Techniken der Zellbiologie (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Cheatsheet.pdf

Lichtmikroskopie: Grundprinzipien und Anwendung

Definition:

Lichtmikroskopie: Nutzung von sichtbarem Licht und Linsensystemen zur Vergrößerung und Bildgebung von kleinen Objekten wie Zellen und Geweben.

Details:

• Auflösungsgrenze: ca. 200 nm, limitiert durch die Wellenlänge des Lichts
• Arten: Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie
• Wichtige Kenngrößen: Vergrößerung (Produkt der Objektiv- und Okularvergrößerung), numerische Apertur (NA), Arbeitsabstand
• Fluoreszenzmikroskopie: Nutzung fluoreszierender Moleküle zur Markierung spezifischer Zellstrukturen
• Starke Vergrößerung und hohe Auflösung für Untersuchung von Zellmorphologie und -dynamik
• Probenvorbereitung: Fixierung, Färbung, eventuell Einbettung
• Bildqualität beeinflusst durch Beugung, Aberrationen und Kontrast
• Anwendungen: Zellwachstum und -teilung, Struktur von Organellen, Proteinlokalisierung, Pathologie

Konfokale Mikroskopie: 3D-Bildgebung lebender Zellen

Definition:

Ermöglicht hochauflösende 3D-Bilder lebender Zellen durch selektive und räumlich begrenzte Beleuchtung sowie Erfassung von Fluoreszenzsignalen.

Details:

• Erzeugt optische Schnitte von Proben durch Punkt-für-Punkt-Abtastung.
• Verwendet einen Laser als Lichtquelle.
• Verhindert unscharfe Bildbereiche durch Lochblende (Pinhole).
• Ermöglicht Bildrekonstruktion entlang der Z-Achse zur 3D-Darstellung.
• Minimaler Photobleaching-Effekt, daher geeignet für lebende Zellen.
• Anwendung in der Zellbiologie, z.B. zur Beobachtung von Zellstrukturen und -dynamik.

Steriles Arbeiten: Vermeidung von Kontamination

Definition:

Steriles Arbeiten: Vermeidung von Kontamination beim Umgang mit Zellen und biologischen Proben.

Details:

• Arbeitsplatz desinfizieren und steril halten
• Steriltechnik anwenden: Arbeiten in Laminar-Flow-Werkbank, sterile Instrumente und Reagenzien verwenden
• Persönliche Schutzkleidung: Handschuhe, Kittel, Haarhaube
• Häufiges Wechseln von Handschuhen und Desinfizieren der Hände
• Sterilisation von Lösungen/Medien: Autoklavieren oder Sterilfiltration
• Direkter Kontakt von Luft und Proben vermeiden
• Proben und Reagenzien korrekt lagern und handhaben
• Regelmäßige Kontrolle von Sterilverfahren und Arbeitsumgebung

GFP und fluoreszierende Proteine: Genetische Marker

Definition:

GFP (Grünes Fluoreszenzprotein) und andere fluoreszierende Proteine: genetische Marker, die zur Visualisierung und Lokalisierung spezifischer Proteine in Zellen verwendet werden.

Details:

• GFP kam ursprünglich von der Qualle Aequorea victoria.
• Emission von grünem Licht (\textlambda max ≈ 509 nm) nach Anregung mit blauem Licht.
• Gen für GFP kann in verschiedene Organismen kloniert werden.
• Verwendung als Fusionsprotein zur Markierung von Zielproteinen.
• Einsatzgebiete: Zell- und Entwicklungsbiologie, Proteininteraktionsstudien, intrazelluläre Signalwege.
• Ähnliche Proteine: YFP (Gelbes Fluoreszenzprotein), CFP (Cyan Fluoreszenzprotein), RFP (Rotes Fluoreszenzprotein).

FRET: Fluoreszenzresonanzenergietransfer zur Interaktionsanalyse

Definition:

Methode zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in Zellen basierend auf Energieübertragung zwischen zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Donor und Akzeptor).

Details:

• Energieübertragung erfolgt nur, wenn Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe (<10 nm)
• Effizienz der Übertragung hängt von dem Abstand und der Orientierung der Farbstoffe ab
• Donor gibt Energie an Akzeptor ab, wodurch dieser fluoresziert
• Messung der Veränderung in Fluoreszenz der Farbstoffe ermöglicht Rückschlüsse auf Interaktionen
• Anwendungen: Analyse von dynamischen Prozessen in lebenden Zellen, Protein-Interaktionen, Konformationsänderungen

Co-Kultursysteme: Mehrzelluläre Modelle

Definition:

Konzepte der Co-Kultursysteme für die Nachbildung von mehrzelligen Interaktionen in vitro.

Details:

• Reproduzieren von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen
• Anwendungen: Krebsforschung, Gewebeengineering, Immunantwort
• Techniken: Transwell-Assays, 3D-Kulturen, Mikrofluidik-Chips
• Wichtige Parameter: Zelltypen, Medienzusammensetzung, Wachstumsbedingungen

CRISPR/Cas9: Genom-Editing-Techniken

Definition:

Methode zur gezielten Veränderung von DNA-Sequenzen im Genom.

Details:

• CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats - DNA-Sequenzen im Bakteriengenom
• Cas9: CRISPR-assoziiertes Protein 9 - Nuklease für DNA-Spaltung
• Guide RNA (gRNA): Leitet Cas9 zu spezifischer DNA-Sequenz
• Doppelstrangbruch (DSB) durch Cas9
• Reparaturmechanismen: Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder Homology Directed Repair (HDR)
• Anwendungen: Genomforschung, Gentherapie, Landwirtschaft

Live-Cell Imaging: Echtzeitbeobachtung von Zellverhalten

Definition:

Live-Cell Imaging ermöglicht die Echtzeitbeobachtung von dynamischen Zellprozessen durch den Einsatz von Mikroskopie und fluoreszierenden Markern.

Details:

• Verwendet Fluoreszenzmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie und Konfokalmikroskopie
• Ermöglicht die Nachverfolgung von Zellbewegungen, Zellteilung und zellulären Kommunikationsprozessen
• Zellkulturen oft in speziellen Inkubationskammern gehalten, um physiologische Bedingungen aufrechtzuerhalten
• Nützliche Techniken: FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), FRET (Förster Resonance Energy Transfer)
• Erfordert präzise Bildgebungs- und Bildanalyse-Tools