltveränderungen zu reagieren, indem sie die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine kontrollieren. Beispiele wie die Rolle der H3K27me3-Methylierung in Arabidopsis oder die H3K9-Acetylierung in Mais zeigen, wie diese Modifikationen konkrete physiologische Prozesse in Pflanzen steuern können.

c)

Beschreibe die Methode ChIP-Seq. Welche Informationen können durch dieses Verfahren gewonnen werden, und wie trägt es zur Untersuchung der Chromatinstruktur bei? Verwende eine hypothetische Pflanze und ihr Reaktion auf Umweltstress als Beispiel.

Lösung:

ChIP-Seq-Methode:

• Definition und Zweck:ChIP-Seq (Chromatin-Immunpräzipitation mit anschließender Sequenzierung) ist eine Technik zur Untersuchung von Protein-DNA-Interaktionen. Sie ermöglicht es, festzustellen, welche Stellen im Genom von bestimmten Proteinen, wie Transkriptionsfaktoren oder Histonen mit spezifischen Modifikationen, gebunden werden oder an welchen Stellen Chromatin-Modifikationen vorliegen.
• Grundprinzipien:
  • Kreuzvernetzung: Zellen werden mit einem Crosslinker (z.B. Formaldehyd) behandelt, um Proteine an die DNA zu binden.
  • Fragmentierung: Die DNA wird in kleine Fragmente zerschnitten, entweder durch enzymatische Verdauung oder durch Sonifikation.
  • Immunpräzipitation: Antikörper, die spezifisch für das Protein oder die Modifikation sind, werden verwendet, um die Protein-DNA-Komplexe zu isolieren.
  • Aufreinigung: Die Kreuzvernetzung wird rückgängig gemacht, und die DNA wird gereinigt.
  • Sequenzierung: Die gereinigte DNA wird dann sequenziert, um die genauen Bindungsstellen im Genom zu identifizieren.
• Gewonnene Informationen:
  • ChIP-Seq kann genaue Informationen darüber liefern, wo bestimmte Proteine oder modifizierte Histone im Genom gebunden sind.
  • Es ermöglicht die Identifikation von Promotoren, Enhancern und anderen regulatorischen Elementen, die von Transkriptionsfaktoren oder anderen Proteinen erkannt werden.
  • Durch die Untersuchung von Histonmodifikationen kann die Methode helfen, aktive oder reprimierte genomische Regionen zu identifizieren.
• Beispiel einer hypothetischen Pflanze unter Umweltstress:Stell dir vor, wir untersuchen eine Pflanze, die auf Trockenstress reagiert. Wir möchten herausfinden, welche Gene durch den Transkriptionsfaktor ABF1 (Abscisic Acid Responsive Element Binding Factor 1) aktiviert werden.
  • Die Pflanzen werden zunächst unter normalen Bedingungen und dann unter Trockenstress gehalten.
  • ChIP-Seq wird verwendet, um die DNA-Sequenzen zu identifizieren, an die ABF1 bindet.
  • Durch die Analyse der ChIP-Seq-Daten können wir feststellen, dass ABF1 unter Trockenstress spezifische Promotorregionen von Genen bindet, die mit der Stressantwort der Pflanze verbunden sind, wie z.B. Gene, die für osmotische Anpassung und Schutzproteine kodieren.
  • Zusätzlich kann ChIP-Seq auf Histonmodifikationen angewendet werden, um zu erkennen, wie sich die Chromatinstruktur in der Nähe dieser Gene verändert (z.B. durch H3K4me3 oder H3K27Ac), was auf eine Transkriptionsaktivierung hinweist.
• Beitrag zur Untersuchung der Chromatinstruktur:ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Chromatinstruktur und bietet Einblicke in die dynamischen Veränderungen der DNA-Zugänglichkeit und Genregulation. Es erlaubt Forschern, die molekularen Mechanismen hinter der Genexpression und der Reaktion auf Umweltveränderungen zu entschlüsseln.

d)

Ein Experiment untersucht die epigenetischen Veränderungen in einer Pflanze, die auf Umweltstress reagiert. Angenommen, die relative Häufigkeit der zugänglichen Chromatinbereiche (detektiert durch ATAC-Seq) folgt einer Poisson-Verteilung mit einem Mittelwert von 2. Berechne die Wahrscheinlichkeit, dass zufällig ausgewählte Chromatinregionen genau 3 zugängliche Bereiche aufweisen. Zeige die Schritte Deiner Berechnung.

Lösung:

Berechnung der Wahrscheinlichkeit mittels Poisson-Verteilung:

• Definition der Poisson-Verteilung:Die Poisson-Verteilung ist eine diskrete Wahrscheinlichkeitsverteilung, die die Anzahl der Ereignisse in einem festen Intervall beschreibt, wenn diese Ereignisse mit einer bekannten durchschnittlichen Rate auftreten und unabhängig voneinander sind. Die Wahrscheinlichkeitsfunktion der Poisson-Verteilung ist gegeben durch:\(P(X = k) = \frac{e^{-\lambda} \lambda^k}{k!}\)wobei:
  • \(\lambda\) der Mittelwert (Durchschnitt) ist.
  • \(e\) die Eulersche Zahl (ungefähr 2.71828) darstellt.
  • \(k\) die Anzahl der Ereignisse ist.
  • \(P(X = k)\) die Wahrscheinlichkeit ist, dass genau \(k\) Ereignisse eintreten.
• Gegebene Parameter für das Problem:Der Mittelwert \(\lambda\) beträgt 2 und wir sollen die Wahrscheinlichkeit berechnen, dass zufällig ausgewählte Chromatinregionen genau 3 zugängliche Bereiche aufweisen. Daher setzen wir \(k = 3\).
• Einsetzen der Werte in die Poisson-Formel:Wir setzen \(\lambda = 2\) und \(k = 3\) in die Formel ein:\(P(X = 3) = \frac{e^{-2} \, 2^3}{3!}\)
• Berechnung der einzelnen Komponenten:
  • \(e^{-2} \approx 0.1353\)
  • \(2^3 = 8\)
  • \(3! = 3 \cdot 2 \cdot 1 = 6\)
• Einsetzen der Komponenten in die Formel:\(P(X = 3) = \frac{0.1353 \, 8}{6} \approx \frac{1.0824}{6} \approx 0.1804\)
• Schlussfolgerung:Die Wahrscheinlichkeit, dass eine zufällig ausgewählte Chromatinregion genau 3 zugängliche Bereiche aufweist, beträgt ungefähr 0.1804 bzw. etwa 18.04%.

Aufgabe 4)

Du hast zwei wichtige Techniken zur Untersuchung epigenetischer Veränderungen kennengelernt: ChIP-Seq und Bisulfite Sequencing. Beide Verfahren spielen eine fundamentale Rolle bei der Analyse und Quantifizierung von Modifikationen an DNA und Histonen. ChIP-Seq kombiniert Chromatin-Immunopräzipitation mit Hochdurchsatz-Sequenzierung, um proteinbindende DNA-Sequenzen zu identifizieren. Der Prozess beinhaltet die Fragmentierung des Chromatins, Immunopräzipitation mit Antikörpern und die Sequenzierung der DNA, was schließlich zu der Identifikation von Protein-DNA-Interaktionsstellen und Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen führt. Bisulfite Sequencing analysiert DNA-Methylierungsmuster durch die Behandlung der DNA mit Bisulfit, wodurch nicht-methylierte Cytosine zu Uracil konvertiert werden. Anschließend erfolgt eine PCR und Sequenzierung, was die Unterscheidung zwischen methyliertem und nicht-methyliertem Cytosin ermöglicht.

a)

(a) Erläutere den detaillierten Ablauf eines ChIP-Seq-Experiments von der Chromatin-Fragmentierung bis zur Identifikation der Protein-DNA-Interaktionsstellen und stelle dar, wie die Datenanalyse durchgeführt wird, um Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren zu ermitteln.

Lösung:

(a) Der Ablauf eines ChIP-Seq-Experiments lässt sich in mehrere Schritte unterteilen:

• Chromatin-Fragmentierung: Zuerst wird das Chromatin aus Zellen oder Gewebeproben isoliert. Dann wird es mittels Ultraschall oder enzymatischer Verdauung in kleine Fragmente von etwa 200-500 Basenpaaren zerkleinert.
• Immunopräzipitation: Antikörper, die spezifisch für das zu untersuchende Protein (z.B. ein Transkriptionsfaktor oder eine Histonmodifikation) sind, werden hinzugefügt. Diese binden an die entsprechenden Proteine und die assoziierten DNA-Sequenzen. Das Antikörper-Protein-DNA-Komplex wird durch Protein-A- oder Protein-G-bead-bindende Schritte isoliert.
• Reinigung der DNA: Die Protein-DNA-Komplexe werden Wasch- und Elutionsschritten unterzogen, um die unspezifischen Bindungen zu entfernen. Danach wird das Protein durch Proteasebehandlung entfernt und die DNA gereinigt.
• DNA-Sequenzierung: Die geläuterte DNA wird für die Hochdurchsatz-Sequenzierung vorbereitet. Dazu gehören Schritte wie End-Repair, Adapter-Ligation und Amplifikation der Fragmente durch PCR.

Identifikation der Protein-DNA-Interaktionsstellen: Nach der Sequenzierung werden die resultierenden DNA-Sequenzen gegen das Referenzgenom ausgerichtet, um die spezifischen Bindungsstellen zu identifizieren.

• Sequenz-Ausrichtung: Die Rohsequenzdaten (Reads) werden mit Hilfe von bioinformatischen Werkzeugen wie BWA oder Bowtie gegen das Referenzgenom ausgerichtet.
• Peaks Identifikation: Durch Programme wie MACS (Model-based Analysis of ChIP-Seq) werden Signifikanztests durchgeführt, um Bereiche (Peaks) im Genom zu identifizieren, die eine Anreicherung von Reads aufweisen und somit als potentielle Protein-Bindungsstellen gelten.
• Peak-Annotation und Visualisierung: Die Peaks werden bezüglich ihrer Lage in Genen oder regulatorischen Regionen annotiert. Visuelle Darstellungstools wie IGV (Integrative Genomics Viewer) helfen hierbei.

Durch diese Schritte erhält man eine Karte der Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren und anderen DNA-assoziierten Proteinen im Genom, was einen tiefen Einblick in die genregulatorischen Netzwerke der Zelle ermöglicht.

b)

(b) Berechne die Anzahl der unterschiedlichen DNA-Methylierungsmuster, die theoretisch in einem 500-Basenpaar (bp) langen DNA-Abschnitt entdeckt werden können, wenn davon ausgegangen wird, dass alle Cytosin-Basen methyliert oder nicht-methyliert sein können. Überlege, wie das Ergebnis durch Bisulfite Sequencing verifiziert werden kann.

Lösung:

(b) Um die Anzahl der unterschiedlichen DNA-Methylierungsmuster in einem 500-Basenpaar (bp) langen DNA-Abschnitt zu berechnen, gehen wir davon aus, dass jede Cytosin-Base (C) entweder methyliert (mC) oder nicht methyliert (C) sein kann.

Jede der Cytosin-Basen hat genau zwei Zustände: methyliert oder nicht methyliert. Für jeden der \textit{k} Cytosin-Basen in dem DNA-Abschnitt haben wir somit:

• 2 Optionen: methyliert (mC) oder nicht methyliert (C)

Die Gesamtzahl der unterschiedlichen Methylierungsmuster in einem DNA-Abschnitt mit \textit{k} Cytosin-Basen ist daher:

• 2^k

Da der DNA-Abschnitt 500 Basenpaare lang ist und wir generell annehmen, dass jede der vier Basen (A, T, C, G) gleich häufig vorkommt, können wir grob schätzen, dass etwa ein Viertel der Basen Cytosin-Basen sind:

 k ≈ 500 / 4 = 125 

Die Anzahl der möglichen DNA-Methylierungsmuster in solch einem DNA-Abschnitt beträgt daher:

 2125 

Dies ist eine sehr große Zahl:

• 2¹²⁵ ≈ 3,78 × 10³⁷

Um diese theoretischen Muster in der Praxis zu verifizieren, wird Bisulfite Sequencing verwendet:

• Bisulfit-Behandlung: Die DNA wird mit Bisulfit behandelt, wodurch nicht-methyliertes Cytosin zu Uracil konvertiert wird, während methyliertes Cytosin unverändert bleibt.
• PCR: Während der PCR wird Uracil als Thymin amplifiziert. Das bedeutet, dass in der Sequenzierung nicht-methyliertes Cytosin als Thymin (T) erscheint, während methyliertes Cytosin als Cytosin (C) erscheint.

Nach der Sequenzierung und Ausrichtung gegen das Referenzgenom wird jede ursprüngliche Cytosin-Position analysiert:

• Wenn die Position als Cytosin (C) sequenziert wurde, war sie methyliert.
• Wenn die Position als Thymin (T) sequenziert wurde, war sie nicht methyliert.

Durch diese Methode lässt sich das Methylierungsmuster jedes einzelnen Cytosins im DNA-Abschnitt exakt bestimmen.