Research Project Chemical Genetics (Wahl Genomik/Biostatistik) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Angenommen, Du arbeitest an einem Forschungsprojekt, bei dem das Genom eines neu entdeckten Bakteriums sequenziert werden soll. Beschreibe und diskutiere die relevanten Schritte und Methoden zur Genomsequenzierung unter besonderer Berücksichtigung der Methodenauswahl, der Datenanalyse und der Qualitätskontrolle. Berücksichtige die folgenden Informationen: Sequenziertypen (Sanger-Sequenzierung, Next-Generation-Sequencing), DNA-Extraktion, DNA-Fragmentierung, Library Preparation, Sequenzierung, Datenanalyse, GC-Gehalt, Qualitätskontrolle und Fehlerkorrektur.

a)

Beschreibe die Hauptunterschiede zwischen der Sanger-Sequenzierung und dem Next-Generation-Sequencing (NGS) in Bezug auf Durchsatz, Genauigkeit und Kosten. Welche Methode würdest Du für Dein Projekt wählen und warum?

Lösung:

• Durchsatz:
  • Sanger-Sequenzierung: Diese Methode hat einen geringeren Durchsatz, da sie nur eine einzelne DNA-Sequenz pro Reaktion sequenzieren kann. Dies macht sie für groß angelegte Genomsequenzierungsprojekte weniger geeignet.
  • Next-Generation-Sequencing (NGS): NGS hat einen sehr hohen Durchsatz und kann Millionen bis Milliarden von DNA-Fragmente gleichzeitig sequenzieren. Dies macht NGS ideal für die Sequenzierung ganzer Genome, Metagenomik und groß angelegte Genomanalysen.
• Genauigkeit:
  • Sanger-Sequenzierung: Sanger-Sequenzierung ist bekannt für ihre hohe Genauigkeit und ist der Goldstandard für die Sequenzverifizierung. Sie hat eine Fehlerrate von ungefähr 1 in 1000 Basenpaaren.
  • Next-Generation-Sequencing (NGS): Die Genauigkeit von NGS ist ebenfalls hoch, jedoch variiert sie je nach spezifischer Technologie und Plattform. Moderne NGS-Plattformen haben eine Fehlerrate von etwa 0,1 bis 1 Prozent, können jedoch durch sogenannte 'deep sequencing' und bioinformatische Fehlerkorrekturen erheblich verbessert werden.
• Kosten:
  • Sanger-Sequenzierung: Diese Methode ist kostspieliger pro Base, besonders wenn große Mengen an Daten benötigt werden. Aufgrund des niedrigeren Durchsatzes kann die Sequenzierung von ganzen Genomen zeit- und kostenintensiv sein.
  • Next-Generation-Sequencing (NGS): Die Kosten pro Base sind bei NGS signifikant niedriger, besonders bei groß angelegten Projekten. Die initialen Kosten für die Infrastruktur können jedoch höher sein.
• Methodenwahl für das Projekt:Für ein Projekt, das die Sequenzierung des gesamten Genoms eines neu entdeckten Bakteriums zum Ziel hat, würde ich die Next-Generation-Sequencing (NGS) Methode wählen. Hauptgründe hierfür sind:
  • Hoher Durchsatz: Ermöglicht die schnelle und umfassende Sequenzierung des gesamten Bakteriengenoms.
  • Kosten: Niedrigere Kosten pro sequenzierter Base machen das Projekt finanziell effizienter.
  • Genauigkeit: Die hohe Genauigkeit, kombiniert mit bioinformatischer Fehlerkorrektur, gewährleistet verlässliche Ergebnisse.

b)

Beschreibe den Prozess der DNA-Extraktion und Fragmentierung aus Deinem Bakterium. Welche Probleme können bei diesen Schritten auftreten, und wie könntest Du sie beheben?

Lösung:

• DNA-Extraktion:Hier sind die relevanten Schritte für die DNA-Extraktion aus dem Bakterium:
  1. Zelllyse: Zerbrechen der Zellmembran und Zellwand des Bakteriums, um die DNA freizusetzen. Häufige Methoden hierfür sind:
     • Enzymatische Lyse (z. B. Lysozym), um die Zellwand abzubauen
     • Physikalische Störungen (z. B. Homogenisierung, Scherkräfte)
     • Detergenzien (z. B. SDS) zur Auflösung der Membranen
  2. Entfernung von Proteinverunreinigungen: Dies erfolgt normalerweise durch Proteinase-K Behandlung oder durch das Hinzufügen von phenolisch-chloroformischen Extraktionen, gefolgt von Zentrifugation.
  3. DNA-Präzipitation: Die DNA wird durch das Hinzufügen von Isopropanol oder Ethanol präzipitiert und durch Zentrifugation gesammelt.
  4. Waschen: Die DNA-Pellets werden mit 70% Ethanol gewaschen, um Salze und andere Verunreinigungen zu entfernen.
  5. Wiederauflösung: Die gereinigte DNA wird in einem geeigneten Puffer (z. B. TE-Puffer) aufgelöst.
• DNA-Fragmentierung:Sobald die DNA extrahiert ist, wird sie in kleinere Fragmente zerlegt, die für die Sequenzierung geeignet sind. Methoden zur Fragmentierung umfassen:
  1. Physikalische Methoden (z. B. Ultraschallbehandlung oder Scherung): Die DNA wird mechanische Kräften ausgesetzt, um sie zu fragmentieren.
  2. Enzymatische Methoden (z. B. Restriktionsenzyme): Spezifische Enzyme schneiden die DNA an bestimmten Sequenzen.
  3. Chemische Methoden (z. B. Zersetzung durch bestimmte Chemikalien): Werden verwendet, um DNA zufällig zu fragmentieren.
• Probleme und Lösungen:
  • Problem bei der Zelllyse: Ineffiziente Zelllyse kann zu geringer DNA-Ausbeute führen.Lösung: Optimierung der Zelllysebedingungen durch Anpassung der Enzymkonzentration oder der Dauer der physikalischen Störungen.
  • Problem bei der Entfernung von Proteinverunreinigungen: Rückstände von Proteinen können die nachfolgenden Schritte beeinträchtigen.Lösung: Sorgfältige Durchführung der Proteinase-K Behandlung und gegebenenfalls wiederholte phenolisch-chloroformische Extraktionen.
  • Problem bei der DNA-Präzipitation: Unvollständige Präzipitation kann zu Verlust von DNA führen.Lösung: Verwendung von kaltem Isopropanol/Ethanol und ausreichende Inkubation bei niedrigen Temperaturen.
  • Problem bei der DNA-Fragmentierung: Ungleichmäßige oder unzureichende Fragmentierung kann das Sequenzierungsergebnis beeinflussen.Lösung: Optimierung der Fragmentierungsmethode und -bedingungen. Verwendung von Gel-Elektrophorese zur Überprüfung der Fragmentgröße und Anpassung der Bedingungen entsprechend.

c)

Erläutere die Bedeutung der Qualitätskontrolle und Fehlerkorrektur in der Sequenzierarbeit. Angenommen, der GC-Gehalt Deines Bakteriums beträgt 60%. Wie würde dieser hohe GC-Gehalt die Sequenzierarbeit beeinflussen, und welche spezifischen Maßnahmen zur Qualitätskontrolle würdest Du in Betracht ziehen?

Lösung:

• Bedeutung der Qualitätskontrolle und Fehlerkorrektur:Qualitätskontrolle und Fehlerkorrektur sind entscheidend für die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Sequenzierungsdaten. Sie helfen sicherzustellen, dass die erhaltenen Sequenzen tatsächlich die genetische Information des Bakteriums widerspiegeln und nicht durch technische Fehler verfälscht sind. Folgende Aspekte sind besonders wichtig:
  • Vermeidung von Sequenzierungsfehlern: Durch sorgfältige Qualitätskontrollen werden technische Fehler minimiert, die durch Polymerase-Kettenreaktionen (PCR), enzymatische Prozesse oder chemische Reaktionen entstehen können.
  • Datenintegrität: Qualitätskontrollen gewährleisten die Integrität der Daten und verhindern das Einfließen von Kontaminationen oder Artefakten.
  • Zuverlässigkeit der Ergebnisse: Fehlerkorrekturmethoden wie konsistente Reads und Alignments verbessern das Vertrauen in die Sequenzierungsdaten.
• Einfluss eines hohen GC-Gehalts (60%):Ein hoher GC-Gehalt kann die Sequenzierarbeit auf verschiedene Weisen beeinflussen:
  • Schwierigkeiten bei der PCR-Amplifikation: GC-reiche Regionen neigen zur Bildung stabiler sekundärer Strukturen, die die Effizienz der Amplifikation verringern können.
  • Sequenzierungsbias: Bestimmte NGS-Technologien können Probleme bei der korrekten Sequenzierung von GC-reichen Regionen haben, was zu einem ungleichmäßigen Coverage führt.
  • Enzymatische Schwierigkeiten: Enzyme, die während der Sequenzierung verwendet werden, können ineffizienter arbeiten, was die Genauigkeit und Effizienz der Sequenzierung beeinträchtigen kann.
• Spezifische Maßnahmen zur Qualitätskontrolle bei hohem GC-Gehalt:Um die Herausforderungen eines hohen GC-Gehalts zu bewältigen und die Qualität der Sequenzen sicherzustellen, können folgende Maßnahmen ergriffen werden:
  • Optimierung der PCR-Bedingungen: Anpassung von Temperatur, DMSO und anderen Additiven, um die Denaturierung von GC-reichen Regionen zu erleichtern.
  • Verwendung von Hochleistungs-Enzymen: Hochleistungs- oder speziell modifizierte Polymerasen sind oft besser in der Lage, GC-reiche Regionen zu amplifizieren.
  • Nutzung von unterschiedlichen Sequenzierungstechnologien: Es kann hilfreich sein, verschiedene NGS-Plattformen parallel zu verwenden, um Sequenzierungsbias zu minimieren und eine umfassendere Abdeckung zu gewährleisten.
  • Durchführung zusätzlicher Library Preparations: Mehrere Library Preparations unter unterschiedlichen Bedingungen können helfen, GC-bias zu reduzieren und die Zuverlässigkeit der Daten zu steigern.
  • Deep Sequencing: Durch tiefere Abdeckung der Sequenzen können mögliche Fehler erkannt und korrigiert werden.
  • Bioinformatische Methoden zur Fehlerkorrektur: Einsatz von spezialisierten Softwaretools, die auf die Erkennung und Korrektur von Fehlern in GC-reichen Regionen ausgelegt sind.
  • QC-Metriken verwenden: Implementierung von QC-Metriken wie Q-Wert und Coverage-Tiefe, um Problemregionen zu identifizieren und gezielt anzugehen.

Aufgabe 2)

Next-Generation Sequencing (NGS) ist eine Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethode für DNA und RNA, die eine parallele Sequenzierung vieler Proben ermöglicht. Im Vergleich zur traditionellen Sanger-Sequenzierung bietet NGS geringere Kosten und höhere Geschwindigkeit. Diese Technik wird sowohl in der Genomik, Transkriptomik als auch in der Metagenomik verwendet und erfordert umfassende bioinformatische Methoden zur Datenanalyse. NGS zeichnet sich durch eine hohe Genauigkeit und Abdeckung aus.

a)

(a) Erläutere, wie die parallele Sequenzierung bei der NGS im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung die Effizienz und Kosten beeinflusst. Achte dabei auf die Aspekte der Sequenziertiefe und Durchsatzkapazität.

Lösung:

(a) Erläutere, wie die parallele Sequenzierung bei der NGS im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung die Effizienz und Kosten beeinflusst. Achte dabei auf die Aspekte der Sequenziertiefe und Durchsatzkapazität.

• Parallele Sequenzierung: Bei der NGS werden Millionen von DNA-Fragmenten gleichzeitig sequenziert. Das bedeutet, dass viele Proben parallel analysiert werden können, was die Effizienz erheblich erhöht. Im Vergleich dazu erfolgt die Sanger-Sequenzierung sequenziell und kann nur eine Probe nach der anderen bearbeiten.
• Sequenziertiefe: Die NGS ermöglicht eine tiefere Abdeckung der Sequenzen, d.h., die gleiche Sequenz wird vielfach gelesen. Dies erhöht die Genauigkeit der Ergebnisse. Bei der Sanger-Sequenzierung ist die Tiefe begrenzt, was zu geringerer Genauigkeit führen kann.
• Durchsatzkapazität: NGS bietet eine wesentlich höhere Durchsatzkapazität, da viele Sequenzen parallel verarbeitet werden. Dies bedeutet, dass in kurzer Zeit viel mehr Daten erzeugt werden können. Im Gegensatz dazu ist die Durchsatzkapazität bei der Sanger-Sequenzierung aufgrund ihres sequentiellen Charakters begrenzt.
• Kosten: Die parallele Sequenzierung bei der NGS senkt die Kosten pro Basenpaar erheblich. Die Effizienz der Massenverarbeitung und die Möglichkeit der Multiplexierung (mehrere Proben in einem Lauf) tragen weiter zur Kostenreduktion bei. Die Sanger-Sequenzierung ist kostenintensiver pro Basenpaar, insbesondere bei großen Projekten, da jeder Lauf separat durchgeführt werden muss.

b)

(b) Während einer NGS-Datenanalyse wurde eine bestimmte Sequenz in einer großen Probenmenge identifiziert. Bei der weiteren bioinformatischen Analyse wurde festgestellt, dass diese Sequenz eine spezifische Genmutation enthält, die mit einer bestimmten Krankheit in Zusammenhang gebracht wird.

• Berechne die statistische Signifikanz dieser Mutation, wenn festgestellt wurde, dass diese in 30 von 200 Proben auftritt. Nutzen Sie den Chi-Quadrat-Test, um zu überprüfen, ob dieser Befund signifikant ist.

Notiere alle Schritte und Annahmen, die du dabei triffst.

Lösung:

(b) Während einer NGS-Datenanalyse wurde eine bestimmte Sequenz in einer großen Probenmenge identifiziert. Bei der weiteren bioinformatischen Analyse wurde festgestellt, dass diese Sequenz eine spezifische Genmutation enthält, die mit einer bestimmten Krankheit in Zusammenhang gebracht wird.

• Berechne die statistische Signifikanz dieser Mutation, wenn festgestellt wurde, dass diese in 30 von 200 Proben auftritt. Nutzen Sie den Chi-Quadrat-Test, um zu überprüfen, ob dieser Befund signifikant ist.

Notiere alle Schritte und Annahmen, die du dabei triffst.

Um die statistische Signifikanz zu bestimmen, benutzen wir den Chi-Quadrat-Test. Hier sind die Schritte zur Berechnung:

1. Formuliere die Hypothesen:

• Nullhypothese (H₀): Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Häufigkeit der Mutation zu der erwarteten Häufigkeit.
• Alternativhypothese (H₁): Es gibt einen signifikanten Unterschied in der Häufigkeit der Mutation zu der erwarteten Häufigkeit.

Angenommen, die erwartete Häufigkeit der Mutation beträgt 10% der Proben.

                  | Mutation vorhanden | Mutation nicht vorhanden |      SummeBeobachtet (O)     | 30                    | 170                       |      200Erwartet (E)       | 0.1 * 200 = 20         | 0.9 * 200 = 180           |      200

Die Formel für die Chi-Quadrat-Statistik ist:

\[\chi^2 = \sum \frac{(O_i - E_i)^2}{E_i}\]

Setze die beobachteten (O) und erwarteten (E) Werte in die Formel ein:

\[\chi^2 = (\frac{(30 - 20)^2}{20}) + (\frac{(170 - 180)^2}{180})\]

\[\chi^2 = (\frac{10^2}{20}) + (\frac{(-10)^2}{180})\]

\[\chi^2 = (\frac{100}{20}) + (\frac{100}{180})\]

\[\chi^2 = 5 + 0.556\]

\[\chi^2 ≈ 5.556\]

Freiheitsgrad (df) = Anzahl der Kategorien - 1 = 2 - 1 = 1.

Vergleiche die berechnete Chi-Quadrat-Statistik mit den kritischen Werten aus der Chi-Quadrat-Tabelle bei einem Freiheitsgrad von 1. Bei einem Signifikanzniveau (\(\alpha\)) von 0.05 ist der kritische Wert ca. 3.841.

Da die berechnete Chi-Quadrat-Statistik (5.556) größer ist als der kritische Wert (3.841), lehnen wir die Nullhypothese ab.

Dies bedeutet, dass die Mutation signifikant häufiger auftritt als aufgrund der erwarteten Häufigkeit zu erwarten wäre. Daher ist der Befund statistisch signifikant.

Aufgabe 3)

DNA-Sequenzierung und Genomdaten-Analyse: Nachdem Du DNA-Sequenzen über NGS-Techniken wie Illumina und PacBio erhoben hast, sollen diese Daten nun analysiert werden, um Gene, Mutationen und funktionelle Elemente zu identifizieren. Nutze dafür bioinformatische Methoden und Tools wie BLAST, BWA, GATK und ANNOVAR. Eine funktionelle Analyse über Gen-Ontologie (GO) und Protein-Protein-Interaktionen ist ebenfalls erforderlich.

a)

Du hast eine DNA-Sequenz mittels Illumina-Sequenzierung erhalten. Führe einen Sequenzvergleich durch, um homologe Gene zu identifizieren. Beschreibe dabei, wie Du BLAST verwenden würdest.

• Erläutere die Schritte, die zur Durchführung eines BLAST-Suchlaufs nötig sind.
• Wie bestimmst Du die Signifikanz der Ergebnisse?

Lösung:

DNA-Sequenzierung und Genomdaten-Analyse: Nachdem Du DNA-Sequenzen über NGS-Techniken wie Illumina und PacBio erhoben hast, sollen diese Daten nun analysiert werden, um Gene, Mutationen und funktionelle Elemente zu identifizieren. Nutze dafür bioinformatische Methoden und Tools wie BLAST, BWA, GATK und ANNOVAR. Eine funktionelle Analyse über Gen-Ontologie (GO) und Protein-Protein-Interaktionen ist ebenfalls erforderlich. DNA-Sequenz mittels Illumina: Homologe Gene mit BLAST identifizieren Um homologe Gene zu identifizieren, können wir BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) verwenden. BLAST ermöglicht den Vergleich einer DNA-Sequenz mit einer Datenbank und hilft dabei, ähnliche oder homologe Sequenzen zu finden.

• Schritte zur Durchführung eines BLAST-Suchlaufs:
  1. Sequenzvorbereitung: Lade die DNA-Sequenz, die Du mittels Illumina erhalten hast, in einem geeigneten Dateiformat (z.B. FASTA) hoch.
  2. Auswahl eines BLAST-Programms: Wähle das passende BLAST-Programm für Deinen Anwendungsfall:
     • BLASTn: für Nukleotid-Sequenzen
     • BLASTp: für Protein-Sequenzen
     • BLASTx: übersetzt Nukleotid-Sequenzen in Protein-Sequenzen und führt dann den Vergleich durch.
     • tBLASTn: Protein-Sequenzen gegen Nukleotid-Datenbanken, die in alle möglichen Protein-Sequenzen übersetzt wurden.
     • tBLASTx: Nukleotid-Sequenzen gegen Nukleotid-Datenbanken, beide in alle möglichen Protein-Sequenzen übersetzt.
  3. Festlegen der Parameter: Setze die Suchparameter, wie z.B. Anzahl der Treffer, E-Value-Schwellenwert (die statistische Signifikanz), Matrizen für den Vergleich, etc.
  4. Suchen starten: Führe die BLAST-Suche durch. Dies kann online auf der NCBI-Website oder lokal, falls Du eigene Datenbanken oder größere Datensätze hast, durchgeführt werden.
  5. Analyse der Ergebnisse: Begutachte die Ergebnisse der Suche. Achte dabei auf die höchsten Scores, E-Values und die Identität der Treffer, um relevante homologe Gene zu identifizieren.
• Bestimmen der Signifikanz der Ergebnisse:
  • Die Signifikanz der Ergebnisse beim BLAST-Suchlauf wird hauptsächlich mittels der E-Value (Erwartungswert) bewertet. Der E-Wert gibt die Anzahl der erwarteten Zufallstreffer an, die bei der Suche in der Datenbank auftreten könnten. Ein niedriger E-Wert zeigt eine hohe Signifikanz des Treffers an.
  • Score und Identität: Der Score gibt die Qualität des Alignments an, während die Prozentidentität angibt, wie ähnlich die verglichenen Sequenzen sind. Eine kombinierte Betrachtung dieser Werte hilft bei der Bewertung der Treffer.
  • Visuelle Inspektion: Neben numerischen Werten kann auch eine visuelle Inspektion der Alignments, insbesondere der Positionen von Lücken und der konservierten Bereiche, zur Bestimmung der biologischen Relevanz beitragen.

b)

Du hast in Deiner Analyse eine Punktmutation (SNP) gefunden. Nutze GATK und ANNOVAR, um diese Mutation weiter zu charakterisieren und den Einfluss auf das Protein zu analysieren. Beschreibe den gesamten Arbeitsprozess und beantworte folgende Fragen:

• Wie funktioniert die SNP-Erkennung mit GATK?
• Wie annotiert ANNOVAR die Mutation und liefert Informationen zu möglichen funktionellen Konsequenzen?
• Berechne die Wahrscheinlichkeit, dass diese Mutation zu einer Fehlfunktion des Proteins führt, wenn Dir folgende Daten zur Verfügung stehen: Die Mutation liegt in einer hochkonservierten Region (Conservation Score: 0.95) und hat eine vorhergesagte Auswirkung auf die Proteinstruktur (Score: -2.5).

Lösung:

DNA-Sequenzierung und Genomdaten-Analyse: Nachdem Du DNA-Sequenzen über NGS-Techniken wie Illumina und PacBio erhoben hast, sollen diese Daten nun analysiert werden, um Gene, Mutationen und funktionelle Elemente zu identifizieren. Nutze dafür bioinformatische Methoden und Tools wie BLAST, BWA, GATK und ANNOVAR. Eine funktionelle Analyse über Gen-Ontologie (GO) und Protein-Protein-Interaktionen ist ebenfalls erforderlich. Punktmutation (SNP) Analyse mit GATK und ANNOVARUm eine gefundene Punktmutation weiter zu charakterisieren und deren Einfluss auf das Protein zu analysieren, können GATK und ANNOVAR verwendet werden.

• Wie funktioniert die SNP-Erkennung mit GATK?
  1. Initiales Mapping: Die DNA-Sequenzen werden zunächst mit einem Mapping-Tool wie BWA an ein Referenzgenom aligniert.
  2. Vorverarbeitung der Daten: Die alignierten Reads werden mit GATK vorverarbeitet, indem Schritte wie die Markierung von PCR-Duplikaten, die Recalibrierung der Base Quality Scores und die Echtzeit-Qualitätskontrolle durchgeführt werden.
  3. Variant Calling: GATK's HaplotypeCaller wird verwendet, um SNPs und Indels in den vorverarbeiteten BAM-Dateien zu identifizieren. Dies geschieht durch das Erstellen eines graphischen Repräsentationsmodells der Haplotype und das Auffinden der wahrscheinlichsten Varianten.
  4. Filterung der Varianten: Die identifizierten Varianten werden mit GATK's VariantFiltration gefiltert, um falsche positive Ergebnisse zu minimieren und nur die zuverlässigsten Varianten zu behalten.
• Wie annotiert ANNOVAR die Mutation und liefert Informationen zu möglichen funktionellen Konsequenzen?
  1. Eingangsdatei erstellen: Werte die mit GATK identifizierte VCF-Datei (Variant Call Format) und konvertiere sie in das ANNOVAR-Format.
  2. Annotation: Verwende ANNOVAR, um die VCF-Datei mit verschiedenen Datenbanken zu annotieren, wie RefSeq, dbSNP, ClinVar und anderen. ANNOVAR untersucht die genetischen Varianten auf ihre Position, Frequenz in Bevölkerungsdatenbanken und bekannte klinische Signifikanz und bestimmt, ob sie sich auf die Proteinstruktur und -funktion auswirken könnten.
  3. Funktionelle Konsequenzen: ANNOVAR bewertet die funktionelle Bedeutung der Mutation, indem es auf Datenbanken zugreift, die Informationen über konservierte Genregionen, Prädiktionen für schädliche Auswirkungen (z.B. SIFT, PolyPhen) und klinische Informationen (z.B. Pathogenitätsbewertungen) enthalten.
• Berechne die Wahrscheinlichkeit, dass diese Mutation zu einer Fehlfunktion des Proteins führt: Angenommen, wir haben folgende Daten:
  • Conservation Score: 0.95 (hochkonservierte Region)
  • Prädiktion der Auswirkung auf die Proteinstruktur: Score: -2.5 (potenziell schädlich)
  • Ergebnisse interpretieren:
    • Ein hoher Conservation Score von 0.95 zeigt, dass die Mutation in einer evolutionär konservierten Region liegt, was impliziert, dass Änderungen in dieser Region wahrscheinlich funktionelle Konsequenzen haben.
    • Ein negativer Score von -2.5 bei Prädiktionen zur Auswirkung auf die Proteinstruktur deutet auf eine schädliche Wirkung hin.
  • Wahrscheinlichkeit berechnen: Die Kombination dieser beiden Scores gibt uns ein hohes Maß an Vertrauen, dass die Mutation schädlich ist. Es ist bekannt, dass eine hochkonservierte Region (Score: 0.95) in Verbindung mit einem schädlichen Prädiktionsscore (Score: -2.5) darauf hindeutet, dass die Mutation höchstwahrscheinlich schädlich ist.
  Aus diesen Daten lässt sich ableiten, dass die Wahrscheinlichkeit, dass diese Mutation zu einer Fehlfunktion des Proteins führt, sehr hoch ist. Eine konservative Schätzung wäre, dass diese Wahrscheinlichkeit über 95% liegt, basierend auf dem Conservation Score und der schädlichen Wirkung auf die Proteinstruktur.

Aufgabe 4)

Regulation und funktionelle Genomik: Untersuchung und Steuerung der Genexpression sowie die Identifizierung der Funktion von Genen im Genom. Dabei werden verschiedene Analysemethoden wie RNA-Seq und ChIP-Seq verwendet, um den Einfluss von Transkriptionsfaktoren und epigenetischen Modifikationen auf die Genregulation zu untersuchen. Methoden wie CRISPR-Cas9, Knockout/Knockdown und RNAi spielen eine zentrale Rolle in der funktionellen Genomik. Datenanalysen setzen auf Bioinformatik und statistische Werkzeuge. Häufige Modelorganismen sind Hefe, Maus und Zebrafisch.

a)

Beschreibe, wie Du RNA-Seq verwenden würdest, um die Auswirkung eines bestimmten Transkriptionsfaktors auf die Genexpression bei der Maus zu analysieren. Erläutere die einzelnen Schritte des Experiments und welche bioinformatischen und statistischen Werkzeuge Du einsetzen würdest, um die Daten zu analysieren. Begründe, warum die Wahl dieses Transkriptionsfaktors zur Untersuchung relevant ist.

Lösung:

• 1. Hypothese festlegen: Formuliere eine Hypothese darüber, wie der spezifizierte Transkriptionsfaktor die Genexpression in der Maus beeinflusst.
• 2. Versuchsgestaltung und Probenvorbereitung:
  • Identifiziere eine Kontrollgruppe (Mäuse ohne Modifikation des Transkriptionsfaktors) und eine Versuchsgruppe (Mäuse mit überexprimiertem oder ausgeschaltetem Transkriptionsfaktor).
  • Isoliere die RNA aus den Geweben oder Zellen der Versuchstiere.
• 3. RNA-Seq-Bibliothek erstellen:
  • Reverse Transkription der isolierten RNA in cDNA.
  • Fragmentierung der cDNA und Adapter-Ligation.
  • Amplifikation und Quantifizierung der cDNA-Bibliothek.
• 4. Sequenzieren: Verwende eine Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie (z. B. Illumina), um die RNA-Bibliotheken zu sequenzieren.
• 5. Bioinformatische Analyse:
  • Qualitätskontrolle: Verwende Tools wie FastQC zur Überprüfung der Sequenzqualität.
  • Trimming und Filterung: Entferne Adapter-Sequenzen und schlechte Qualitätsreads mit Tools wie Trimmomatic.
  • Alignment: Mappi die Reads gegen das Referenzgenom der Maus mit Tools wie HISAT2 oder STAR.
  • Quantifizierung: Bestimme die Genexpression mit HTSeq-count oder featureCounts.
  • Differenzielle Genexpression: Analysiere die differentiell exprimierten Gene zwischen Kontroll- und Versuchsgruppe mit Tools wie DESeq2 oder EdgeR.
• 6. Statistische Analyse und Interpretation:
  • Identifiziere signifikant über- oder unterexprimierte Gene.
  • Durchführung von Funktionsanalysen (z. B. GO-Term-Analyse) zur Bestimmung betroffener biologischer Prozesse.
  • Erstellung von Heatmaps und Volcano-Plots zur Visualisierung der Ergebnisse.
• 7. Relevanz des Transkriptionsfaktors: Begründe, warum der ausgewählte Transkriptionsfaktor von besonderem Interesse ist. Dies könnte auf vorherigen Forschungen basieren, die seine Rolle in bestimmten Signalwegen oder Krankheiten hervorgehoben haben, oder aufgrund von Hinweisen auf seine Bedeutung in der Entwicklung und Differenzierung von Geweben.

b)

Angenommen, dass Du die Funktion eines neu entdeckten Gens in Zebrafisch untersuchen möchtest. Angenommen Du verwendest CRISPR-Cas9, um eine Gen-Knockout-Mutation zu erzeugen. Beschreibe die allgemeinen Schritte dieses Experiments. Diskutiere mögliche phänotypische Konsequenzen und wie Du mit Hilfe von ChIP-Seq und epigenetischen Modifikationen Veränderungen in der Genregulation und Funktion des Knockout-Gens weiter untersuchen würdest.

Lösung:

• 1. Planung des CRISPR-Cas9-Experiments: Entwerfe spezifische Guide RNAs (gRNAs), die das neu entdeckte Gen im Zebrafischgenom targetieren werden.
  • Identifiziere Zielsequenzen innerhalb des Gens.
  • Überprüfe die Off-Target-Effekte der gRNAs, um spezifische und effiziente gRNAs auszuwählen.
• 2. Synthese und Injektion der CRISPR-Cas9-Komponenten:
  • Synthese der gRNAs und des Cas9-Proteins.
  • Injektion von gRNAs und Cas9 in Zebrafischembryonen (einzellige Phase).
• 3. Verifizierung des Knockouts: Stelle sicher, dass das Zielgen erfolgreich mutiert wurde.
  • Extrahiere DNA von den injizierten Zebrafischen (sobald sie ein bestimmtes Entwicklungsstadium erreicht haben).
  • Führe PCR und Sequenzierung durch, um die Mutationen im Zielgen zu bestätigen.
• 4. Beobachtung und Analyse phänotypischer Konsequenzen:
  • Untersuche die Knockout-Zebrafische auf phänotypische Veränderungen im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen.
  • Dokumentiere Veränderungen in Morphologie, Verhalten, Entwicklung und weitere relevante biologischen Funktionen.
• 5. Untersuchung der Genregulation mit ChIP-Seq: Um die Auswirkungen der Knockout-Mutation auf die Genregulation zu analysieren, führe ChIP-Seq-Experimente durch.
  • Isoliere DNA-Protein-Komplexe und führe Immunpräzipitation (IP) spezifischer Transkriptionsfaktoren oder Histonmodifikationen durch.
  • Bereite die ChIP-Seq-Bibliotheken vor und sequenziere sie.
  • Analysiere die Sequenzierungsdaten, um die Bindungsstellen und die Veränderungen in der Chromatinstruktur oder der Transkriptionsfaktorbindung infolge der Knockout-Mutation zu identifizieren.
• 6. Untersuchung epigenetischer Modifikationen: Analysiere epigenetische Veränderungen, die durch den Knockout verursacht werden könnten.
  • Untersuche Änderungen in DNA-Methylierungsmustern oder Histonmodifikationen mit Methoden wie bisulfit-seq oder massenspektrometrischer Analyse von Histonmodifikationen.
  • Vergleiche die epigenetischen Profile zwischen Knockout- und Wildtyp-Zebrafischen.
• 7. Interpretation und Integration der Ergebnisse:
  • Korrelieren die phänotypischen Veränderungen mit den Ergebnissen der Genregulationsanalysen (ChIP-Seq) und epigenetischen Modifikationen.
  • Verstehen die Funktion des Knockout-Gens in den biologischen Netzwerken und Prozessen des Zebrafischs.