Biochemisches Praktikum - Cheatsheet.pdf

Katalytische Mechanismen von Enzymen

Definition:

Enzyme reduzieren Aktivierungsenergie durch Stabilisierung des Übergangszustands.

Details:

• Induced Fit: Konformationsänderung des Enzyms bei Substratbindung.
• Schlüssel-Schloss-Prinzip: Substratbindung basierend auf komplementären Strukturen.
• Kovalente Katalyse: Vorübergehende kovalente Bindung zwischen Enzym und Substrat.
• Säure-Basen-Katalyse: Protonentransfer zur Stabilisierung des Übergangszustands.
• Metallionen-Katalyse: Metallionen als Kofaktoren zur Stabilisierung oder Redoxreaktionen.
• Beispiel: Serin-Proteasen katalysieren Peptidbindungen durch eine katalytische Triade (Serin, Histidin, Aspartat).

Enzymkinetik

Definition:

Beschreibt die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen, die durch Enzyme katalysiert werden.

Details:

• Michaelis-Menten-Gleichung: \[ v = \frac{{V_{max} \times [S]}}{{K_m + [S]}} \]
• Parameter:
  • \(V_{max}\): Maximalgeschwindigkeit
  • \(K_m\): Michaelis-Konstante, Substratkonzentration bei halber Maximalgeschwindigkeit
  • \([S]\): Substratkonzentration
• Lineweaver-Burk-Gleichung: Doppelt-reziproke Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung: \[ \frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}} \]
• Analyse der Enzymhemmung:
  • Kompetitiv: Hemmung durch Substratanalogon, \(V_{max}\) unverändert, \(K_m\) erhöht
  • Nicht-kompetitiv: Hemmung unabhängig vom Substrat, \(V_{max}\) verringert, \(K_m\) unverändert

SDS-PAGE und Western Blot Techniken

Definition:

SDS-PAGE: Methode zur Trennung von Proteinen nach ihrer Größe. Western Blot: Technik zum Nachweis spezifischer Proteine nach SDS-PAGE.

Details:

• SDS-PAGE: Proteine werden durch \textit{Polyacrylamidgelelektrophorese} nach Größe getrennt.
• SDS bindet an Proteine und verleiht ihnen eine negative Ladung proportional zur Masse.
• Western Blot: Übertragung von Proteinen vom Gel auf eine Membran (Nitrozellulose oder PVDF).
• Nachweis durch spezifische Antikörper.
• Visualisierung mit enzymatischen oder chemilumineszenten Methoden.

Massenspektrometrie zur Proteinanalyse

Definition:

Methode zur Untersuchung von Proteinen mittels Ionisierung und Massen-zu-Ladungs-Verhältnis-Analyse.

Details:

• Probenvorbereitung: Proteine extrahieren und möglicherweise enzymatisch verdauen.
• Ionisierungstechniken: ESI (Electrospray Ionization) oder MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization).
• Massenspektrometer: TOF (Time of Flight), Quadrupol, Orbitrap oder FT-ICR.
• Analyse: Interpretation von Massenspektren zur Identifikation und Quantifizierung von Proteinen.
• Anwendungsbereiche: Proteomik, Identifizierung von PTMs (Post-translational modifications), Protein-Protein-Interaktionen.
• Formel: \( m/z = \frac{m}{z} \)

PCR und qPCR Grundlagen und Anwendungen

Definition:

PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ermöglicht die Vervielfältigung spezifischer DNA-Abschnitte. qPCR (quantitative PCR) quantifiziert die DNA in Echtzeit.

Details:

• PCR-Zyklen: Denaturierung (>90°C), Annealing (~55°C), Verlängerung (72°C)
• Essentielle Komponenten: DNA-Vorlage, Primer, Taq-Polymerase, Nukleotide
• qPCR: Fluoreszenz-basierte Detektion der DNA-Menge während der Amplifikation
• Anwendungen: Genotypisierung, Mutationsanalyse, Pathogenerkennung, Genexpression

CRISPR/Cas9 Genomeditierung

Definition:

CRISPR/Cas9: Molekulares Werkzeug zur gezielten Genomeditierung

Details:

• CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
• Cas9: CRISPR-associated protein 9, Endonuklease
• Funktion: Scherenartige Zerschneidung der DNA an spezifischen Stellen
• Kurze RNA-Sequenzen (gRNA) führen Cas9 zur Ziel-DNA
• Nach dem Schnitt: DNA-Reparaturmechanismen (NHEJ oder HDR)
• NHEJ: Nicht-homologe Endverknüpfung, fehleranfällig
• HDR: Homologe Direktreparatur, präzise Einfügung neuer DNA-Sequenzen
• Anwendungen: Genomforschung, Krankheitsmodellierung, Therapieentwicklung

Fluoreszenzmikroskopie in der Zellkultur

Definition:

Methode zur Visualisierung spezifischer Zellstrukturen durch fluoreszierende Farbstoffe.

Details:

• Anwendung: Markierung von Proteinen/Organellen.
• Wichtige Farbstoffe: DAPI, GFP, FITC.
• Lichtquelle: üblicherweise UV oder spezielles LED-Licht.
• Filter: Emissions- und Anregungsfilter zur Selektion spezifischer Wellenlängen.
• Detektion: CCD-Kamera oder Photomultiplier.
• Vorteile: Hohe Spezifität und räumliche Auflösung.
• Verwendung: Zellbiologische und biochemische Experimente, insbesondere in der Lebendzellmikroskopie.

Laborsicherheit und -vorschriften

Definition:

Regeln und Maßnahmen zur Verhütung von Unfällen und Umgang mit gefährlichen Stoffen im Labor.

Details:

• Schutzkleidung tragen: Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille
• Gefahrenstoffkennzeichnung beachten: R- und S-Sätze, GHS-Symbole
• Umgang mit Chemikalien: Sicherheitsdatenblätter lesen und verstehen
• Notfallmaßnahmen: Notdusche, Augenspüleinrichtungen, Erste-Hilfe-Kasten
• Feuerschutz: Feuerlöscher, Löschdecke, Fluchtwege
• Abfallentsorgung: Trennung und Entsorgung von Chemikalien gemäß den Vorschriften
• Lüftung und Absaugung: Abzüge nutzen, um Dämpfe abzusaugen