Techniken der Zellbiologie (Wahl Biochemie/Zellbiologie) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Die Lichtmikroskopie ist eine der wichtigsten Techniken in der Zellbiologie und wird zur Vergrößerung und Bildgebung kleiner Objekte wie Zellen und Geweben genutzt. Schlüsselkomponenten der Lichtmikroskopie umfassen die Auflösungsgrenze, die durch die Wellenlänge des Lichts limitiert ist, sowie verschiedene Mikroskopiearten wie Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie. Wichtige Kenngrößen sind unter anderem die Vergrößerung, die numerische Apertur (NA) und der Arbeitsabstand. In der Fluoreszenzmikroskopie werden fluoreszierende Moleküle eingesetzt, um spezifische Zellstrukturen zu markieren. Die Probenvorbereitung in der Lichtmikroskopie kann Fixierung, Färbung und eventuell Einbettung umfassen. Die Bildqualität wird durch verschiedene Faktoren wie Beugung und Aberrationen beeinflusst. Anwendungen der Lichtmikroskopie umfassen die Untersuchung von Zellwachstum, Zellteilung, der Struktur von Organellen, Proteinlokalisierung und Pathologie.

a)

a) Erläutere die Funktionsweise und Anwendungsbereiche der Fluoreszenzmikroskopie. Erkläre dabei insbesondere, wie fluoreszierende Moleküle zur Markierung spezifischer Zellstrukturen verwendet werden.

Lösung:

a) Funktionsweise und Anwendungsbereiche der Fluoreszenzmikroskopie

• Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Art der Lichtmikroskopie, bei der fluoreszierende Moleküle (Fluorophore) genutzt werden, um spezifische Zellstrukturen sichtbar zu machen.
• Ein spezifischer Bereich in der Zelle kann durch die Anbindung von Fluorophoren an Antikörper oder andere biomolekulare Strukturen markiert werden, die sich gezielt an das Zielprotein oder die Zielstruktur binden.
• Diese Fluorophore absorbieren Licht einer bestimmten Wellenlänge (Anregungslicht) und emittieren Licht einer anderen, längeren Wellenlänge (Emissionslicht). Diese Emission kann durch spezielle Filter und Detektoren im Mikroskop erfasst und in ein Bild umgewandelt werden.
• Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubt es Forschern, sehr spezifische Strukturen und Moleküle innerhalb der Zellen zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich in Bereichen wie der Zellbiologie, Molekularbiologie und Medizin.
• Ein Beispiel ist die Verwendung von grün fluoreszierendem Protein (GFP), das genetisch an Proteine fusioniert werden kann, um die Bewegung und Lokalisierung dieser Proteine in lebenden Zellen in Echtzeit zu beobachten.

Insgesamt bietet die Fluoreszenzmikroskopie eine hohe Spezifität und Sensitivität, wodurch sie eine unverzichtbare Technik in der modernen biomedizinischen Forschung ist.

c)

c) Diskutiere die Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und wie diese die Bildqualität in der Lichtmikroskopie beeinflussen können. Erkläre auch, warum Fixierung und Färbung der Proben notwendig sind.

Lösung:

c) Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und deren Einfluss auf die Bildqualität in der Lichtmikroskopie

Die Probenvorbereitung ist ein entscheidender Schritt in der Lichtmikroskopie, der die Qualität und Genauigkeit der resultierenden Bilder erheblich beeinflusst. Hier sind einige der wichtigsten Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und deren Auswirkungen auf die Bildqualität:

• Fixierung:
  • Die Fixierung dient dazu, die Zell- und Gewebestrukturen in einem möglichst lebensnahen Zustand zu bewahren und die Probe gegen Zersetzung zu schützen.
  • Eine unzureichende Fixierung kann zu Artefakten führen, die die Interpretation der Mikroskopiebilder erschweren.
  • Eine zu starke Fixierung kann hingegen Proteine denaturieren und die Zellstrukturen verfälschen.
• Färbung:
  • Die Färbung erhöht den Kontrast der Probe, sodass spezifische Strukturen besser sichtbar gemacht werden können.
  • Die Auswahl des richtigen Farbstoffs und der richtige Färbeprozess sind entscheidend, um Zielstrukturen klar und deutlich darzustellen.
  • Eine ungleichmäßige Färbung oder Überfärbung kann jedoch zu unscharfen Bildern und starken Hintergrundsignalen führen.
• Einbettung:
  • Für bestimmte Proben kann es notwendig sein, sie in Kunstharz oder Paraffin einzubetten, um dünne Schnitte für die Mikroskopie zu erstellen.
  • Ein unsachgemäßer Einbettungsprozess kann die Morphologie der Probe verändern und zu Fehlern in der Analyse führen.
• Beugung und Aberrationen:
  • Optische Abweichungen wie Beugung und Aberrationen können durch ungleichmäßige oder unzureichende Probenvorbereitung verstärkt werden.

Notwendigkeit von Fixierung und Färbung:

• Die Fixierung ist notwendig, um die strukturelle Integrität der Zellen und Gewebe zu bewahren und sie vor Abbau zu schützen, was die Analyse ihrer natürlichen Zustände ermöglicht.
• Die Färbung hilft, bestimmte Teile der Zelle oder des Gewebes hervorzuheben, indem es spezifische biologisch relevante Moleküle sichtbar macht, die ansonsten transparent oder kaum sichtbar wären.

Durch eine sorgfältige Probenvorbereitung mit geeigneten Fixierungs- und Färbetechniken kann die Qualität der resultierenden Mikroskopiebilder maximiert werden, was zu präziseren und zuverlässigeren wissenschaftlichen Erkenntnissen führt.

Aufgabe 2)

Eine Forscherin möchte konfokale Mikroskopie nutzen, um die Dynamik von Zellstrukturen in lebenden Zellen zu beobachten. Sie hat fluoreszenzmarkierte Proteine eingeführt, die spezifische Strukturen in der Zelle markieren. Diese Methode erfordert präzise optische Schnittführung, um die verschiedenen Schichten der Zelle darzustellen und in ein dreidimensionales Bild zu rekonstruieren.

a)

Erläutere die Funktionsweise der Lochblende (Pinhole) im konfokalen Mikroskop und wie sie zu einer verbesserten Bildqualität beiträgt. Welche Probleme in der Bildgebung lebender Zellen werden durch den Einsatz der Lochblende vermindert?

Lösung:

Die Funktionsweise der Lochblende (Pinhole) im konfokalen Mikroskop und ihre Rolle bei der Verbesserung der Bildqualität kann wie folgt erläutert werden:

• Erklärung der Lochblende: Die Lochblende ist eine kleine Öffnung, die sich im Strahlengang des konfokalen Mikroskops befindet. Sie ist so positioniert, dass sie nur das Licht, das von der fokalen Ebene der Probe stammt, durchlässt. Licht, das aus anderen Ebenen der Probe kommt und daher verschwommen ist, wird von der Lochblende blockiert.
• Verbesserung der Bildqualität: Die Hauptaufgabe der Lochblende besteht darin, das Streulicht und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, die aus den außerhalb der Fokalebene liegenden Ebenen stammen. Dies führt zu einer höheren Auflösung und einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis, was schärfere und klarere Bilder zur Folge hat.
• Problem der Bildgebung lebender Zellen: Bei der Beobachtung lebender Zellen tritt häufig das Problem auf, dass Licht aus verschiedenen Schichten der Zelle zu Streulicht und Hintergrundgeräuschen führt. Diese Effekte können das Bild verschwommen und unscharf machen. Durch den Einsatz der Lochblende wird dieses Problem vermindert, da nur das Licht aus der Fokalebene detektiert wird und somit klare, dreidimensionale Bilder der Zellstruktur entstehen.

b)

Während der Beobachtung stellte die Forscherin fest, dass einige Zellstrukturen schneller verblassen als andere. Erkläre das Phänomen des Photobleachings und beschreibe, wie die konfokale Mikroskopie diesen Effekt minimiert.

Lösung:

Das Phänomen des Photobleachings und die Maßnahmen der konfokalen Mikroskopie, um diesen Effekt zu minimieren, lassen sich wie folgt erläutern:

• Phänomen des Photobleachings: Photobleaching tritt auf, wenn fluoreszierende Moleküle, die zur Markierung von Zellstrukturen verwendet werden, durch anhaltende Belichtung mit intensivem Licht irreversibel zerstört werden. Dies führt dazu, dass die markierten Bereiche im Laufe der Zeit ihre Fluoreszenz verlieren und somit im Bild verblassen. Der Mechanismus des Photobleachings umfasst photochemische Reaktionen, bei denen durch die Einwirkung von Licht reaktive Sauerstoffspezies erzeugt werden, die die Fluorophore zerstören.
• Minimierung des Photobleachings durch konfokale Mikroskopie: Die konfokale Mikroskopie trägt auf mehrere Weisen zur Minimierung des Photobleachings bei:
• Gezielte Belichtung: Durch die Verwendung der Lochblende wird nur das Licht auf die fokale Ebene der Probe gerichtet und somit nur ein kleiner Bereich der Probe beleuchtet. Dies reduziert die Gesamtexposition der Probe gegenüber intensivem Licht.
• Z-Planscannen: Da die Probe Schicht für Schicht gescannt wird, wird die Beleuchtungsdauer für jede Schicht minimiert, was ebenfalls zum Schutz vor Photobleaching beiträgt.
• Optimierung der Fluorophore: Durch die Auswahl von Fluorophoren, die weniger anfällig für Photobleaching sind, kann die Stabilität der Fluoreszenz verbessert werden.
• Verwendung von Lasern mit geringer Intensität: Bei der konfokalen Mikroskopie können Laser mit geringer Intensität verwendet werden, um ausreichend Fluoreszenz für die Bildgebung zu erzeugen, ohne die Probe unnötig stark zu belichten.

Durch diese Methoden kann die konfokale Mikroskopie die Effekte des Photobleachings deutlich reduzieren und eine längere Beobachtungsdauer ermöglichen, was besonders wichtig für dynamische Studien an lebenden Zellen ist.

c)

Die Forscherin möchte die Bewegung bestimmter Zellstrukturen entlang der Z-Achse analysieren. Angenommen, die Z-Achse erstreckt sich über eine Dicke von 100 µm, und die Mikroskopauflösung beträgt 0,5 µm pro optischem Schnitt. Berechne, wie viele optische Schnitte notwendig sind, um die gesamte Z-Achse zu scannen und wie hoch die Gesamtaufnahmedauer wäre, wenn jeder Schnitt 2 Sekunden benötigt.

Lösung:

Um die Bewegung bestimmter Zellstrukturen entlang der Z-Achse zu analysieren, muss die gesamte Z-Achse in mehreren optischen Schnitten erfasst werden. Dafür sind folgende Schritte notwendig:

• Berechnung der Anzahl der optischen Schnitte:

  Die Z-Achse hat eine Dicke von 100 µm. Mit einer Auflösung von 0,5 µm pro optischem Schnitt können wir die Anzahl der benötigten Schnitte wie folgt berechnen:

  • Anzahl der Schnitte = 100 µm / 0,5 µm/Schnitt

  Durchführung der Berechnung:

  • Anzahl der Schnitte = 100 / 0,5 = 200 optische Schnitte
• Berechnung der Gesamtaufnahmedauer:

  Wenn jeder Schnitt 2 Sekunden benötigt, ergibt sich die Gesamtaufnahmedauer wie folgt:

  • Gesamtaufnahmedauer = Anzahl der Schnitte * Dauer pro Schnitt

  Durchführung der Berechnung:

  • Gesamtaufnahmedauer = 200 Schnitte * 2 Sekunden/Schnitt = 400 Sekunden

Die Forscherin muss also 200 optische Schnitte durchführen, um die gesamte Z-Achse zu scannen. Die Gesamtaufnahmedauer beträgt 400 Sekunden.

Aufgabe 3)

Bei der Arbeit mit Zellen und biologischen Proben ist die Vermeidung von Kontamination von größter Bedeutung. Hier sind einige grundlegende Techniken und Hinweise:

• Arbeitsplatz desinfizieren und steril halten
• Steriltechnik anwenden: Arbeiten in Laminar-Flow-Werkbank, sterile Instrumente und Reagenzien verwenden
• Persönliche Schutzkleidung: Handschuhe, Kittel, Haarhaube
• Häufiges Wechseln von Handschuhen und Desinfizieren der Hände
• Sterilisation von Lösungen/Medien: Autoklavieren oder Sterilfiltration
• Direkter Kontakt von Luft und Proben vermeiden
• Proben und Reagenzien korrekt lagern und handhaben
• Regelmäßige Kontrolle von Sterilverfahren und Arbeitsumgebung

a)

(a) Beschreibe detailliert, wie Du einen sterilen Arbeitsplatz vorbereiten würdest, um mit Zellkulturen zu arbeiten. Erkläre dabei, wie Du die verschiedenen Schritte und Sterilisationstechniken umsetzen würdest, um die Kontamination zu minimieren.

Lösung:

Um einen sterilen Arbeitsplatz für die Arbeit mit Zellkulturen vorzubereiten, befolge diese detaillierten Schritte:

• Arbeitsplatz desinfizieren und steril halten: Beginne damit, den gesamten Arbeitsplatz gründlich zu reinigen. Verwende ein Desinfektionsmittel, das gegen eine breite Palette von Mikroorganismen wirksam ist. Desinfiziere alle Oberflächen, einschließlich der Arbeitsfläche, Geräte, und jegliche Gegenstände, die Du verwenden wirst.
• Steriltechnik anwenden: Führe alle Arbeiten in einer Laminar-Flow-Werkbank durch, da diese eine kontinuierliche sterile Luftströmung bietet, die Mikroorganismen von der Arbeitsfläche fernhält. Stelle sicher, dass alle verwendeten Instrumente und Reagenzien steril sind. Dies kann durch Autoklavieren oder Sterilfiltration erreicht werden.
• Persönliche Schutzkleidung: Trage geeignete persönliche Schutzkleidung, dazu gehören sterile Handschuhe, ein Reinraumkittel und eine Haarhaube, um die Kontamination durch Hautpartikel oder Haare zu vermeiden.
• Häufiges Wechseln von Handschuhen und Desinfizieren der Hände: Wechsle regelmäßig Deine Handschuhe und desinfiziere Deine Hände vor jeder Operation. Dies minimiert das Risiko, dass Bakterien oder andere Kontaminanten in die Zellkulturen gelangen.
• Sterilisation von Lösungen/Medien: Sterilisiere alle Lösungen und Medien, die Du mit den Zellkulturen verwendest, entweder durch Autoklavieren oder durch Sterilfiltration. Lagere die Medien in sterilen Behältern und öffne diese nur unter sterilen Bedingungen.
• Direkter Kontakt von Luft und Proben vermeiden: Halte durchgehend die Laminar-Flow-Werkbank eingeschaltet, um eine sterile Umgebung zu gewährleisten. Öffne die Probenbehälter nur innerhalb der Werkbank, um den direkten Kontakt mit der Luft zu minimieren.
• Proben und Reagenzien korrekt lagern und handhaben: Lagere alle Proben und Reagenzien gemäß den Herstellervorgaben, typischerweise bei spezifischen Temperaturen und in sterilen Behältern. Beschrifte alle Behälter eindeutig, um Verwechslungen zu vermeiden.
• Regelmäßige Kontrolle von Sterilverfahren und Arbeitsumgebung: Führe regelmäßig Kontrollen der Sterilverfahren und der Arbeitsumgebung durch. Dies kann durch mikrobiologische Tests oder durch Überprüfung der Laminar-Flow-Werkbank auf ihre Funktionalität passieren.

b)

(b) Du arbeitest mit einer Zellkultur und bemerkst nach einiger Zeit, dass Deine Zellen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination aufweisen. Diskutiere, welche Schritte Du unternehmen würdest, um die Ursache der Kontamination zu identifizieren und zukünftig zu verhindern. Gehe dabei spezifisch auf regelmäßige Kontrollen und den Umgang mit Reagenzien ein.

Lösung:

Wenn Du während der Arbeit mit einer Zellkultur Anzeichen einer bakteriellen Kontamination feststellst, solltest Du folgende Schritte unternehmen, um die Ursache zu identifizieren und zukünftige Kontaminationen zu verhindern:

• Bestätigung der Kontamination: Untersuche die Zellkultur unter dem Mikroskop, um die Art der Kontamination zu bestätigen. Bakterien erscheinen oft als kleine, schnell bewegende Punkte. Du kannst auch eine Probe der Kultur auf ein Nährmedium übertragen und inkubieren, um das Wachstum der Bakterien zu überprüfen.
• Identifizierung der Kontaminationsquelle:
  • Überprüfe alle kürzlich verwendeten Reagenzien und Medien. Stell sicher, dass sie vor der Verwendung sterilisiert wurden und keine sichtbaren Verunreinigungen aufweisen.
  • Kontrolliere die Laminar-Flow-Werkbank auf ihre einwandfreie Funktionalität. Eine defekte Filtereinheit oder ein unzureichender Luftstrom kann zur Kontamination führen.
  • Untersuche die Arbeitsmethoden und -verfahren, um sicherzustellen, dass stets sterile Techniken angewendet wurden. Eine schlechte Handhabung der Instrumente oder unsaubere Arbeitspraktiken können eine Kontamination verursachen.
  • Überprüfe die persönliche Schutzkleidung und die Häufigkeit des Handschuhwechsels. Handschuhe sollten regelmäßig gewechselt und Hände vor jedem Handschuhwechsel desinfiziert werden.
• Regelmäßige Kontrolle:
  • Etabliere ein Programm zur regelmäßigen Kontrolle der Zellkulturen auf Kontamination. Dies sollte die visuelle Inspektion der Kulturen sowie das Anlegen von Testkulturen bei Verdacht auf Kontamination umfassen.
  • Führe regelmäßige mikrobiologische Tests an den Oberflächen der Laminar-Flow-Werkbank und anderen kritischen Bereichen durch, um das Vorhandensein von Mikroorganismen zu überwachen.
  • Kontrolliere regelmäßig die Qualität der verwendeten Reagenzien und Medien durch Sterilitätstests.
• Umgang mit Reagenzien:
  • Stelle sicher, dass alle Reagenzien und Medien unter sterilen Bedingungen gehandhabt und gelagert werden. Dies beinhaltet die Verwendung von sterilen Behältern und die Lagerung bei den empfohlenen Temperaturen.
  • Beschrifte alle Behälter eindeutig, um Verwechslungen zu vermeiden. Beschädigte oder abgelaufene Reagenzien sollten sofort entsorgt werden.
  • Führe vor der Verwendung von neuen Reagenzien und Medien Kontaminationstests durch, um ihre Sterilität zu gewährleisten.
• Dokumentation und Schulung: Dokumentiere alle Schritte und Ergebnisse Deiner Kontaminationsüberprüfung. Schulen regelmäßig alle Mitarbeiter in den besten sterilen Praktiken und aktualisiere die Schulungen, um sicherzustellen, dass alle aktuellen Techniken und Protokolle bekannt sind und angewendet werden.

Aufgabe 4)

Kontext: Du arbeitest in einem Zellbiologielabor und möchtest GFP verwenden, um ein spezifisches Protein in menschlichen Zellen zu visualisieren. Das GFP-Gen stammt ursprünglich von der Qualle Aequorea victoria und emittiert grünes Licht mit einem Emissionsmaximum bei etwa 509 nm nach Anregung mit blauem Licht. Du planst, GFP als Fusionsprotein zu verwenden, um Zielproteine zu markieren. Ähnliche Proteine wie YFP, CFP und RFP könnten ebenfalls von Interesse für Deine Forschung sein.

a)

Aufgabe 1: Beschreibe den Mechanismus der Fluoreszenz von GFP. Was passiert auf molekularer Ebene, wenn das Protein blauem Licht ausgesetzt wird und wie führt dies zur Emission von grünem Licht?

Lösung:

• Anregung: Wenn GFP (Grün fluoreszierendes Protein) blauem Licht ausgesetzt wird, absorbieren bestimmte Aminosäuren im Chromophor das Licht. Diese Aminosäuren sind Teil eines Zyklischen Chromophorsystems im Zentrum des Proteins.
• Elektronenübergang: Die Absorption von Licht hebt die Elektronen im Chromophor auf ein höheres Energieniveau. Der Elektronenübergang veranlasst, dass die Elektronen eine hoch angeregte Zustandsform annehmen.
• Interne Konversion: Nach der Anregung durch blaues Licht kehren die Elektronen durch interne Konversion teilweise zu einem niedrigeren angeregten Zustand zurück. Während dieses Prozesses wird ein Teil der Energie als Wärme abgegeben.
• Fluoreszenz-Emission: Das Protein emittiert dann die verbleibende Energie in Form von grünem Licht, wenn die Elektronen zum Grundzustand zurückkehren. Der Emissionsprozess führt dazu, dass Licht mit einer längeren Wellenlänge (etwa 509 nm), welches im grünen Spektrum liegt, abgegeben wird.
• Stabilität des Chromophors: Der spezifische Aufbau und die Stabilität des Chromophors im GFP sind entscheidend für die effiziente Emission von grünem Licht. Der Chromophor liegt in einer stabilen, abgeschirmten Umgebung, die unerwünschte Reaktionen verhindert und die Effizienz der Fluoreszenz erhöht.

b)

Aufgabe 2: Angenommen, Du möchtest GFP als Marker für ein spezifisches Zielprotein in menschlichen Zellen verwenden. Erkläre den Prozess der Erstellung eines Fusionsproteins, das GFP enthält, und beschreibe, wie dies in einen menschlichen Zellkulturzyklus integriert werden kann.

Lösung:

• Erstellung des Fusionsproteins:
  • Genfusion: Zuerst muss das GFP-Gen mit dem Zielprotein-Gen fusioniert werden. Dies erfolgt durch molekularbiologische Methoden wie PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und Restriktionsenzymverdauung, gefolgt von der Ligation der beiden Gene in einen geeigneten Vektor. In der Regel wird das GFP-Gen entweder an das 5'-Ende (Aminoterminus) oder das 3'-Ende (Carboxyterminus) des Zielprotein-Gens fusioniert.
  • Vektor: Es wird ein Expressionsvektor verwendet, der ein starkes Promotorsystem enthält, um eine effiziente Transkription und Translation des Fusionsproteins zu gewährleisten. Der Vektor sollte auch Antibiotikaresistenzgene enthalten, um die Auswahl transformierter Zellen zu ermöglichen.
• Transformation menschlicher Zellen:
  • Transfektion: Die rekombinante DNA, die das Fusionsprotein-Gen enthält, wird in menschliche Zellen eingebracht. Dies kann durch verschiedene Methoden wie Lipofektion, Elektroporation oder virale Transduktion erfolgen.
  • Selektion: Nach der Transfektion werden die Zellen mit dem entsprechenden Antibiotikum behandelt, um diejenigen Zellen auszuwählen, die erfolgreich die rekombinante DNA aufgenommen haben. Nur die Zellen, die den Vektor tragen, wachsen weiter und können zur weiteren Analyse verwendet werden.
• Integration in den Zellkulturzyklus:
  • Expression und Lokalisierung: Die transfizierten Zellen exprimieren nun das Fusionsprotein. Durch die Fluoreszenz von GFP kann das Zielprotein visualisiert und analysiert werden, z.B. durch Fluoreszenzmikroskopie.
  • Analyse: Die Zellen werden regelmäßig kontrolliert, um die Expression des GFP-gekoppelten Zielproteins zu gewährleisten. Man kann auch verschiedene Behandlungsschritte oder Bedingungen testen und dabei beobachten, wie sich die Lokalisation und Menge des Zielproteins in den Zellen verändert.
  • Experimente: Die mit dem Fusionsprotein markierten Zellen können für eine Vielzahl von Experimenten verwendet werden, darunter Protein-Interaktionsstudien, Verfolgung der Proteinlokalisation, Überwachung der Proteinbewegung und Untersuchung der zellulären Funktionen unter verschiedenen Bedingungen.

c)

Aufgabe 3: Wie würdest Du ein Experiment entwerfen, um die Interaktion zweier Proteine in lebenden Zellen zu untersuchen, indem Du YFP und CFP einsetzt? Erkläre die nötigen Schritte und die Technik, die zur Visualisierung der Interaktionen verwendet wird.

Lösung:

• Experimentelles Design zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion mit YFP und CFP:
• 1. Generierung der Fusionskonstrukte:
  • Genfusion: Das Gen für das erste Protein (Protein A) wird mit dem Gen für CFP (Cyan Fluorescent Protein) fusioniert. Ähnlich wird das Gen für das zweite Protein (Protein B) mit dem Gen für YFP (Yellow Fluorescent Protein) fusioniert. Diese Fusionsgene werden in Expressionsvektoren kloniert.
  • Vektorwahl: Die Vektoren sollten geeignete Promotoren enthalten, um eine starke und konstitutive Expression in den Zielzellen zu gewährleisten. Antibiotikaresistenzgene werden hinzugefügt, um die Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen.
• 2. Transfektion der Zelllinien:
  • Zellkultur: Wähle eine geeignete menschliche Zelllinie für die Experimente aus. Kultiviere die Zellen unter standardisierten Bedingungen, um optimale Wachstumsbedingungen zu gewährleisten.
  • Transfektion: Verwende Methoden wie Lipofektion oder Elektroporation, um die Vektoren, die die Fusionsgene enthalten, in die Zellen einzubringen. Transfiziere die Zellen mit beiden Konstrukten gleichzeitig, sodass sie sowohl das CFP- als auch das YFP-Fusionsprotein exprimieren.
  • Selektion: Wende Antibiotika an, um die Zellen zu selektieren, die erfolgreich transfiziert wurden. Isoliere anschließend stabile Zelllinien, die die Fusionsproteine konstitutiv exprimieren.
• 3. Visualisierung und Analyse der Interaktionen:
  • Fluoreszenzmikroskopie: Verwende ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen zu beobachten. CFP wird bei einer Anregungswellenlänge von etwa 433 nm und einer Emissionswellenlänge von etwa 475 nm fluoreszieren. YFP wird bei einer Anregungswellenlänge von etwa 514 nm und einer Emissionswellenlänge von etwa 527 nm fluoreszieren.
  • FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer): Die Technik zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion wird FRET genannt. Wenn Protein A-CFP und Protein B-YFP in unmittelbarer Nähe zueinander sind (weniger als 10 nm Abstand), kann Energie von CFP auf YFP übertragen werden, was zu einer Emission von YFP führt. Dies weist auf eine direkte Interaktion zwischen den Proteinen hin.
• 4. Durchführung von Kontrollversuchen:
  • Negative Kontrolle: Zellen, die nur CFP oder nur YFP exprimieren, um sicherzustellen, dass keine unspezifische FRET-Signale vorliegen.
  • Positive Kontrolle: Bekannte interagierende Proteine, die mit CFP und YFP fusioniert sind, um zu bestätigen, dass das FRET-Signal korrekt detektiert wird.
• 5. Datenanalyse:
  • FRET-Effizienz: Quantifiziere die FRET-Effizienz, um die Stärke der Interaktion zwischen den Proteinen abzuschätzen. Höhere FRET-Effizienz bedeutet eine stärkere oder engere Interaktion.
  • Auswertung: Analysiere die Bilder und Daten mit geeigneter Software zur Quantifizierung der FRET-Signale und zur Bestimmung der Protein-Interaktionen in den lebenden Zellen.