Transgenic Animals in Agriculture and in Biomedicin (Überfachliche Qualifikationen) - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Du hast den Auftrag, ein transgenes Tier zu entwickeln, das resistent gegen eine bestimmte Krankheit ist. Dafür sollen geeignete DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden. Beschreibe und erläutere den gesamten Entwicklungsprozess unter Berücksichtigung der unten aufgeführten Methoden.

a)

Erläutere, wie Du die CRISPR/Cas9-Technologie einsetzen würdest, um ein Gen, das für die Krankheitsresistenz verantwortlich ist, gezielt in das Genom des Tieres einzufügen. Welche Schritte sind notwendig und wie funktionieren sie auf molekularer Ebene?

Lösung:

Einsatz der CRISPR/Cas9-Technologie zur gezielten Einführung eines Krankheitsresistenz-Gens ins Genom eines Tieres Die CRISPR/Cas9-Technologie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Genom-Editierung. Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Beschreibung, wie Du diese Technologie verwenden kannst, um ein Krankheitsresistenz-Gen gezielt in das Genom eines Tieres einzufügen:

• Schritt 1: Zielsequenz bestimmen Zuerst musst Du die spezifische DNA-Sequenz im Genom des Tieres identifizieren, an der das Krankheitsresistenz-Gen eingefügt werden soll. Dies erfordert die Kenntnis der Zielsequenz (20 Basenpaare), die vom CRISPR/Cas9-System erkannt wird.
• Schritt 2: sgRNA designen Die Zielsequenz wird in Form einer single guide RNA (sgRNA) konstruiert, die eine komplementäre Sequenz zur Ziel-DNA enthält. Die sgRNA wird in das CRISPR/Cas9-System eingeführt und führt die Cas9-Nuklease zu der spezifischen DNA-Stelle.
• Schritt 3: Cas9-Nuklease vorbereiten Die Cas9-Nuklease wird, zusammen mit der sgRNA, in die Zelle eingebracht. Diese Kombination sorgt dafür, dass die Cas9-Nuklease an die Ziel-DNA bindet.
• Schritt 4: DNA-Doppelstrangbruch erzeugen Die Cas9-Nuklease erzeugt einen Doppelstrangbruch an der Zielstelle in der DNA. Dieser Bruch ist der entscheidende Schritt, um das Genom gezielt zu verändern.
• Schritt 5: Einfügen des Krankheitsresistenz-Gens Ein Donor-DNA-Fragment, das das Krankheitsresistenz-Gen enthält sowie homologe Enden zur Reparaturstelle, wird dem System hinzugefügt. Dieses Fragment wird in die Zelle eingeführt und durch homologe Rekombination in die durch die Cas9 entstandene Lücke eingefügt.
• Schritt 6: DNA-Reparatur Die Zelle repariert den Doppelstrangbruch durch homologe Rekombination, wobei das Krankheitsresistenz-Gen in das Genom integriert wird. Die präzise Reparatur sorgt dafür, dass das neue Gen korrekt eingebaut wird.
• Schritt 7: Bestätigung des Erfolgs Nach der Integration des Krankheitsresistenz-Gens müssen molekularbiologische Techniken wie PCR, Sequenzierung oder Southern Blot durchgeführt werden, um zu überprüfen, ob das Gen erfolgreich und fehlerfrei ins Genom des Tieres eingefügt wurde.

Auf molekularer Ebene funktioniert jeder dieser Schritte durch hochspezifische Wechselwirkungen zwischen DNA, RNA und Proteinen. Die Präzision des CRISPR/Cas9-Systems beruht auf der exakten Erkennung der Zielsequenz durch die sgRNA und der anschließenden Aktivität der Cas9-Nuklease, die den Doppelstrangbruch erzeugt. Die Fähigkeit der Zelle zur homologen Rekombination nutzt diese Brüche, um gezielt die Donor-DNA mit dem Krankheitsresistenz-Gen zu integrieren. Diese Technologie ist hochpräzise und bietet enorme Chancen für die genetische Modifikation von Organismen.

b)

Beschreibe die Erstellung eines rekombinanten Plasmids, das das Gen für die Krankheitsresistenz enthält. Wie würdest Du sicherstellen, dass das Plasmid korrekt zusammengesetzt wird und in Bakterien repliziert werden kann? Gehe auch auf die Nutzung von Restriktionsenzymen und Ligasen ein.

Lösung:

Erstellung eines rekombinanten Plasmids zur Vermittlung von Krankheitsresistenz Die Erstellung eines rekombinanten Plasmids, das das Gen für die Krankheitsresistenz enthält, erfordert mehrere sorgfältige Schritte und Techniken. Hier ist eine detaillierte Beschreibung des Prozesses:

• Schritt 1: Auswahl und Isolierung des Krankheitsresistenz-Gens Zu Beginn musst Du die DNA-Sequenz des Gens identifizieren und isolieren, welches für die gewünschte Krankheitsresistenz verantwortlich ist. Dies kann durch PCR-Amplifikation aus der DNA-Quelle erfolgen.
• Schritt 2: Auswahl eines geeigneten Plasmidvektors Wähle einen Plasmidvektor aus, der in Bakterien (meist E. coli) repliziert werden kann. Der Vektor sollte eine Multiple Cloning Site (MCS), ein Antibiotikaresistenz-Gen zur Auswahl und einen origin of replication (Ori) enthalten.
• Schritt 3: Restriktionsverdau Verwende Restriktionsenzyme, um das Plasmid und das Krankheitsresistenz-Gen zu schneiden. Die Enzyme schneiden spezifische DNA-Sequenzen, wodurch klebrige oder stumpfe Enden entstehen. Zum Beispiel könntest Du EcoRI und HindIII verwenden, um sowohl das Plasmid als auch das Gen zu verdauen.
• Schritt 4: Ligation Führe die geschnittenen DNA-Fragmente (Plasmid und Krankheitsresistenz-Gen) zusammen. Verwende DNA-Ligase, um die klebrigen oder stumpfen Enden der DNA-Fragmente zu verbinden. Dies führt zur Bildung eines rekombinanten Plasmids.
• Schritt 5: Transformation Übertrage das rekombinante Plasmid in kompetente E. coli-Zellen durch einen Transformationsprozess wie Hitzeschock oder Elektroporation. Die Bakterien nehmen das Plasmid auf und beginnen es zu replizieren.
• Schritt 6: Selektion Plattiere die transformierten Bakterien auf ein Selektionsmedium, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Nur Bakterien, die das rekombinante Plasmid tragen, überleben und bilden Kolonien.
• Schritt 7: Bestätigung der korrekten Plasmidkonstruktion Isoliere Plasmid-DNA aus den überlebenden Bakterienkolonien und überprüfe die Konstruktion durch Restriktionsverdau und Gel-Elektrophorese oder Sequenzierung, um sicherzustellen, dass das Krankheitsresistenz-Gen korrekt in den Plasmidvektor eingefügt wurde.

Auf molekularer Ebene:

• Restriktionsenzyme: Enzyme, die spezifische DNA-Sequenzen erkennen und schneiden. Dies ermöglicht die gezielte Manipulation von DNA-Fragmente.
• Ligasen: Enzyme, die DNA-Fragmente aneinanderfügen, indem sie die Phosphodiesterbindungen zwischen den Nukleotiden herstellen. Dies ist entscheidend für die Rekombination von DNA.
• Plasmidvektoren: Kleine, selbstreplizierende DNA-Moleküle, die zur Klonierung und zum Transfer von Genen verwendet werden können. Sie enthalten Elemente wie Ori, MCS und Selektionsmarker, die die Vermehrung und Selektion in Bakterien ermöglichen.

Durch diese Schritte und Techniken stellst Du sicher, dass das rekombinante Plasmid korrekt zusammengesetzt ist und erfolgreich in Bakterien repliziert werden kann.

c)

Diskutiere den Einsatz viraler Vektoren zur Übertragung des Krankheitsresistenzgens in tierische Zellen. Welche Vorteile und Risiken sind mit dieser Methode verbunden? Beschreibe zudem die Wahl eines geeigneten Virustyps für Dein Experiment.

Lösung:

Einsatz viraler Vektoren zur Übertragung des Krankheitsresistenzgens in tierische Zellen Vorteile und Risiken viraler Vektoren Die Verwendung von viralen Vektoren zur Übertragung von Genen in tierische Zellen ist eine weit verbreitete Methode in der genetischen Forschung und Therapie. Hier sind einige Vorteile und Risiken dieser Methode:

• Vorteile:
  • Hohe Effizienz: Virale Vektoren können Gene effizient in eine Vielzahl von Zelltypen integrieren, was sie zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Genübertragung macht.
  • Stabile Expression: Einige virale Vektoren können Gene dauerhaft in das Genom der Zielzellen integrieren, was zu einer stabilen und anhaltenden Expression führt.
  • Breites Anwendungsfeld: Verschiedene virale Vektoren können verwendet werden, um spezifische Zelltypen oder Gewebe anzusprechen, was die Vielseitigkeit erhöht.
• Risiken:
  • Immunantwort: Der Einsatz von viralen Vektoren kann eine Immunantwort auslösen, die die Effizienz der Genübertragung verringern oder Nebenwirkungen hervorrufen kann.
  • Insertionale Mutagenese: Wenn das Virus Genmaterial in das Wirtsgenom integriert, kann es zu insertionalen Mutagenese kommen, was zu unvorhergesehenen genetischen Veränderungen oder sogar zur Krebsentwicklung führen kann.
  • Größenbeschränkung: Virale Vektoren haben oft eine begrenzte Kapazität für das Einfügen von Fremd-DNA, was die Größe des zu übertragenden Gens einschränken kann.

Wahl eines geeigneten Virustyps für Dein Experiment Die Wahl des geeigneten viralen Vektors hängt von verschiedenen Faktoren ab, darunter die Zielzelle, die gewünschte Dauer der Genexpression und die Sicherheitsanforderungen. Hier sind einige gängige Virustypen und ihre Eigenschaften:

• Lentivirus: Lentivirale Vektoren basieren auf Retroviren und können Gene effizient in teilende und nicht-teilende Zellen integrieren. Sie führen zu einer stabilen Integration ins Genom, was eine langfristige Genexpression ermöglicht. Sie besitzen jedoch das Risiko insertionaler Mutagenese und einer möglichen Immunantwort.
• Adenovirus: Adenovirale Vektoren integrieren ihr Genom nicht in das Wirtsgenom, weshalb die Genexpression nur transient ist. Sie haben eine hohe Transduktionseffizienz in einer Vielzahl von Zelltypen und lösen oft eine starke Immunantwort aus. Adenoviren können größere DNA-Fragmente tragen, was sie flexibel einsetzbar macht.
• Adeno-assoziiertes Virus (AAV): AAV-Vektoren haben eine geringe Immunogenität und eine hohe Sicherheit, da sie nicht in das Wirtsgenom integrieren. Sie können sowohl teilende als auch nicht-teilende Zellen effizient transduzieren. AAV hat jedoch eine begrenzte DNA-Kapazität, die auf etwa 4,7 kb begrenzt ist.
• Retrovirus: Retrovirale Vektoren integrieren sich dauerhaft ins Wirtsgenom und sind bevorzugt für Anwendungen, bei denen eine langanhaltende Expression notwendig ist. Sie können jedoch nur teilende Zellen infizieren, was ihre Anwendungen einschränken kann. Auch hier besteht das Risiko der insertionalen Mutagenese.

Empfehlung für Dein Experiment Basierend auf den Anforderungen des Experiments zur Entwicklung eines transgenen Tieres, das resistent gegen eine bestimmte Krankheit ist, könnte ein Lentivirus oder AAV-Virus am geeignetsten sein:

• Lentivirus: Geeignet für stabile und langfristige Integration des Krankheitsresistenz-Gens in das Genom der Zielzellen, vor allem wenn das Tier eine anhaltende Resistenz benötigen sollte.
• AAV: Geeignet, wenn eine stabile, aber nicht-integrierende und somit sicherere Genübertragung bevorzugt wird, besonders wenn das zu übertragende Gen klein genug ist, um in die Kapazität des Vektors zu passen.

Die Entscheidung für den geeigneten Virustyp sollte auf der detaillierten Abwägung der spezifischen Abhängigkeiten der Krankheitsresistenz, der Zielzellen und des Sicherheitsprofils basieren.

d)

Vergleiche die Methoden Gene Targeting und Random Integration in Bezug auf ihre Effizienz und Zielgenauigkeit. Welche Methode würdest Du bevorzugen, um sicherzustellen, dass das Krankheitsresistenzgen stabil und funktionell im Genom des Tieres integriert wird? Begründe Deine Wahl.

Lösung:

Vergleich von Gene Targeting und Random Integration Um ein transgenes Tier zu entwickeln, das resistent gegen eine bestimmte Krankheit ist, stehen Dir zwei grundlegende Methoden zur Auswahl: Gene Targeting und Random Integration. Beide Methoden haben ihre eigenen Vor- und Nachteile hinsichtlich Effizienz und Zielgenauigkeit. Gene Targeting Gene Targeting ist eine präzise Methode zur genetischen Modifikation, die es ermöglicht, spezifische DNA-Sequenzen im Genom zielgerichtet zu verändern. Dies wird typischerweise durch homologe Rekombination erreicht.

• Zielgenauigkeit: Sehr hoch
• Effizienz: Niedriger als Random Integration
• Methodik: Erfordert die Verwendung von DNA-Konstrukten, die homologe Sequenzen enthalten, die das Zielgen flankieren. Diese Konstrukte werden in die Zellen eingebracht, und durch homologe Rekombination wird die gewünschte genetische Veränderung an der Zielposition eingebaut.
• Vorteile:
  • Präzise Einfügung in eine spezifische Zielregion
  • Reduziertes Risiko ungeplanter Insertionsmutationen
  • Möglichkeit zur gerichteten Veränderung spezifischer Genloci
• Nachteile:
  • Geringere Effizienz
  • Komplexerer und zeitaufwendigerer Prozess

Random Integration Bei der Random Integration wird das Fremdgen zufällig in das Genom integriert. Dies geschieht üblicherweise durch Techniken wie Mikroinjektion oder die Verwendung von viralen Vektoren.

• Zielgenauigkeit: Niedrig
• Effizienz: Sehr hoch
• Methodik: Das Krankheitsresistenzgen wird als Teil eines DNA-Fragments oder Plasmids in die Zielzellen eingeführt, wo es zufällig in das Genom integriert wird.
• Vorteile:
  • Sehr hohe Effizienz der Genübertragung
  • Schnellerer Prozess im Vergleich zum Gene Targeting
• Nachteile:
  • Unvorhersehbare Insertionsorte können Genfunktionen stören oder Silencing-Effekte verursachen
  • Erhöhtes Risiko von Insertionsmutagenese
  • Weniger Kontrolle über die Genexpression

Bevorzugte Methode und Begründung Für die stabile und funktionelle Integration des Krankheitsresistenzgens in das Genom des Tieres würde ich Gene Targeting bevorzugen. Diese Wahl begründet sich durch folgende Aspekte:

• Hohe Zielgenauigkeit: Gene Targeting ermöglicht es, das Gen gezielt in eine spezifische genetische Umgebung einzufügen, was das Risiko unerwünschter Effekte minimiert.
• Stabilität und Funktionalität: Durch präzises Targeting an eine bekannte und gut charakterisierte Region im Genom kann die stabile Integration und die korrekte Funktion des Krankheitsresistenz-Gens besser sichergestellt werden.
• Reduzierte Risiko von Mutagenese: Da Gene Targeting spezifisch ist, verringert sich das Risiko, dass wichtige Genfunktionen durch zufällige Integration gestört werden.

Obwohl Gene Targeting hinsichtlich der Effizienz niedriger ist, überwiegen die Vorteile der Präzision und Sicherheit, insbesondere wenn es darum geht, ein genetisch modifiziertes Tier zu erzeugen, das eine stabile und funktionelle Resistenz gegen eine Krankheit zeigt. Daher ist Gene Targeting in diesem Fall die bevorzugte Methode.

Aufgabe 2)

CRISPR/Cas-Genom-Editing-Werkzeuge ermöglichen gezielte DNA-Modifikationen. Das CRISPR/Cas-System besteht aus CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) und einem Cas-Protein (CRISPR-associated Protein). Eine Leit-RNA (crRNA) führt das Cas9-Protein zu spezifischen DNA-Sequenzen, wo Cas9 die DNA schneidet. Die Reparatur erfolgt entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder Homology-Directed Repair (HDR). Diese Technologie wird für Gen-Knockouts, Gen-Korrekturen und Gen-Integrationen genutzt und findet Anwendung in der Forschung, Landwirtschaft und Medizin.

a)

Erkläre den Prozess des Gen-Knockouts mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems. Gehe dabei auf die einzelnen Schritte ein, beginnend mit der Einführung der Leit-RNA und des Cas9-Proteins in die Zelle bis hin zur Funktion der Reparaturmechanismen NHEJ und HDR. Welche Rolle spielen diese Mechanismen bei einem Gen-Knockout?

Lösung:

Prozess des Gen-Knockouts mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems

• 1. Einführen der Leit-RNA (crRNA) und Cas9-Protein in die Zelle:Der erste Schritt im Gen-Knockout-Prozess besteht darin, die Leit-RNA (crRNA) und das Cas9-Protein in die Zielzelle einzuführen. Dies kann durch verschiedene Methoden erfolgen, wie z.B. durch Plasmid-DNA, virale Vektoren oder direkte Injektion.
• 2. Bindung der crRNA an die Ziel-DNA-Sequenz:Die crRNA ist komplementär zur Ziel-DNA-Sequenz, die modifiziert werden soll. Sobald die crRNA und das Cas9-Protein in der Zelle angekommen sind, führt die crRNA das Cas9-Protein zu der spezifischen DNA-Sequenz.
• 3. Schneiden der DNA durch Cas9:Das Cas9-Protein erzeugt einen Doppelstrangbruch (Double-Strand Break, DSB) an der Ziel-DNA-Sequenz. Dies ist ein kritischer Schritt im Gen-Knockout-Prozess, da der DSB zu einer Unterbrechung des Gens führt.
• 4. Reparaturmechanismen der Zelle (NHEJ und HDR):Nach dem Erzeugen des Doppelstrangbruchs greifen die Reparaturmechanismen der Zelle ein, um den Schaden zu beheben. Dies erfolgt entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder Homology-Directed Repair (HDR).
• Non-Homologous End Joining (NHEJ):NHEJ ist ein schneller, aber fehleranfälliger Reparaturmechanismus. Dabei werden die Enden der beschädigten DNA direkt miteinander verbunden, was häufig zu Insertionen oder Deletionen (Indels) führt. Diese Indels können zu einer Verschiebung des Leserasters und einer Funktionsuntüchtigkeit des Gens führen, was den eigentlichen Gen-Knockout bewirkt.
• Homology-Directed Repair (HDR):HDR ist ein präziserer Mechanismus, bei dem eine homologe DNA-Vorlage zur Reparatur verwendet wird. Dieser Mechanismus wird oft für Genkorrekturen oder Gen-Integrationen genutzt. Bei einem Gen-Knockout ist HDR weniger relevant, da das Ziel darin besteht, das Gen zu inaktivieren, nicht zu korrigieren oder zu ergänzen.

Zusammengefasst ist der Gen-Knockout-Prozess durch das CRISPR/Cas9-System eine Abfolge von Schritten, die mit der Einführung der Leit-RNA und des Cas9-Proteins in die Zielzelle beginnt und durch die NHEJ-Reparaturmechanismen abgeschlossen wird, wodurch das Zielgen inaktiviert wird.

b)

Betrachte die Szenarien, in denen beide Reparaturmechanismen NHEJ und HDR verwendet werden: a) Berechne die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gen-Knockout erfolgreich ist, wenn angenommen wird, dass NHEJ 80% der Fälle und HDR 20% der Fälle übernimmt und nur NHEJ für Effektivität sorgt. b) Diskutiere, wie die Wahl des Reparaturmechanismus die Effizienz und Präzision des Genom-Editing beeinflussen kann. Inwiefern sind diese Überlegungen bedeutsam für Anwendungen in der Landwirtschaft und Medizin?

Lösung:

Scenario-Szenarien mit NHEJ und HDR im CRISPR/Cas-System

• 1. Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Gen-Knockouts berechnen:a) Berechnung:Angenommen, dass Non-Homologous End Joining (NHEJ) in 80% der Fälle und Homology-Directed Repair (HDR) in 20% der Fälle erfolgt, und dass nur NHEJ für die Gen-Knockout-Effektivität sorgt:
  • Wahrscheinlichkeit, dass NHEJ auftritt: 80% (0,80)
  • Wahrscheinlichkeit, dass HDR auftritt: 20% (0,20)
  Daraus folgt, dass die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gen-Knockout erfolgreich ist, der Prozentsatz ist, in dem NHEJ auftritt. Das bedeutet, die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Gen-Knockouts ist 80% (0,80).
• 2. Diskussion der Wahl des Reparaturmechanismus:b) Diskussion:Effizienz und Präzision des Genom-Editing:
  • NHEJ (Non-Homologous End Joining):NHEJ ist ein schneller und häufiger Reparaturmechanismus, aber es führt oft zu Insertionen oder Deletionen (Indels) am Reparaturort. Dies kann zu einer Verschiebung des Leserasters oder zu Mutationen führen, die das Zielgen inaktivieren (Knockout). Daher ist NHEJ für den Gen-Knockout effizient, jedoch weniger präzise.
  • HDR (Homology-Directed Repair):HDR ist ein präziserer Mechanismus, der eine homologe DNA-Vorlage zur Reparatur verwendet. Dies wird häufig für exakte Genkorrekturen oder Gen-Integrationen genutzt. HDR ist präziser als NHEJ, aber weniger effizient und tritt seltener auf.
  Bedeutung für Anwendungen in der Landwirtschaft und Medizin:
  • Landwirtschaft:In der Landwirtschaft könnte die Verwendung von NHEJ bevorzugt werden, um Pflanzen mit gewünschten Eigenschaften schnell zu erzeugen, indem spezifische Gene inaktiviert werden. Die schnelle und effiziente Erstellung neuer Pflanzensorten kann den Ertrag steigern und Resistenzen gegen Krankheiten und Schädlinge verbessern.
  • Medizin:In der medizinischen Forschung und Therapie würde die Präzision von HDR möglicherweise bevorzugt werden, insbesondere bei der Korrektur genetischer Mutationen oder der Integration therapeutischer Gene in das Genom. Hier könnte die Genauigkeit von HDR dazu beitragen, Off-Target-Effekte und ungewollte Mutationen zu minimieren, was für die Sicherheit und Wirksamkeit von Gentherapien entscheidend ist.

Aufgabe 3)

Die genetische Verbesserung der Krankheitsresistenz bei Nutztieren bietet eine vielversprechende Möglichkeit zur Steigerung der Tiergesundheit und Reduzierung des Medikamenteneinsatzes. So wurde beispielsweise der Einsatz von CRISPR/Cas9 zur gezielten Genom-Editierung angewandt, um spezifische Resistenzen gegen Krankheitserreger wie PRRSV bei Schweinen zu erzeugen. Zusätzlich wurden auch Gene-Silencing-Ansätze genutzt, um empfindliche Gene abzuschalten und dadurch die Anfälligkeit der Tiere für Krankheiten zu reduzieren. Diese genetischen Veränderungen werfen jedoch auch ethische und regulatorische Fragen auf, insbesondere im Kontext des deutschen Gentechnik-Gesetzes.

a)

Beschreibe den Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technik und erläutere, wie diese Technologie genutzt wird, um Krankheitsresistenz bei Nutztieren zu erzeugen.

Lösung:

• Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technik

• CRISPR-Sequenzen: CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind DNA-Sequenzen, die in den Genomen von Bakterien zu finden sind. Sie dienen als eine Art Gedächtnis für Viren, die das Bakterium in der Vergangenheit infiziert haben.
• Cas9-Protein: Das Cas9-Protein ist eine Nuklease, das heißt, es kann DNA schneiden. Es wird von einer RNA-Sequenz geleitet, die komplementär zur Ziel-DNA ist.
• Leit-RNA (gRNA): Diese RNA-Sequenz (guide RNA) setzt sich aus zwei Teilen zusammen: einem CRISPR-RNA (crRNA), das die komplementäre Sequenz zur Ziel-DNA enthält, und einem trans-aktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA), das für die Bindung an Cas9 notwendig ist.
• Bindung und Schneiden: Die Leit-RNA leitet Cas9 zur spezifischen DNA-Sequenz, wo Cas9 dann einen Doppelstrangbruch ausführt.
• Reparatur: Der DNA-Doppelstrangbruch kann durch natürliche Reparaturprozesse der Zelle repariert werden. Diese Prozesse können genutzt werden, um spezifische genetische Veränderungen herbeizuführen.

• Anwendung zur Erzeugung von Krankheitsresistenz

• Bei Nutztieren wie Schweinen kann CRISPR/Cas9 verwendet werden, um bestimmte Gene, die für die Anfälligkeit gegenüber Krankheiten verantwortlich sind, gezielt zu verändern oder zu löschen.
• Ein Beispiel ist die gezielte Genom-Editierung zur Erzeugung spezifischer Resistenzen gegen PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus). Hierbei werden gezielt die Gene geändert, die das Virus nutzt, um in die Zellen des Schweins einzudringen und sich zu vermehren.
• Zusätzlich können Gene-Silencing-Ansätze genutzt werden, um empfindliche Gene abzuschalten. Dies geschieht durch die Einführung von Mutationen oder Deletionen in spezifische Gene mit Hilfe von CRISPR/Cas9, wodurch deren Ausdruck unterdrückt wird.
• Diese genetischen Veränderungen machen die Tiere widerstandsfähiger gegenüber bestimmten Krankheitserregern, wodurch der Bedarf an Medikamenten und Antibiotika reduziert wird.

b)

Führe ein konkretes Beispiel für die Einführung von Resistenzen gegen einen bestimmten Krankheitserreger bei Nutztieren mittels CRISPR/Cas9 an. Erläutere den Prozess und die damit verbundenen Vorteile.

Lösung:

• Einführung von Resistenzen gegen PRRSV bei Schweinen mittels CRISPR/Cas9

• Hintergrund: PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) ist ein bedeutender Krankheitserreger, der schwere wirtschaftliche Verluste in der Schweineproduktion verursacht. Es verursacht Atemwegserkrankungen bei Ferkeln und Fortpflanzungsstörungen bei Sauen.

• Prozess der Einführung von Resistenzen:

• Zielgen: Wissenschaftler identifizieren ein Gen im Schweinegenom, das eine Schlüsselrolle bei der Infektion durch PRRSV spielt. Ein solches Gen könnte beispielsweise CD163 sein, ein Rezeptor, den das Virus nutzt, um in die Schweinezellen einzudringen.
• Entwicklung der Leit-RNA: Es wird eine spezifische guide RNA (gRNA) entwickelt, die das CRISPR/Cas9-System zu einer bestimmten Stelle im CD163-Gen leitet.
• CRISPR/Cas9-Editierung: Das CRISPR/Cas9-System wird mittels Mikroinjektion oder durch einen viralen Vektor in Schweineembryonen eingeführt. Das System zielt auf das CD163-Gen ab und führt einen gezielten Doppelstrangbruch durch.
• Reparatur und Mutation: Der natürliche Reparaturmechanismus der Zelle repariert den Bruch, wobei häufig eine Mutation oder Deletion eingeführt wird, die das CD163-Gen funktionslos macht.
• Selektion resistenter Tiere: Embryonen, die erfolgreich editiert wurden, werden in empfängliche Sauen implantiert. Die daraus resultierenden Ferkel werden getestet, ob das CD163-Gen erfolgreich deaktiviert wurde. Diese Tiere werden dann weitergezüchtet, um eine Population von PRRSV-resistenten Schweinen zu erzeugen.

• Vorteile der Einführung von Resistenzen:

• Gesundheit der Tiere: Die Schweine sind resistent gegen PRRSV und erkranken nicht an den schweren Atemwegs- und Reproduktionsproblemen, die normalerweise durch das Virus verursacht werden.
• Reduzierung des Medikamenteneinsatzes: Da die Tiere resistent gegen den Erreger sind, wird der Einsatz von Medikamenten und Antibiotika stark reduziert, was auch zur Vermeidung von Antibiotikaresistenzen beiträgt.
• Wirtschaftliche Vorteile: Gesunde Tiere führen zu höheren Produktionsraten und geringeren Verlusten, was zu einer besseren Rentabilität für Schweinehalter führt.
• Umweltvorteile: Durch den geringeren Bedarf an Medikamenten wird auch die Umwelt weniger belastet, da weniger Arzneimittelrückstände in die Umwelt gelangen.

• Ethische und regulatorische Überlegungen: Die Anwendung von CRISPR/Cas9 bei Nutztieren muss im Einklang mit dem deutschen Gentechnik-Gesetz und ethischen Richtlinien stehen. Dies umfasst gründliche Sicherheitsprüfungen und ethische Überlegungen bezüglich des Tierwohls.

c)

Diskutiere die ethischen Implikationen und regulatorischen Hürden, die mit der genetischen Veränderung von Nutztieren verbunden sind, insbesondere im Kontext des deutschen Gentechnik-Gesetzes.

Lösung:

• Ethische Implikationen der genetischen Veränderung von Nutztieren

• Tierwohl: Eine der Hauptsorgen betrifft das Wohl der Tiere. Kritiker argumentieren, dass genetische Eingriffe das natürliche Wesen der Tiere verändern und potenziell zu unvorhergesehenen gesundheitlichen Problemen führen könnten. Es wird gefordert, dass das Wohlergehen der Tiere höchste Priorität haben muss und dass ihre Lebensqualität nicht beeinträchtigt werden darf.
• Natürliche Integrität: Einige Ethiker vertreten die Ansicht, dass Tiere in ihrer natürlichen Form belassen werden sollten und dass Eingriffe in ihr Genom eine Verletzung ihrer natürlichen Integrität darstellen. Diese Sichtweise betont die moralische Verpflichtung des Menschen, die Natur zu respektieren und nicht unnötig zu manipulieren.
• Nebeneffekte und ungewollte Ergebnisse: Trotz präziser Techniken wie CRISPR/Cas9 bleibt das Risiko unerwünschter Nebenwirkungen oder genetischer Abweichungen. Diese können potenziell das Tier selbst oder die gesamte Umwelt beeinträchtigen, falls die veränderten Gene in die Wildpopulation gelangen.
• Gerechtigkeit und Zugang: Die Einführung solcher Technologien könnte zu Ungleichheiten in der Landwirtschaft führen, indem sie möglicherweise nur großen, reichen Agrarbetrieben zugänglich ist, was kleinere Betriebe benachteiligen könnte.

• Regulatorische Hürden im Kontext des deutschen Gentechnik-Gesetzes

• Sicherheitsprüfungen: Gemäß dem deutschen Gentechnik-Gesetz müssen umfangreiche Sicherheitsprüfungen durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass keine Risiken für Mensch, Tier und Umwelt bestehen. Diese Prüfungen sind zeitaufwändig und kostenintensiv.
• Zulassungsverfahren: Der Prozess zur Genehmigung genetisch veränderter Organismen (GVO) ist streng reguliert und erfordert umfangreiche Dokumentationen und Nachweise der Unbedenklichkeit. Dies kann die Einführung solcher Technologien verzögern oder verhindern.
• Öffentliche Akzeptanz: In Deutschland gibt es erhebliche Bedenken und Skepsis gegenüber GVOs. Die öffentliche Meinung kann den regulatorischen Prozess beeinflussen, und mangelnde Akzeptanz kann dazu führen, dass politische Hürden aufgebaut werden.
• Haftungsfragen: Es müssen klare Regelungen getroffen werden, wer im Falle negativer Auswirkungen haftet. Die genauen rechtlichen Rahmenbedingungen für Haftungsfragen sind oftmals komplex und ein bedeutender Diskussionspunkt.
• Rückverfolgbarkeit und Kennzeichnung: Der Gesetzgeber fordert, dass genetisch veränderte Nutztiere und deren Produkte eindeutig gekennzeichnet und rückverfolgbar sind. Dies stellt eine zusätzliche Herausforderung in der gesamten Produktionskette dar.

• Schlussbemerkungen: Die genetische Veränderung von Nutztieren bietet zwar bedeutende Chancen zur Verbesserung der Tiergesundheit und zur Reduzierung des Medikamenteneinsatzes. Dennoch müssen die ethischen Implikationen und die strengen Anforderungen des deutschen Gentechnik-Gesetzes gründlich berücksichtigt werden, um sicherzustellen, dass solche Eingriffe verantwortungsvoll und ethisch vertretbar durchgeführt werden.

d)

Mathematische Modellierung: Angenommen, ein Forscherteam hat Schweine mit einer neuen Krankheitsresistenz gegen PRRSV entwickelt. Bei einer Feldstudie wurden 100 Schweine beobachtet, von denen 40 genetisch verändert sind und 60 nicht. Während des Studienzeitraums erkrankten 5 der genetisch veränderten Schweine und 20 der nicht veränderten Schweine. Berechne die relative Risikoreduktion (\textit{Relative Risk Reduction, RRR}) und die absolute Risikoreduktion (\textit{Absolute Risk Reduction, ARR}) für die genetisch veränderten Schweine und interpretiere die Ergebnisse.

Lösung:

• Mathematische Modellierung und Berechnung

• Formeln:
Die relative Risikoreduktion (\textit{Relative Risk Reduction, RRR}) und die absolute Risikoreduktion (\textit{Absolute Risk Reduction, ARR}) werden wie folgt berechnet:
• Absolute Risikoreduktion (ARR): \[\text{ARR} = \text{Ereignisrate in der Kontrollgruppe} - \text{Ereignisrate in der experimentellen Gruppe}\]
• Relative Risikoreduktion (RRR): \[\text{RRR} = \frac{\text{ARR}}{\text{Ereignisrate in der Kontrollgruppe}}\]

• Berechnung der Ereignisraten:
• Ereignisrate in der Kontrollgruppe: \[\frac{20}{60} = \frac{1}{3} \text{ oder } 0.3333\]
• Ereignisrate in der experimentellen Gruppe: \[\frac{5}{40} = 0.125\]

• Berechnung der ARR:
• \[\text{ARR} = 0.3333 - 0.125 = 0.2083\]

• Berechnung der RRR:
• \[\text{RRR} = \frac{0.2083}{0.3333} = 0.625 \text{ oder } 62.5\%\]

• Interpretation der Ergebnisse:
• Die Absolute Risikoreduktion (ARR) beträgt 0.2083 oder 20.83%. Das bedeutet, dass die genetisch veränderten Schweine eine um 20.83% geringere Wahrscheinlichkeit haben, an PRRSV zu erkranken, verglichen mit den nicht veränderten Schweinen.
• Die Relative Risikoreduktion (RRR) beträgt 62.5%. Diese Zahl zeigt, dass das Risiko, an PRRSV zu erkranken, bei den genetisch veränderten Schweinen um 62.5% im Vergleich zu den nicht veränderten Schweinen reduziert ist.
• Zusammengefasst deuten diese Berechnungen darauf hin, dass die genetische Veränderung eine signifikante Reduktion des Krankheitsrisikos bei den Schweinen bewirkt hat.

Aufgabe 4)

Tiermodelle für menschliche Krankheiten: Die Nutzung genetisch veränderter Tiere ist ein essenzielles Werkzeug zur Erforschung der zugrunde liegenden Mechanismen menschlicher Krankheiten und zur Entwicklung neuer Therapien. Technologien wie die Genome Editing Methoden CRISPR/Cas9 und TALENs ermöglichen präzise genetische Modifikationen, während transgene Tiere durch das Einfügen von Fremdgenen erzeugt werden. Knockout-Modelle hingegen charakterisieren sich durch das gezielte Ausschalten spezifischer Gene. Diese Modifikationen sind unverzichtbar für die präklinische Testung neuer Arzneimittel und Therapien. Zugleich sind ethische Implikationen wie Tierschutzbestimmungen und ethische Abwägungen von besonderer Bedeutung.

a)

Erläutere den grundlegenden Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technologie. Wie wird CRISPR/Cas9 zur Erzeugung eines Knockout-Modells verwendet, und welche Schritte sind dabei wesentlich?

Lösung:

Grundlegender Mechanismus der CRISPR/Cas9-Technologie:Die CRISPR/Cas9-Technologie ist eine Methode zur gezielten Modifikation von DNA. Sie basiert auf einem Abwehrmechanismus von Bakterien gegen Viren. Hier sind die wesentlichen Schritte und Prinzipien:

• Identifikation der Zielsequenz: Die Zielsequenz in der DNA, die modifiziert werden soll, wird ausgewählt. Dies wird durch die Sequenzierung der DNA bestimmt.
• CRISPR-RNA (crRNA) und Tracer-RNA (tracrRNA): Die CRISPR-RNA (crRNA) erkennt die Ziel-DNA-Sequenz, während die Tracer-RNA (tracrRNA) an die crRNA bindet und somit das Cas9-Protein rekrutiert.
• Cas9-Protein: Das Cas9-Protein ist eine Endonuklease, die in der Lage ist, DNA-Doppelstränge zu schneiden. Es wird durch die gebundene crRNA zu der spezifischen Ziel-DNA-Sequenz geleitet.
• Bindung und Schneiden der DNA: Sobald das Cas9-Protein zum gewünschten DNA-Segment geführt wird, schneidet es die DNA an der Zielstelle.
• Reparaturmechanismen: Nach dem Schnitt durch die Cas9-Endonuklease versuchen die zellulären Reparaturmechanismen, die DNA zu reparieren. Dies geschieht entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ), was häufig zu Insertionen oder Deletionen führt und das Gen funktionsunfähig machen kann, oder durch Homology Directed Repair (HDR), wo eine Reparaturtemplate verwendet wird, um präzise Änderungen einzuführen.

CRISPR/Cas9 zur Erzeugung eines Knockout-ModellsEin Knockout-Modell wird erzeugt, indem man ein bestimmtes Gen gezielt ausschaltet. Hier sind die wesentlichen Schritte:

• Design der crRNA: Die crRNA wird so gestaltet, dass sie eine spezifische Sequenz innerhalb des Zielgens erkennt.
• Komplexbildung: Die crRNA bildet zusammen mit der tracrRNA einen Komplex und bindet an das Cas9-Protein.
• Einführung in die Zelle: Der Komplex aus crRNA, tracrRNA und Cas9-Protein wird in die Zielzellen eingeführt, z.B. durch Mikroinjektion oder virale Vektoren.
• Zielspezifischer Schnitt: Das Cas9-Protein schneidet die DNA an der Zielstelle im Gen.
• NHEJ-Reparatur: Da Non-Homologous End Joining (NHEJ) oft zu Fehlern bei der Reparatur führt, entstehen kleine Insertionen oder Deletionen (Indels), die das Zielgen inaktivieren. Durch diese Mutationen wird die Funktion des Gens ausgeschaltet, was ein Knockout erzeugt.

Durch diese präzisen Schritte ist es möglich, gezielt Gene zu deaktivieren und deren Funktion zu untersuchen, was für die Forschung von großer Bedeutung ist.

b)

Beschreibe die Unterschiede zwischen transgenen Tieren und Knockout-Modellen. Nenne ein konkretes Beispiel jeder Methode, das in der Forschung häufig angewendet wird, und erkläre den wissenschaftlichen Nutzen dieser Modelle.

Lösung:

Unterschiede zwischen transgenen Tieren und Knockout-Modellen:

• Transgene Tiere: Diese Tiere werden durch das Einfügen von Fremdgenen in das Genom erzeugt. Dabei kann es sich um Gene anderer Spezies oder um veränderte Versionen ihrer eigenen Gene handeln. Diese eingeführten Gene werden als Transgene bezeichnet und können entweder zufällig oder gezielt in das Genom integriert werden.
• Knockout-Modelle: Bei Knockout-Modellen wird ein spezifisches Gen gezielt inaktiviert oder ausgeschaltet. Dies geschieht durch Technologien wie CRISPR/Cas9 oder TALENs, die gezielte DNA-Schnitte und die anschließende Reparatur durch zelluläre Mechanismen ermöglichen.

Konkrete Beispiele und deren wissenschaftlicher Nutzen:

• Transgenes Tier: Ein häufig angewendetes Beispiel in der Forschung ist die GFP-transgene Maus (GFP steht für Green Fluorescent Protein). In diesem Modell wird das Gen für GFP in das Genom der Maus eingefügt. Wissenschaftlicher Nutzen: GFP-transgene Mäuse werden oft verwendet, um Gene und Proteine innerhalb der lebenden Organismen sichtbar zu machen. Sie sind nützlich für die Untersuchung von Genexpression, Zellbewegungen und vielen anderen biologischen Prozessen.
• Knockout-Modell: Ein bekanntes Beispiel ist die CFTR-Knockout-Maus. Das CFTR-Gen, welches für das Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein kodiert, wird gezielt ausgeschaltet.Wissenschaftlicher Nutzen: Das CFTR-Knockout-Modell ist entscheidend für die Erforschung von Mukoviszidose (Cystische Fibrose). Durch das Ausschalten dieses Gens können Forscher die Pathologie der Krankheit besser verstehen und wirksame Therapien entwickeln und testen.

Zusammenfassung:Transgene Tiere und Knockout-Modelle sind beide essenzielle Werkzeuge in der biomedizinischen Forschung. Transgene Tiere helfen bei der Untersuchung der Funktion und Lokalisation von Proteinen und Genen, während Knockout-Modelle wichtige Einblicke in die Rolle spezifischer Gene bei Krankheiten und physiologischen Prozessen ermöglichen.

c)

Angenommen, in einem Experiment sollen 30 % der Nachkommen eines genetisch veränderten Mäusepaares ein bestimmtes Fremdgen aufweisen. Wie viele Nachkommen müssen mindestens untersucht werden, um mit einer Wahrscheinlichkeit von über 95 % mindestens ein transgenes Tier zu finden? Benutze die Formel der Binomialverteilung zur Berechnung und stelle Deine Lösung dar.

Lösung:

Berechnung der Anzahl der notwendigen Nachkommen unter Verwendung der Binomialverteilung:Um die Anzahl der nötigen Nachkommen zu berechnen, müssen wir sicherstellen, dass die Wahrscheinlichkeit, mindestens ein transgenes Tier zu finden, mehr als 95 % beträgt. Dafür nutzen wir die Formel der Binomialverteilung.

• Binomialverteilung: Wenn die Wahrscheinlichkeit, dass ein Nachkomme das Fremdgen trägt, 30 % (

  p = 0.30

  ) ist, und die Anzahl der Nachkommen n beträgt, dann ist die Wahrscheinlichkeit, dass genau k Nachkommen das Fremdgen tragen, gegeben durch:
• \[ P(X = k) = \binom{n}{k} p^k (1-p)^{n-k} \]
• Wahrscheinlichkeit kein transgenes Tier: Wir suchen die Wahrscheinlichkeit, dass kein Nachkomme das Fremdgen trägt, spezifiziert durch k = 0:\[ P(X = 0) = \binom{n}{0} p^0 (1-p)^n = (1-0.30)^n = 0.70^n \]
• Wahrscheinlichkeit mindestens ein transgenes Tier: Wir wollen, dass dies mehr als 95 % beträgt:\[ 1 - (0.70)^n > 0.95 \]
• Gleichung umstellen: Wir lösen nach n auf:\[ 0.70^n < 0.05 \]
• Logarithmus anwenden: Um n zu berechnen, wenden wir den natürlichen Logarithmus (ln) an:\[ n \times \text{ln}(0.70) < \text{ln}(0.05) \]
• Gleichung umstellen: Dividiere durch \text{ln}(0.70):\[ n > \frac{\text{ln}(0.05)}{\text{ln}(0.70)} \]\[ n > \frac{-2.9957}{-0.3567} \]\[ n > 8.4 \]
• Runden: Da wir eine ganze Anzahl von Nachkommen benötigen, runden wir auf die nächste ganze Zahl:\[ n ≈ 9 \]

Ergebnis:Mindestens 9 Nachkommen müssen untersucht werden, um mit einer Wahrscheinlichkeit von über 95 % mindestens ein transgenes Tier zu finden.

d)

Diskutiere die ethischen Implikationen der Nutzung genetisch veränderter Tiere in der Forschung. Welche Tierschutzbestimmungen sind zu berücksichtigen, und wie wird die ethische Vertretbarkeit solcher Experimente abgewogen?

Lösung:

Ethische Implikationen der Nutzung genetisch veränderter Tiere in der Forschung:Die Nutzung genetisch veränderter Tiere in der Forschung bringt bedeutende ethische Herausforderungen mit sich. Hier sind einige der wichtigsten Aspekte und Überlegungen:

• Tierschutz: Die ethischen Bedenken konzentrieren sich hauptsächlich auf das Wohl der Tiere. Genetische Veränderungen könnten zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, die das Tierwohl beeinträchtigen, z.B. durch Schmerzen, Leiden oder Beeinträchtigungen der Lebensqualität. Es gilt sicherzustellen, dass die Tiere so wenig wie möglich leiden.
• Notwendigkeit und Nutzen: Ein zentrales ethisches Prinzip ist die Abwägung zwischen dem potenziellen Nutzen der Forschung und dem Leid der Tiere. Forschungsprojekte müssen nachweisen, dass die gewonnenen Erkenntnisse bedeutend und notwendig sind und dass keine alternativen Methoden ohne Tiere zur Verfügung stehen.
• 3R-Prinzip: Ein wichtiger ethischer Leitfaden ist das 3R-Prinzip: Replace (Ersetzen), Reduce (Reduzieren) und Refine (Verbessern).
  • Replace: Immer wenn möglich, sollten Tierversuche durch alternative Methoden ersetzt werden, wie z.B. In-vitro-Studien oder Computersimulationen.
  • Reduce: Die Anzahl der verwendeten Tiere sollte auf das notwendige Minimum reduziert werden, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen.
  • Refine: Die Methoden sollten so verfeinert werden, dass das Leiden der Tiere minimiert wird, z.B. durch optimierte Haltung und Pflege sowie Schmerzmanagement.
• Gesetzliche Bestimmungen: Die Forschung an genetisch veränderten Tieren unterliegt strengen gesetzlichen Regelungen. In vielen Ländern gibt es spezifische Tierschutzbestimmungen und Richtlinien, die eingehalten werden müssen, wie z.B. die EU-Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden.
• Ethische Abwägung und Genehmigungsverfahren: Vor Beginn eines Forschungsprojektes wird eine ethische Abwägung durchgeführt, häufig durch Ethikkommissionen. Diese Kommissionen bewerten die geplanten Experimente hinsichtlich ihres wissenschaftlichen Nutzens und der Beachtung von Tierschutzaspekten. Nur wenn die Experimente als ethisch vertretbar und notwendig eingestuft werden, können sie genehmigt werden.
• Öffentliche Sensibilisierung: Die Gesellschaft ist zunehmend sensibilisiert gegenüber Tierschutzfragen. Transparente Kommunikation und eine verstärkte Aufklärung über die Ziele und Notwendigkeit der Forschung sind wichtig, um das Vertrauen der Öffentlichkeit zu gewinnen und ethische Standards zu gewährleisten.

Zusammenfassung:Die Nutzung genetisch veränderter Tiere in der Forschung führt zu ernsthaften ethischen Überlegungen. Eine strikte Beachtung von Tierschutzbestimmungen, die Anwendung des 3R-Prinzips und eine sorgfältige ethische Abwägung sind unerlässlich, um sicherzustellen, dass solche Experimente sowohl rechtlich als auch moralisch vertretbar sind.