Biochemisches Praktikum - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Betrachte den katalytischen Mechanismus der Serin-Proteasen, die Peptidbindungen durch eine katalytische Triade (Serin, Histidin, Aspartat) spalten. Die katalytische Triade ist für die kovalente Katalyse und die Säure-Basen-Katalyse verantwortlich. Serin-Proteasen nutzen eine Kombination von Mechanismen wie Induced Fit und das Schlüssel-Schloss-Prinzip, um ihre spezifische Substrataffinität zu erreichen und die Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen. Metallionen spielen dabei keine Rolle.

a)

Erkläre detailliert den katalytischen Mechanismus von Serin-Proteasen. Gehe insbesondere auf die Rolle der katalytischen Triade ein. Beginne mit der Substratbindung und beschreibe jede Phase des katalytischen Zyklus bis zur Produktfreisetzung.

Lösung:

Der katalytische Mechanismus von Serin-Proteasen

Serin-Proteasen sind eine Klasse von Enzymen, die Peptidbindungen in Proteinen spalten. Der Mechanismus, über den sie dies erreichen, ist hochgradig spezifisch und effizient. Er lässt sich in mehrere Phasen unterteilen:

• 1. Substratbindung: Das Substrat bindet an das aktive Zentrum des Enzyms. Dies geschieht entweder nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip oder durch einen Induced-Fit-Mechanismus, bei dem das aktive Zentrum des Enzyms eine Konformationsänderung durchläuft, um das Substrat optimal zu binden.
• 2. Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes: Nach der Bindung des Substrats stabilisieren verschiedene Wechselwirkungen (z.B. Wasserstoffbrückenbindungen) den Enzym-Substrat-Komplex. Dabei spielt die katalytische Triade eine entscheidende Rolle.
• 3. Rolle der katalytischen Triade: Die katalytische Triade besteht aus den Aminosäuren Serin, Histidin und Aspartat. Diese drei Aminosäuren arbeiten in einem koordinierten Mechanismus zusammen, um das Substrat zu spalten:
• Serin: Das Serin-Rest enthält eine Hydroxylgruppe (-OH), die nukleophil angreift und eine kovalente Bindung zum Carbonyl-Kohlenstoff des Substrats bildet. Dies führt zur Bildung eines tetraedrischen Übergangszustands.
• Histidin: Das Histidin wirkt als allgemeine Base, indem es Protonen zwischen Serin und dem Substrat verschiebt, was den nukleophilen Angriff von Serin ermöglicht.
• Aspartat: Das Aspartat stabilisiert das positiv geladene Histidin durch eine Wasserstoffbrückenbindung, was die Katalyse erleichtert.
• 4. Bildung des Übergangszustands: Der tetraedrische Übergangszustand wird durch die Oxyaniontasche des Enzymkerns stabilisiert, die negativ geladene Zwischenprodukte stabilisiert.
• 5. Spaltung der Peptidbindung: Der Übergangszustand kollabiert, was zur Spaltung der Peptidbindung und zur Freisetzung des ersten Produkts (Aminoterminus-Fragment) führt. Das Enzym-Substrat-Komplex bleibt als Acyl-Enzym-Intermediat bestehen.
• 6. Deacylierung: Wasser greift als Nukleophil das Acyl-Enzym-Intermediat an, was zur Bildung eines zweiten tetraedrischen Übergangszustands führt. Histidin fungiert erneut als Base und fördert die Hydrolyse des Acyl-Enzyms.
• 7. Freisetzung des Produkts: Der zweite Übergangszustand kollabiert, das endgültige Produkt (Carboxyterminus-Fragment) wird freigesetzt, und das Enzym kehrt in seine ursprüngliche Form zurück, bereit für einen neuen katalytischen Zyklus.

Diese detaillierte Beschreibung verdeutlicht, wie Serin-Proteasen auf molekularer Ebene arbeiten, indem sie die spezifische Struktur ihrer katalytischen Triade und ihre Wechselwirkungen nutzen, um Peptidbindungen effizient zu spalten und dabei ihre Reaktionsgeschwindigkeit zu erhöhen.

b)

Mathematisch lässt sich die Enzymkinetik einer Serin-Protease durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschreiben. Angenommen, die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (V_{max}) beträgt 100 μmol/min und die Michaelis-Konstante (K_{M}) beträgt 0,5 mM. Berechne die Reaktionsgeschwindigkeit (v) bei einer Substratkonzentration ([S]) von 0,2 mM. Verwende dazu die Michaelis-Menten-Gleichung \[v = \frac{V_{max} [S]}{K_{M} + [S]}\].

Lösung:

Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit (v) mittels der Michaelis-Menten-Gleichung

Die Michaelis-Menten-Gleichung zur Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeit (v) lautet:

• \[ v = \frac{V_{max} [S]}{K_{M} + [S]} \]

Hierbei sind die Parameter:

• \( V_{max} = 100 \text{ μmol/min} \)
• \( K_{M} = 0,5 \text{ mM} \)
• \( [S] = 0,2 \text{ mM} \)

Um die Reaktionsgeschwindigkeit (v) bei einer gegebenen Substratkonzentration ([S]) zu berechnen, setzen wir die Werte in die Gleichung ein:

• \[ v = \frac{100 \text{ μmol/min} \times 0,2 \text{ mM}}{0,5 \text{ mM} + 0,2 \text{ mM}} \]
• \[ v = \frac{100 \times 0,2}{0,7} \]
• \[ v = \frac{20}{0,7} \]
• \[ v = 28,57 \text{ μmol/min} \]

Tatsächlich beträgt die Reaktionsgeschwindigkeit (v) also 28,57 μmol/min bei einer Substratkonzentration von 0,2 mM.

Aufgabe 2)

EnzymkinetikEin Enzym katalysiert die Reaktion eines Substrats (S) zu einem Produkt (P) durch die Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes. Die Geschwindigkeit dieser enzymkatalysierten Reaktion kann mit Hilfe der Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben werden. Die Michaelis-Menten-Gleichung lautet

• Michaelis-Menten-Gleichung:

  \[ v = \frac{{V_{max} \times [S]}}{{K_m + [S]}} \]

• Parameter:
  • \(V_{max}\): Maximalgeschwindigkeit
  • \(K_m\): Michaelis-Konstante, Substratkonzentration bei halber Maximalgeschwindigkeit
  • \([S]\): Substratkonzentration
• Lineweaver-Burk-Gleichung: Doppelt-reziproke Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung:

  • \[ \frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}} \]

• Analyse der Enzymhemmung:
  • Kompetitive Hemmung durch Substratanalogon, wobei \(V_{max} \) unverändert bleibt und \(K_m \) erhöht ist .
  • Nicht-kompetitive Hemmung unabhängig vom Substrat, wobei \(V_{max} verringert ist und \(K_m \) unverändert ist.

a)

Gegeben ist ein Enzymsystem, das den Abbau eines Substrats S katalysiert. Im Experiment werden die folgenden Anfangsgeschwindigkeiten \(v\) (in \(\text{µmol/min}\)) bei verschiedenen Substratkonzentrationen \([S]\) (in \(\text{mM}\)) gemessen:

• \([S] = 0.1 \text{ mM}\), \(v = 5 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.2 \text{ mM}\), \(v = 9 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.5 \text{ mM}\), \(v = 15 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 1.0 \text{ mM}\), \(v = 18 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 5.0 \text{ mM}\), \(v = 20 \text{ µmol/min}\)

Erstelle ein Lineweaver-Burk-Diagramm dieser Daten und bestimme graphisch die Werte für \(K_m\) und \(V_{max}\).

Lösung:

Lösung der Teilaufgabe:

Um ein Lineweaver-Burk-Diagramm zu erstellen und die Werte für K_m und V_max grafisch zu bestimmen, müssen wir die gegebenen Daten in die erforderliche Form umwandeln. Insbesondere berechnen wir die reziproken Werte von [S] und v, also 1/[S] (in mM^{-1}) und 1/v (in min/µmol).

• Gegebene Daten:

• [S] = 0.1 mM, v = 5 µmol/min → 1/[S] = 10 mM^{-1}, 1/v = 0.2 min/µmol
• [S] = 0.2 mM, v = 9 µmol/min → 1/[S] = 5 mM^{-1}, 1/v = 0.111 min/µmol
• [S] = 0.5 mM, v = 15 µmol/min → 1/[S] = 2 mM^{-1}, 1/v = 0.067 min/µmol
• [S] = 1.0 mM, v = 18 µmol/min → 1/[S] = 1 mM^{-1}, 1/v = 0.056 min/µmol
• [S] = 5.0 mM, v = 20 µmol/min → 1/[S] = 0.2 mM^{-1}, 1/v = 0.05 min/µmol

Nun können wir diese Daten in ein Lineweaver-Burk-Diagramm eintragen. Die x-Achse zeigt 1/[S] und die y-Achse zeigt 1/v.

Die Lineweaver-Burk-Gleichung lautet:

\(\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\)

Die Gleichung einer gerade Linie hat die Form y = mx + b, wobei m die Steigung der Linie ist und b der y-Achsenabschnitt.

Basierend auf der Lineweaver-Burk-Gleichung entspricht die Steigung (m) der Gleichung \(\frac{K_m}{V_{max}}\) und der y-Achsenabschnitt (b) der Gleichung \(\frac{1}{V_{max}}\).

Nehmen wir nun die berechneten reziproken Werte und zeichnen sie auf einem Diagramm, um eine lineare Regressionslinie zu erstellen. Dies ermöglicht es uns, die Werte für \(\frac{1}{V_{max}}\) (y-Achsenabschnitt) und \(\frac{K_m}{V_{max}}\) (Steigung) zu bestimmen.

• Der y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) liefert uns V_max durch den Kehrwert: \(V_{max} = \frac{1}{y-Achsenabschnitt}\).
• Die Steigung erhalten wir aus dem Anstieg der Linie, und daraus können wir \(K_m\) berechnen: \(K_m = \text{Steigung} \times V_{max}\).

Diese Werte werden aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm grafisch oder durch lineare Regression abgeleitet.

b)

Für dasselbe Enzymsystem wie in der vorherigen Aufgabe wird ein kompetitiver Inhibitor hinzugefügt. Die folgende Messwerte werden mit Inhibitor erhalten:

• \([S] = 0.1 \text{ mM}\), \(v = 4 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.2 \text{ mM}\), \(v = 7 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.5 \text{ mM}\), \(v = 11 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 1.0 \text{ mM}\), \(v = 14 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 5.0 \text{ mM}\), \(v = 19 \text{ µmol/min}\)

Vergleiche die Lineweaver-Burk-Diagramme mit und ohne Inhibitor, und diskutiere die Effekte der kompetitiven Hemmung auf \(K_m\) und \(V_{max}\). Begründe deine Aussagen.

Lösung:

Lösung der Teilaufgabe:

Um die Effekte der kompetitiven Hemmung auf K_m und V_max zu analysieren, müssen wir die reziproken Werte der Substratkonzentration ([S]) und der Reaktionsgeschwindigkeit (v) sowohl für die ursprünglichen Daten als auch für die Daten mit Inhibitor berechnen und die Ergebnisse in einem Lineweaver-Burk-Diagramm darstellen.

Reziproke Berechnungen und Lineweaver-Burk-Diagramm:

Ohne Inhibitor:

• [S] = 0.1 mM, v = 5 µmol/min → 1/[S] = 10 mM^{-1}, 1/v = 0.2 min/µmol
• [S] = 0.2 mM, v = 9 µmol/min → 1/[S] = 5 mM^{-1}, 1/v = 0.111 min/µmol
• [S] = 0.5 mM, v = 15 µmol/min → 1/[S] = 2 mM^{-1}, 1/v = 0.067 min/µmol
• [S] = 1.0 mM, v = 18 µmol/min → 1/[S] = 1 mM^{-1}, 1/v = 0.056 min/µmol
• [S] = 5.0 mM, v = 20 µmol/min → 1/[S] = 0.2 mM^{-1}, 1/v = 0.050 min/µmol

Mit Inhibitor:

• [S] = 0.1 mM, v = 4 µmol/min → 1/[S] = 10 mM^{-1}, 1/v = 0.25 min/µmol
• [S] = 0.2 mM, v = 7 µmol/min → 1/[S] = 5 mM^{-1}, 1/v = 0.143 min/µmol
• [S] = 0.5 mM, v = 11 µmol/min → 1/[S] = 2 mM^{-1}, 1/v = 0.091 min/µmol
• [S] = 1.0 mM, v = 14 µmol/min → 1/[S] = 1 mM^{-1}, 1/v = 0.071 min/µmol
• [S] = 5.0 mM, v = 19 µmol/min → 1/[S] = 0.2 mM^{-1}, 1/v = 0.053 min/µmol

Vergleich der Lineweaver-Burk-Diagramme:

Zeichne die reziproken Werte von [S] und v in einem Lineweaver-Burk-Diagramm auf:

• Die x-Achse zeigt 1/[S].
• Die y-Achse zeigt 1/v.

Für die Daten ohne Inhibitor und die Daten mit Inhibitor erhält man jeweils eine Gerade. Nun vergleichen wir die beiden Kurven:

Analyse der Effekte der kompetitiven Hemmung:

Die Lineweaver-Burk-Gleichung lautet:

\(\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\)

Durch die kompetitive Hemmung bleibt die maximale Geschwindigkeit V_max unverändert, da bei hohen Substratkonzentrationen das Substrat den Inhibitor verdrängen kann. Die Michaelis-Menten-Konstante K_m wird jedoch erhöht, weil mehr Substrat benötigt wird, um die halbe maximale Geschwindigkeit zu erreichen.

• Die Steigung der Lineweaver-Burk-Geraden (\(\frac{K_m}{V_{max}}\)) ist proportional zu K_m. Wenn der Inhibitor hinzugefügt wird, erhöht sich K_m, was zu einer steileren Geraden führt.
• Der y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) bleibt gleich, da V_max unverändert ist.

In einem Lineweaver-Burk-Diagramm können folgende Beobachtungen gemacht werden:

• Die Linie mit Inhibitor hat eine steilere Steigung als die ohne Inhibitor, was auf eine Erhöhung von K_m hinweist.
• Die y-Achsenabschnitte der Linien mit und ohne Inhibitor sind identisch, was darauf hinweist, dass V_max unverändert bleibt.

Zusammenfassung:

• Kompetitive Hemmung führt zu einer Erhöhung des K_m, da mehr Substrat erforderlich ist, um den Inhibitor zu verdrängen.
• V_max bleibt unverändert, da bei ausreichender Substratkonzentration die Enzymaktivität nicht beeinträchtigt wird.

c)

Eine Mutante des Enzyms zeigt eine nicht-kompetitive Hemmung durch die Anwesenheit eines Metallions. Die Messwerte ohne Inhibitor (wie in der ersten Aufgabe) und mit Metallion sind wie folgt:

• \([S] = 0.1 \text{ mM}\), \(v = 3 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.2 \text{ mM}\), \(v = 6 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 0.5 \text{ mM}\), \(v = 10 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 1.0 \text{ mM}\), \(v = 12 \text{ µmol/min}\)
• \([S] = 5.0 \text{ mM}\), \(v = 13 \text{ µmol/min}\)

Benutze das Lineweaver-Burk-Diagramm, um die Effekte der nicht-kompetitiven Hemmung auf \(K_m\) und \(V_{max}\)zu analysieren. Vergleiche und diskutiere die Unterschiede zu der kompetitiven Hemmung aus der vorherigen Aufgabe.

Lösung:

Lösung der Teilaufgabe:

Um die Effekte der nicht-kompetitiven Hemmung auf K_m und V_max zu analysieren, nutzen wir das Lineweaver-Burk-Diagramm. Zuerst berechnen wir die reziproken Werte der Substratkonzentration ([S]) und der Reaktionsgeschwindigkeit (v) sowohl für die ursprünglichen Daten als auch für die Daten mit Metallion (Inhibitor).

Reziproke Berechnungen:

Ohne Inhibitor (ursprüngliche Werte):

• [S] = 0.1 mM, v = 5 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 10 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.2 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 0.2 mM, v = 9 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 5 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.111 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 0.5 mM, v = 15 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 2 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.067 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 1.0 mM, v = 18 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 1 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.056 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 5.0 mM, v = 20 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 0.2 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.050 \text{ min/µmol}\)

Mit Metallion (Inhibitor):

• [S] = 0.1 mM, v = 3 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 10 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.333 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 0.2 mM, v = 6 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 5 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.167 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 0.5 mM, v = 10 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 2 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.100 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 1.0 mM, v = 12 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 1 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.083 \text{ min/µmol}\)
• [S] = 5.0 mM, v = 13 µmol/min → \(\frac{1}{[S]} = 0.2 \text{ mM}^{-1}\), \(\frac{1}{v} = 0.077 \text{ min/µmol}\)

Lineweaver-Burk-Diagramm:

Trage die reziproken Werte der Substratkonzentration (1/[S]) und der Reaktionsgeschwindigkeit (1/v) in ein Lineweaver-Burk-Diagramm ein:

• Ohne Inhibitor:
  • x-Achse (1/[S] in mM^-1): {10, 5, 2, 1, 0.2}
  • y-Achse (1/v in min/µmol): {0.2, 0.111, 0.067, 0.056, 0.050}
• Mit Metallion (Inhibitor):
  • x-Achse (1/[S] in mM^-1): {10, 5, 2, 1, 0.2}
  • y-Achse (1/v in min/µmol): {0.333, 0.167, 0.100, 0.083, 0.077}

Analyse der Effekte der nicht-kompetitiven Hemmung:

Die Lineweaver-Burk-Gleichung lautet:

\(\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}} \times \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{max}}\)

• Nicht-kompetitive Hemmung:
  • Der y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) wird größer, was darauf hinweist, dass V_{max} verringert ist.
  • Die Steigung der Geraden (\(\frac{K_m}{V_{max}}\)) bleibt gleich, was darauf hinweist, dass K_m unverändert bleibt.

In einem Lineweaver-Burk-Diagramm können folgende Beobachtungen gemacht werden:

• Die Linie mit nicht-kompetitivem Inhibitor hat dieselbe Steigung wie die Linie ohne Inhibitor, was zeigt, dass K_m unverändert bleibt.
• Der y-Achsenabschnitt der Linie mit Inhibitor ist höher, was auf eine Verringerung von V_{max} hinweist.

Unterschiede zur kompetitiven Hemmung:

Im Fall der kompetitiven Hemmung:

• K_m wird erhöht, da mehr Substrat benötigt wird, um den Inhibitor zu verdrängen.
• Die Steigung der Lineweaver-Burk-Geraden (\(\frac{K_m}{V_{max}}\)) steigt, aber der y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) bleibt unverändert.

Während bei der nicht-kompetitiven Hemmung:

• K_m bleibt unverändert, da der Inhibitor unabhängig von der Substratkonzentration wirkt.
• Der y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) wird größer, was auf eine Verringerung von V_{max} hinweist, aber die Steigung bleibt gleich.

Zusammenfassung:

• Kompetitive Hemmung: Erhöhung von K_m, unverändertes V_{max}
• Nicht-kompetitive Hemmung: Unverändertes K_m, Verringerung von V_{max}

Aufgabe 3)

SDS-PAGE und Western Blot TechnikenDie SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) ist eine Methode zur Trennung von Proteinen nach ihrer Größe. Proteine werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese nach Größe getrennt. SDS bindet an Proteine und verleiht ihnen eine negative Ladung proportional zur Masse. Ein Western Blot ist eine Technik zum Nachweis spezifischer Proteine nach der Trennung durch SDS-PAGE. Dabei werden die Proteine vom Gel auf eine Membran (Nitrozellulose oder PVDF) übertragen. Der Nachweis erfolgt durch spezifische Antikörper und die Visualisierung erfolgt mit enzymatischen oder chemilumineszenten Methoden.

a)

Teilaufgabe A:

• Beschreibe den Ablauf der SDS-PAGE Methode und erkläre, warum die Proteine je nach Größe getrennt werden.
• Wie würdest Du überprüfen, ob die Proteine vollständig denaturiert und linearisiert sind?

Lösung:

Teilaufgabe A:

• Beschreibe den Ablauf der SDS-PAGE Methode und erkläre, warum die Proteine je nach Größe getrennt werden.Die SDS-PAGE Methode beinhaltet mehrere Schritte, die Folgendermaßen ablaufen:

1. Probenvorbereitung: Die Proteine werden zunächst in einer Probe mit einem Puffer vermischt, der SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) enthält. SDS ist ein starkes Detergens, das Proteine denaturiert und ihnen gleichzeitig eine negative Ladung proportional zu ihrer Masse verleiht. Dies stellt sicher, dass die Proteine ihre native Struktur verlieren und linearisiert werden.
2. Auftragen der Proben: Die vorbereiteten Proben werden in die Taschen (Wells) eines Polyacrylamidgels aufgetragen.
3. Elektrophorese: Ein elektrisches Feld wird an das Gel angelegt, wobei die negative Elektrode sich an der oberen Seite (Probenbeladungsseite) und die positive Elektrode an der unteren Seite des Gels befindet. Da die Proteine durch SDS negativ geladen sind, wandern sie durch das Gel in Richtung der positiven Elektrode. Das dichte Netzwerk des Polyacrylamidgels wirkt wie ein Sieb, wodurch kleinere Proteine schneller durch das Gel wandern als größere Proteine.
4. Fixierung und Färbung: Nach der Elektrophorese werden die Proteine im Gel fixiert und gefärbt, z.B. mit Coomassie Brilliant Blue, um die getrennten Proteinbänder sichtbar zu machen.

Die Trennung der Proteine nach Größe erfolgt, weil das SDS jedem Protein eine gleichmäßige negative Ladung proportional zu seiner Masse verleiht. Da alle Proteine eine ähnliche Ladung-Masse-Ratio haben, hängt ihre Wanderungsgeschwindigkeit im Gel nur von ihrer Größe ab. Kleinere Proteine können sich schneller durch die Poren des Gels bewegen als größere Proteine, wodurch die Trennung nach Größe erfolgt.

• Wie würdest Du überprüfen, ob die Proteine vollständig denaturiert und linearisiert sind?Um zu überprüfen, ob die Proteine vollständig denaturiert und linearisiert sind, können mehrere Methoden angewendet werden:

• Kontrolle des Probenpuffers: Sicherstellen, dass der Probenpuffer ausreichend SDS und einen Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) oder Mercaptoethanol enthält, die Disulfidbrücken in den Proteinen reduzieren und die Denaturierung fördern.
• Heat Treatment (Erhitzen): Die Proben werden normalerweise für einige Minuten bei 95°C erhitzt, um die Denaturierung und Linearisation der Proteine zu gewährleisten.
• Kontrolle der Gelbilder: Nach der Elektrophorese können die Gelbilder untersucht werden. Wenn die Proteine vollständig denaturiert und linearisiert sind, sollten sie als scharfe, einzelne Banden im Gel erscheinen. Verschwommene oder doppelte Banden können auf unvollständige Denaturierung hinweisen.
• Western Blot Analyse: Nach der Übertragung der Proteine auf eine Membran und dem Nachweis mittels spezifischer Antikörper könnten keine oder nur unspezifische Signale detektiert werden, wenn die Proteine nicht vollständig denaturiert sind.

b)

Teilaufgabe B:

• Der Western Blot ist eine Methode, die den Nachweis spezifischer Proteine aus einer Probe zulässt. Erkläre den gesamten Prozess des Western Blots, angefangen von der Übertragung der Proteine bis zur Visualisierung. Gehe insbesondere auf die Rolle der spezifischen Antikörper und der Visualisierungsmethoden ein.
• Stelle Dir vor, Du hast eine Mischung aus Proteinen mit den Molekülmassen von 30 kDa, 45 kDa und 60 kDa. Nachdem Du SDS-PAGE und Western Blot durchgeführt hast, erwartest Du Banden bei welchen Positionen der Membran, wenn die Visualisierung erfolgreich war?

Lösung:

Teilaufgabe B:

• Der Western Blot ist eine Methode, die den Nachweis spezifischer Proteine aus einer Probe zulässt. Erkläre den gesamten Prozess des Western Blots, angefangen von der Übertragung der Proteine bis zur Visualisierung. Gehe insbesondere auf die Rolle der spezifischen Antikörper und der Visualisierungsmethoden ein.

Der Western Blot Prozess besteht aus mehreren Schritten:

1. Übertragung der Proteine: Nach der Trennung der Proteine durch SDS-PAGE werden die Proteine aus dem Polyacrylamidgel auf eine Membran, typischerweise aus Nitrozellulose oder PVDF (Polyvinylidenfluorid), übertragen. Dies geschieht durch Elektrophorese, bei der ein elektrisches Feld angelegt wird, welches die Proteine aus dem Gel auf die Membran zieht.
2. Blockierung: Die Membran wird in einer Blockierungslösung (z.B. 5% Milchpulver in PBS oder TBS) inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Dies verhindert, dass die Antikörper später unspezifisch an die Membran binden.
3. Primärantikörper Inkubation: Die Membran wird mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch gegen das zu detektierende Protein ist. Dieser Antikörper bindet spezifisch an das Zielprotein.
4. Waschen: Die Membran wird gewaschen, um überschüssige und unspezifisch gebundene primäre Antikörper zu entfernen.
5. Sekundärantikörper Inkubation: Ein sekundärer Antikörper, der spezifisch gegen den Fc-Teil des primären Antikörpers gerichtet ist und mit einem Enzym (z.B. Horseradish Peroxidase, HRP) konjugiert ist, wird hinzugefügt. Dieser Antikörper bindet an den primären Antikörper.
6. Waschen: Die Membran wird erneut gewaschen, um überschüssige und unspezifisch gebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
7. Visualisierung: Das Enzym an den sekundären Antikörpern katalysiert eine chemische Reaktion, die ein nachweisbares Signal erzeugt. Dieses Signal kann auf verschiedene Weise visualisiert werden:

• Enzymatische Methoden: Bei der chemilumineszenten Detektion mit HRP wird ein Substrat wie ECL (Enhanced Chemiluminescence) hinzugefügt, das Licht emittiert, welches auf einem Autoradiographie-Film oder einem CCD-Kamerasystem detektiert wird.
• Fluoreszierende Methoden: Sekundärantikörper sind mit Fluorophoren konjugiert, die unter UV-Licht oder spezifischer Wellenlänge fluoreszieren.
• Farbentwicklungs-Methoden: Phosphatase-conjugierte Sekundärantikörper erzeugen einen Farbstoff durch eine enzymatische Reaktion, der sichtbar ist.

• Stelle Dir vor, Du hast eine Mischung aus Proteinen mit den Molekülmassen von 30 kDa, 45 kDa und 60 kDa. Nachdem Du SDS-PAGE und Western Blot durchgeführt hast, erwartest Du Banden bei welchen Positionen der Membran, wenn die Visualisierung erfolgreich war?

Wenn der Western Blot erfolgreich war und die Proteine vollständig übertragen und mittels spezifischer Antikörper detektiert wurden, sollten auf der Membran Banden an den folgenden Positionen erscheinen:

• Eine Bande bei 30 kDa, die das Protein mit der Masse von 30 kDa repräsentiert.
• Eine Bande bei 45 kDa, die das Protein mit der Masse von 45 kDa repräsentiert.
• Eine Bande bei 60 kDa, die das Protein mit der Masse von 60 kDa repräsentiert.

Diese Positionen entsprechen der relativen Mobilität der Proteine im SDS-PAGE Gel, die durch ihre Größe bestimmt wird. Kleinere Proteine wandern weiter durch das Gel und erscheinen daher am unteren Ende der Membran, während größere Proteine weiter oben erscheinen.

Aufgabe 4)

Massenspektrometrie zur Proteinanalyse:Methode zur Untersuchung von Proteinen mittels Ionisierung und Massen-zu-Ladungs-Verhältnis-Analyse.

• Probenvorbereitung: Proteine extrahieren und möglicherweise enzymatisch verdauen.
• Ionisierungstechniken: ESI (Electrospray Ionization) oder MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization).
• Massenspektrometer: TOF (Time of Flight), Quadrupol, Orbitrap oder FT-ICR.
• Analyse: Interpretation von Massenspektren zur Identifikation und Quantifizierung von Proteinen.
• Anwendungsbereiche: Proteomik, Identifizierung von PTMs (Post-translational modifications), Protein-Protein-Interaktionen.
• Formel: \( m/z = \frac{m}{z} \)

a)

Beschreibe die Unterschiede zwischen den Ionisierungstechniken ESI und MALDI. Welche Vor- und Nachteile haben diese Methoden in Bezug auf die Probenpräparation und Analyse von Proteinen?

Lösung:

• ESI (Electrospray Ionization):
• Die Proben werden in eine Lösung gelöst und durch eine feine Kapillare gesprüht, die unter hoher Spannung steht.
• Die Tropfen verdunsten, wodurch geladene Ionen in die Gasphase übergehen.
• Vorteile:
  • Weiche Ionisierungsmethode, die dazu beiträgt, dass die Proteinstruktur intakt bleibt.
  • Geeignet für die Analyse von großen Biomolekülen und komplexen Gemischen.
  • Mehrfache Ladungszustände, was die Messung von großen Molekülen mit geringem m/z-Wert ermöglicht.
• Nachteile:
  • Probenvorbereitung kann komplexer sein, insbesondere für unpolare Proteine.
  • Nicht immer für hochmolekulare Proteine geeignet, da die Ladungsverteilung asymmetrisch sein kann.
• MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization):
• Die Proteine werden in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet und auf eine Platte aufgebracht.
• Ein Laserimpuls trifft auf die Matrix, wodurch die Proteine ionisiert und in die Gasphase überführt werden.
• Vorteile:
  • Sehr schnelle und einfache Probenvorbereitung.
  • Geeignet für die Analyse großer Moleküle und intakter Proteine.
  • Hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit bei der Massenbestimmung.
• Nachteile:
  • Ionisierung ist oft unvollständig oder ungleichmäßig, was die Analyse erschweren kann.
  • Weniger geeignet für die Quantifizierung, da die Signalintensität nicht direkt proportional zur Konzentration ist.

b)

Ein Proteomforscher verwendet ein TOF-Massenspektrometer, um ein Protein nach enzymatischem Verdau zu analysieren. Erkläre das Funktionsprinzip des TOF-Massenspektrometers und beschreibe, wie die Daten zur Identifikation des Proteins genutzt werden können.

Lösung:

• Funktionsprinzip des TOF (Time of Flight) Massenspektrometers:
• Das TOF-Massenspektrometer misst die Zeit, die ein Ion benötigt, um eine festgelegte Distanz in einem Vakuum zurückzulegen.
• Nach der Ionisierung (z.B. durch ESI oder MALDI) werden die Ionen mit einem elektrischen Feld beschleunigt und in eine Flugröhre entlassen.
• Alle Ionen haben durch die Beschleunigung die gleiche kinetische Energie, aber deren Geschwindigkeit hängt von ihrer Masse und Ladung ab.
• Kleinere und höher geladene Ionen bewegen sich schneller durch die Flugröhre, während größere oder weniger geladene Ionen langsamer sind.
• Am Ende der Flugröhre werden die Ionen von einem Detektor erfasst, der die Flugzeit aufzeichnet. Aus der Flugzeit kann das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (\textit{m/z}) berechnet werden.
• Datenanalyse zur Identifikation des Proteins:
• Nach der Messung werden die Flugzeiten der Ionen in \textit{m/z} Werte umgewandelt.
• Diese \textit{m/z} Werte ergeben ein Massenspektrum, das die Verteilung der verschiedenen Ionen nach Masse und Ladung darstellt.
• Für die Proteinidentifikation werden die erhaltenen \textit{m/z} Werte mit einer Datenbank bekannter Proteine und ihrer verdauten Peptidfragmente abgeglichen.
• Die Enzymverdauung erzeugt spezifische Peptidfragmente, deren Massen und HPLC-Retentionszeiten charakteristisch für das Protein sind.
• Durch den Vergleich der gemessenen Peptidmassen mit einer Datenbank können die Peptide und somit das originale Protein identifiziert werden.
• Bei ausreichender Übereinstimmung der gemessenen Daten mit den Datenbankeinträgen kann das Protein eindeutig identifiziert werden.
• Die Analysesoftware kann zudem weitere Informationen wie Modifikationen und Sequenzinformationen liefern.

c)

Ein Proteinfragment hat eine gemessene Masse von 1500 Da und trägt im Massenspektrum eine Ladung von +3. Berechne das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) und erläutere den Informationswert dieser Kenngröße bei der Analyse von Proteinen.

Lösung:

• Berechnung des Massen-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z):
• Gegebene Werte:
  • Masse des Proteinfragments (m): 1500 Da (Dalton)
  • Ladung (z): +3
• Anwendung der Formel für das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis:
• \[m/z = \frac{m}{z}\]
• Einsetzen der gegebenen Werte:\[m/z = \frac{1500 Da}{3} = 500 \]
• Das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) beträgt 500.
• Informationswert des Massen-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z) bei der Analyse von Proteinen:
• Das Massen-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) ist eine zentrale Kenngröße in der Massenspektrometrie, da es die Basis für die Analyse und Identifikation von Molekülen bildet.
• Mit dem m/z-Wert kann das Massenspektrometer die Ionen im Massenspektrum differenzieren und detektieren.
• Durch den Vergleich der gemessenen m/z-Werte mit Datenbanken bekannter Proteine und Peptide können spezifische Fragmente und deren Ursprung identifiziert werden.
• In Kombination mit anderen Informationen wie der Fragmentionsmuster und Retentionszeiten können Rückschlüsse auf die Primärstruktur des Proteins und eventuelle Modifikationen gezogen werden.
• Der verlässliche Nachweis spezifischer m/z-Werte unterstützt die Quantifizierung und Charakterisierung der Bestandteile eines Proteingemisches.
• Somit ermöglicht das m/z-Verhältnis die Identifizierung, Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinen und deren Modifikationen in verschiedenen biologischen Proben.