Aufgabe 1)

Angenommen, es liegt ein E. coli-Bakterium vor, bei dem eine Mutation im Gen für die DNA-Polymerase III vorliegt. Dieses Enzym spielt eine kritische Rolle bei der DNA-Replikation. Aufgrund dieser Mutation ist die Fehlpaarungskorrekturfunktion (Proofreading) der DNA-Polymerase III vollständig inaktiv.

a)

a) Erläutere, wie sich die Fehlpaarungskorrekturfunktion der DNA-Polymerase III auf die Gesamtfehlerrate der DNA-Replikation in E. coli auswirkt. Gehe dabei auf den Unterschied zwischen der DNA-Synthese mit und ohne diese Korrekturfunktion ein und gib die genauen Mechanismen an.

Lösung:

a) Die Fehlpaarungskorrekturfunktion der DNA-Polymerase III ist von entscheidender Bedeutung für die Genauigkeit der DNA-Replikation bei E. coli. Dieses Proofreading erfolgt durch die 3'→5' Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase III, die es dem Enzym ermöglicht, falsch eingebaute Nukleotide sofort zu erkennen und zu entfernen.

• DNA-Synthese ohne Proofreading: Ohne die Fehlpaarungskorrekturfunktion erhöht sich die Fehlerrate erheblich. Normalerweise liegt die Fehlerrate der DNA-Replikation aufgrund der exakten Basenpaarung und der enzymatischen Aktivität der DNA-Polymerase III bei etwa 1 Fehler pro 100.000 eingebaute Nukleotide (⁻5).
• DNA-Synthese mit Proofreading: Mit der zusätzlichen Proofreading-Funktion, die falsche Nukleotide entfernt und korrekt ersetzt, reduziert sich die Fehlerrate um das Replikations-Material zu erhalten auf etwa 1 Fehler pro 10⁷ bis 10⁸ Nukleotide.
• Genauer Mechanismus: Während der DNA-Synthese fügt die DNA-Polymerase III Nukleotide gemäß der Vorlage hinzu. Wenn ein falsches Nukleotid eingemischt wird, wird die Synthese unterbrochen, die 3'→5' Exonuklease-Aktivität entfernt das falsche Nukleotid und die Synthese wird fortgesetzt.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Fehlpaarungskorrekturfunktion der DNA-Polymerase III eine entscheidende Rolle dabei spielt, die Genom-Integrität zu gewährleisten und die Mutationsrate auf einem sehr niedrigen Niveau zu halten.

b)

b) Berechne die zu erwartende Anzahl an Punktmutationen pro Replikationszyklus, wenn angenommen wird, dass die Fehlerquote der DNA-Polymerase III ohne Proofreading bei normalen Bedingungen bei 1 Fehler pro 10,000 eingebauten Nukleotiden liegt. Die E. coli DNA hat eine Länge von 4,6 Millionen Basenpaaren.

• Angenommen, E. coli repliziert seine DNA in einer Rate von 1000 Nukleotiden pro Sekunde und der gesamte Replikationsprozess dauert etwa 40 Minuten. Berechne außerdem die Häufigkeit, mit der sich dieser Organismus unter diesen Bedingungen mutiert.

Lösung:

b) Um die zu erwartende Anzahl an Punktmutationen pro Replikationszyklus zu berechnen, benötigen wir folgende Informationen:

• Die Länge der E. coli DNA beträgt 4,6 Millionen Basenpaare (oder 4,6 × 10⁶ Basenpaare).
• Die Fehlerquote der DNA-Polymerase III ohne Proofreading beträgt 1 Fehler pro 10.000 eingebauten Nukleotiden.

Die Berechnung erfolgt in zwei Schritten:

1. Berechnung der Anzahl der einzubauenden Nukleotide: Da ein Basenpaar aus zwei Nukleotiden besteht, benötigen wir insgesamt 4,6 × 10⁶ Basenpaare × 2 Nukleotide/Basenpaar = 9,2 × 10⁶ Nukleotide.
2. Berechnung der erwarteten Anzahl an Punktmutationen: Ein Fehler pro 10.000 Nukleotide bedeutet, dass die Fehlerrate 1/10.000 oder 10^-4 beträgt. Daher erwarten wir:

Erwartete Punktmutationen = 9,2 × 10⁶ Nukleotide × (1 Fehler/10⁴ Nukleotide) = 9,2 × 10² Fehler oder 920 Fehler pro Replikationszyklus.

Zusätzlich sollen wir die Mutationshäufigkeit berechnen, wenn E. coli seine DNA mit einer Rate von 1000 Nukleotiden pro Sekunde repliziert und der gesamte Replikationsprozess 40 Minuten dauert:

• Ein Replikationszyklus dauert 40 Minuten oder 2400 Sekunden.
• Die Replikationsrate beträgt 1000 Nukleotide pro Sekunde.
• Summe der Nukleotide, die in 40 Minuten eingebaut werden = 1000 Nukleotide/Sekunde × 2400 Sekunden = 2,4 × 10⁶ Nukleotide.

Nun, unter Berücksichtigung der Fehlerquote:

Erwartete Punktmutationen bei diesen Bedingungen = 2,4 × 10⁶ Nukleotide × (1 Fehler/10⁴ Nukleotide) = 2,4 × 10² Fehler oder 240 Fehler pro Replikationszyklus.

Daher wird erwartet, dass der E. coli Organismus unter normalen Bedingungen etwa 920 Punktmutationen pro Replikationszyklus und unter den gegebenen Replikationsraten etwa 240 Punktmutationen pro Replikationszyklus aufweist.

Aufgabe 2)

Stelle Dir vor, Du arbeitest in einem modernen Genomik-Labor und hast Zugang zu allen verfügbaren Next-Generation Sequencing (NGS) Technologien, darunter Illumina, Oxford Nanopore und PacBio. Euer Labor hat den Auftrag erhalten, das vollständige Genom einer neuen Bakterienart zu sequenzieren und anschließend eine umfassende Transkriptom-Analyse durchzuführen, um die Genexpression unter verschiedenen Umweltbedingungen zu untersuchen.

• Schneller als die traditionelle Sanger-Sequenzierung
• Ermöglicht paralleles Sequenzieren von Millionen von Fragmenten
• Anwendungen: Genomsequenzierung, Transkriptom-Analyse, Metagenomik
• Datenverarbeitung: Erfordert spezialisierte bioinformatische Tools
• Beispiele: Illumina, Oxford Nanopore, PacBio

a)

a) NGS Technologie Auswahl und Begründung:

Wähle eine der genannten NGS-Technologien (Illumina, Oxford Nanopore, PacBio) für die Genomsequenzierung der neuen Bakterienart aus. Begründe Deine Wahl anhand von mindestens drei spezifischen technologischen Merkmalen dieser Methode, die sie im Vergleich zu den anderen Technologien besonders geeignet machen.

Lösung:

NGS Technologie Auswahl und Begründung:

Für die Sequenzierung des Genoms der neuen Bakterienart würde ich die Illumina-Technologie auswählen. Diese Wahl basiert auf den folgenden drei spezifischen technologischen Merkmalen:

• Hohe Genauigkeit: Illumina-Sequenzierer sind bekannt für ihre extrem niedrige Fehlerrate, was besonders wichtig bei der Sequenzierung neuer Organismen ist, um genaue und verlässliche Daten zu erhalten. Dies minimiert die Notwendigkeit von Nachbesserungen und Validierungen.
• Hoher Durchsatz: Illumina-Plattformen können im Laufe eines einzigen Laufs Milliarden von Basenpaaren sequenzieren, was bedeutet, dass ganze Genome schnell und effizient sequenziert werden können. Dies ist ideal für die umfassende Genomsequenzierung von Bakterien.
• Kosten-Effizienz: Im Vergleich zu anderen Technologien wie PacBio oder Oxford Nanopore, die ebenfalls hohe Genauigkeiten liefern, sind die Sequenzierkosten bei Illumina in der Regel niedriger. Dies macht die Technologie besonders attraktiv für Projekte mit begrenztem Budget oder für umfangreiche Sequenzierprojekte.

b)

b) Datenverarbeitung und Analyse:

Beschreibe den bioinformatischen Workflow zur Analyse der Sequenzdaten von der Rohdatengenerierung bis zur Annotation des Bakteriengenoms. Gehe dabei auf folgende Punkte ein:

• Qualitätskontrolle und Filterung der Rohdaten
• Assembly der Sequenzen zu einem vollständigen Genom
• Annotierung der Genomsequenzen und Identifizierung von Genen

Erkläre die Verwendung von mindestens zwei speziellen bioinformatischen Tools, die typischerweise in diesem Workflow verwendet werden.

Lösung:

Datenverarbeitung und Analyse:

Der bioinformatische Workflow zur Analyse der Sequenzdaten von der Rohdatengenerierung bis zur Annotation des Bakteriengenoms umfasst mehrere wichtige Schritte. Hier sind die wesentlichen Punkte detailliert beschrieben:

• Qualitätskontrolle und Filterung der Rohdaten: Die Rohsequenzdaten müssen zuerst auf Qualität überprüft und gefiltert werden, um fehlerhafte oder minderwertige Daten zu entfernen. Hierbei wird oft das Tool FastQC verwendet, um qualitative Metriken der Sequenzdaten zu bewerten. Anschließend kann ein Tool wie Trimmomatic zum Einsatz kommen, um niedrigqualitative Basen und Adaptersequenzen zu entfernen.
• Assembly der Sequenzen zu einem vollständigen Genom: Nach der Filterung müssen die Sequenzreads zu einem vollständigen Genom zusammengefügt werden. Dies erfolgt mittels eines Assemblers wie SPAdes oder Velvet, die darauf ausgelegt sind, kontiguale Sequenzen aus kurzen Reads zu rekonstruieren. Dies führt zur Bildung von Contigs, die dann weiter verknüpft werden können, um das gesamte Genom zu rekonstruieren.
• Annotierung der Genomsequenzen und Identifizierung von Genen: Der nächste Schritt besteht darin, die Genomsequenzen zu annotieren und Gene zu identifizieren. Dies wird oft durch Tools wie Prokka erreicht, das automatisiert Gene, rRNA, tRNA sowie andere funktionale Elemente im Genom identifizieren und annotieren kann. Ein weiteres nützliches Tool ist BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), das verwendet wird, um homologe Sequenzen in Datenbanken zu finden und zu vergleichen, um die Funktion der identifizierten Gene vorherzusagen.

Verwendung spezieller bioinformatischer Tools:

• FastQC: Dieses Tool analysiert die Qualität der Rohsequenzdaten und erstellt Berichte über Metriken wie Basenqualitätswerte, Sequenzlängenverteilung und GC-Gehalt. FastQC hilft dabei, potenzielle Probleme in den Rohdaten frühzeitig zu identifizieren und zu adressieren.
• Prokka: Prokka ist ein umfassendes Tool zur Genomannotation, das verschiedene Vektoren implementiert, um Gene, rRNA, tRNA und andere funktionale Elemente zu identifizieren. Es integriert verschiedene Datenbanken und Algorithmen, um eine detaillierte Annotation des Genoms zu liefern.

Aufgabe 3)

Die CRISPR/Cas9-Technologie hat sich als eines der effizientesten Werkzeuge zur Genomeditierung etabliert. Sie verwendet eine RNA, die eine spezifische DNA-Sequenz innerhalb des Genoms erkennt, während das Cas9-Protein die Ziel-DNA schneidet. Zwei Hauptreparaturmechanismen, die nicht-homologe End-zu-End-Verbindung (NHEJ) und die homologiegeleitete Reparatur (HDR), reparieren die Schnittstellen. TALENs und Zinkfinger-Nukleasen bieten ebenfalls spezifische DNA-Schneidemethoden durch die Verwendung von DNA-Bindedomänen und nukleolytischen Domänen. Meganukleasen und Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese gehören zu den älteren Methoden der Genomeditierung. Diese Technologien finden Anwendung in der Genforschung, bei gentherapeutischen Ansätzen, in der Landwirtschaft sowie zur Erschaffung von Modellorganismen.

a)

Erkläre detailiert den Unterschied zwischen NHEJ und HDR im Kontext der CRISPR/Cas9 genomeditierung. Welche Vor- und Nachteile haben die jeweiligen Reparaturmechanismen?

Lösung:

• Nicht-homologe End-zu-End-Verbindung (NHEJ)

Die nicht-homologe End-zu-End-Verbindung (NHEJ) ist einer der primären Reparaturmechanismen, die nach einem DNA-Doppelstrangbruch auftreten. NHEJ ist schneller als die homologiegeleitete Reparatur (HDR) und benötigt keine homologe Sequenz, um die Reparatur durchzuführen. Dieser Mechanismus verbindet die beiden Enden des DNA-Bruchs direkt wieder.

Vorteile von NHEJ:

• Schnelligkeit: NHEJ kann die Brüche schnell reparieren, was für Zellen unter Stressbedingungen entscheidend sein kann.
• Universelle Anwendung: Da keine homologe Vorlage notwendig ist, kann NHEJ in einer Vielzahl von Zelltypen eingebaut werden.

Nachteile von NHEJ:

• Unpräzision: Da keine homologe Sequenz verwendet wird, können während der Reparatur Fehler wie Insertionen, Deletionen oder Mutationseinführungen auftreten.
• Eingeschränkte Kontrolle: Für gezielte Genomeditierungen ist NHEJ weniger geeignet, weil es keine präzise Integration oder Korrektur von Sequenzen erlaubt.

• Homologiegeleitete Reparatur (HDR)

Die homologiegeleitete Reparatur (HDR) ist ein präziserer Mechanismus, der eine homologe DNA-Sequenz als Vorlage verwendet, um den DNA-Doppelstrangbruch zu reparieren. HDR wird meistens während der späten S- und G2-Phasen des Zellzyklus aktiviert, wenn eine Schwesterchromatide als Vorlage zur Verfügung steht.

Vorteile von HDR:

• Präzision: Da eine homologe Sequenz zur Reparatur genutzt wird, kann HDR eine genaue Wiederherstellung oder gezielte Modifikation der DNA ermöglichen.
• Kontrollierte Integration: Durch das Einführen einer spezifischen DNA-Vorlage kann HDR gezielte Mutationen oder Korrekturen vornehmen.

Nachteile von HDR:

• Langsamkeit: Im Vergleich zu NHEJ ist HDR ein langsamerer Prozess, da er die Erkennung passender homologer Sequenzen erfordert.
• Begrenzte Phasen des Zellzyklus: HDR ist auf bestimmte Phasen des Zellzyklus beschränkt, was die Anwendungsmöglichkeiten einschränkt.
• Technische Komplexität: Die Durchführung von HDR erfordert oft zusätzliche technische Schritte, wie die Bereitstellung einer passenden DNA-Vorlage.

Zusammenfassung:

NHEJ ist schnell, einfach und universell, aber weniger präzise. HDR ist hingegen langsamer und komplexer, bietet aber die Möglichkeit einer sehr genauen Genomeditierung. Die Wahl des Reparaturmechanismus hängt also stark von den spezifischen Anforderungen des Projekts ab, beispielsweise ob Schnelligkeit oder Präzision wichtiger ist.

b)

Angenommen, Du möchtest mit der CRISPR/Cas9-Technologie ein defektes Gen in einem Modelorganismus reparieren. Beschreibe den gesamten Prozess von der Planung bis zur Durchführung und nenne die dabei auftretenden möglichen Herausforderungen. Gehe insbesondere auf die Wahl der RNA-Seqzenzen sowie auf die Wahl des geeigneten Reparaturmechanismus ein. Berechne die Effizienz der Genomeditierung bei einer Annahme, dass 30% der Zellen die Ziel-DNA erfolgreich geschnitten haben und von diesen 50% durch NHEJ und 20% durch HDR repariert wurden.

Lösung:

• Planung des CRISPR/Cas9-Experiments

1. Identifikation des zu reparierenden Gens: Zunächst identifizierst Du das spezifische Gen, das die Mutation oder den Defekt trägt. Dies erfordert eine gründliche Literaturrecherche und Nutzung von Datenbanken, um die genaue Sequenz und Position des Gens zu verstehen.

2. Entwicklung der gRNA-Sequenzen: Die Entwicklung der guide RNA (gRNA) erfolgt durch bioinformatische Werkzeuge, die spezifische Sequenzen vorschlagen. Das Ziel ist es, eine gRNA zu finden, die sehr spezifisch für die Zielsequenz ist und minimale Off-Target-Effekte hat. Programme wie CRISPR Design Tool helfen, die bestmögliche gRNA zu entwerfen.

3. Wahl des Reparaturmechanismus: Die Wahl zwischen NHEJ und HDR hängt von der Art der Reparatur ab, die Du anstrebst. Für präzise Korrekturen (wie Punktmutationen) ziehst Du HDR vor, während für einfache Knockouts NHEJ ausreicht. Zu beachten ist, dass HDR eine homologe DNA-Vorlage benötigt und meist effizienter in der S- und G2-Phase des Zellzyklus abläuft.

• Durchführung des Experiments

1. Synthetisierung und Lieferung der gRNA und Cas9-Komponente: Nachdem die gRNA-Sequenz entworfen wurde, synthetisierst Du die gRNA und Cas9-Komponenten. Diese werden dann in die Zielzellen des Modelorganismus über verschiedene Methoden wie Elektroporation, Lipofektion oder Mikroinjektion eingeführt.

2. Bereitstellung der Reparaturtemplate (nur für HDR): Wenn Du HDR anwendest, benötigst Du zusätzlich eine homologe DNA-Vorlage, die die gewünschte Sequenzänderung trägt. Diese homologe Sequenz wird ebenfalls in die Zelle eingeführt.

3. Verfolgung und Analyse der Genomeditierung: Nach der Einführung der gRNA und Cas9-Komponenten verfolgst und analysierst Du die Reparatur durch Techniken wie PCR, DNA-Sequenzierung oder spezifische Reporter-Assays, um den Erfolg zu überprüfen.

• Mögliche Herausforderungen

1. Off-Target-Effekte: Trotz sorgfältiger Planung können Off-Target-Schnitte auftreten, die zu unerwünschten Mutationen führen. Hierbei helfen hochspezifische gRNAs und optimierte Cas9-Varianten, das Risiko zu minimieren.

2. Effizienz der Transfektion: Nicht alle Zellen nehmen die gRNA und Cas9-Komponenten gleich effizient auf, was die Gesamteffizienz des Experiments beeinflusst.

3. Auswahl des Reparaturmechanismus: Je nach Zelltyp und Phase des Zellzyklus kann die Effizienz von NHEJ oder HDR variieren. Manche Zellen bevorzugen einen Mechanismus gegenüber dem anderen.

• Berechnung der Effizienz der Genomeditierung

Angenommen, 30% der Zellen haben die Ziel-DNA erfolgreich geschnitten. Von diesen Zellen werden:

• 50% durch NHEJ repariert:

0.30 (30% der Zellen) * 0.50 (50% durch NHEJ) = 0.15 oder 15% der ursprünglichen Zellen.

• 20% durch HDR repariert:

0.30 (30% der Zellen) * 0.20 (20% durch HDR) = 0.06 oder 6% der ursprünglichen Zellen.

Damit ergibt sich die Gesamteffizienz der Genomeditierung:

• Effizienz durch NHEJ: 15%
• Effizienz durch HDR: 6%

Gesamteffizienz: 15% + 6% = 21% der ursprünglichen Zellen.

Diese Berechnungen zeigen, dass 21% der ursprünglichen Zellen erfolgreich genomifiziert werden, unterteilt in 15% durch NHEJ und 6% durch HDR.

Aufgabe 4)

Betrachte den Prozess der Genexpression, der sowohl die Transkription als auch die Translation umfasst. In der Transkription wird DNA in mRNA umgeschrieben. Während der Translation wird diese mRNA in ein Protein übersetzt. RNA-Polymerase bindet an die Promotorregion der DNA und synthetisiert den mRNA-Strang in 5'-nach-3'-Richtung. Die mRNA durchläuft anschließend Prozesse wie Capping, Polyadenylierung und Splicing. Schließlich lesen Ribosomen die mRNA, mit Hilfreichen von tRNA, und synthetisieren ein entsprechendes Protein. Beachte die Bedeutung des Startcodons AUG und der Stopcodons UAA, UAG und UGA.

a)

Beschreibe detailliert die einzelnen Schritte, die die RNA-Polymerase von der Bindung an die Promotorregion bis zur Freisetzung der mRNA durchläuft. Gehe dabei auf die verschiedenen Enzymaktivitäten und die regulatorischen Mechanismen ein, die diesen Prozess beeinflussen können. Verschiedene Substanzen oder Mutationen können den Prozess der Transkription beeinflussen. Nenne drei solcher Beispiele und erläutere ihre Wirkung.

Lösung:

Der Prozess der Transkription und seine detaillierten Schritte

Die Transkription ist ein wesentlicher Schritt der Genexpression, bei dem die genetische Information von der DNA auf die mRNA übertragen wird. Hier sind die detaillierten Schritte, die die RNA-Polymerase durchläuft:

• Bindung an die Promotorregion: Die RNA-Polymerase erkennt und bindet an spezifische DNA-Sequenzen, die als Promotorregionen bezeichnet werden. Diese Regionen befinden sich upstream (stromaufwärts) des zu transkribierenden Gens und enthalten spezifische Nukleotidsequenzen, die die Bindung der RNA-Polymerase erleichtern. Regulatorische Proteine, wie Transkriptionsfaktoren, helfen dabei, die RNA-Polymerase zu rekrutieren und binden oft ebenfalls an die Promotorregion.
• Initiation: Nach der Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor beginnt die Entwindung der DNA-Doppelhelix. Dies erzeugt eine Transkriptionsblase, in der die DNA-Stränge getrennt werden und ein einzelsträngiger DNA-Abschnitt (Vorlage oder Matrizenstrang) für die Synthese der mRNA zugänglich ist. Die RNA-Polymerase beginnt das RNA-Molekül durch Anlagerung der ersten RNA-Nukleotide zu synthetisieren.
• Elongation: Während der Elongationsphase bewegt sich die RNA-Polymerase entlang der Vorlage-DNA in 3'-nach-5'-Richtung. Gleichzeitig synthetisiert sie den mRNA-Strang in 5'-nach-3'-Richtung, indem sie komplementäre RNA-Nukleotide an die Matrize anfügt. Die DNA-Doppelhelix schließt sich unmittelbar hinter der RNA-Polymerase wieder.
• Termination: Die Transkription endet, wenn die RNA-Polymerase auf eine Terminatorsequenz in der DNA trifft. Diese Sequenz signalisiert das Ende des zu transkribierenden Gens. Die RNA-Polymerase löst sich von der DNA, und die neu synthetisierte mRNA wird freigesetzt.

Enzymatische und regulatorische Mechanismen

Mehrere Enzymaktivitäten und regulatorische Mechanismen beeinflussen die Transkription:

• Transkriptionsfaktoren: Diese Proteine helfen, die RNA-Polymerase zu rekrutieren und die Transkription zu initiieren.
• Enhancer und Silencer: DNA-Elemente, die die Transkriptionsaktivität positiv (Enhancer) oder negativ (Silencer) beeinflussen können, indem sie an regulatorische Proteine binden.
• Epigenetische Modifikationen: Chemische Modifikationen der DNA oder der Histonproteine (z.B. Methylierung, Acetylierung) können den Zugang der RNA-Polymerase zur DNA regulieren.

Einflüsse auf die Transkription

Verschiedene Substanzen oder Mutationen können den Prozess der Transkription beeinflussen:

• Actinomycin D: Dieses Chemotherapeutikum interkaliert in die DNA-Doppelhelix und verhindert so die Bindung der RNA-Polymerase, was die Transkription stoppt.
• Mutationen in der Promotorregion: Punktmutationen oder Deletionen in Promotorregionen können die Bindungsfähigkeit der RNA-Polymerase oder von Transkriptionsfaktoren beeinträchtigen, was die Genexpression herunterregulieren kann.
• Alpha-Amanitin: Ein Toxin aus dem Knollenblätterpilz, das spezifisch die RNA-Polymerase II hemmt, welche für die Synthese von mRNA verantwortlich ist. Dies führt zu einem Stoppen der Transkription und letztlich zum Zellsterben.

b)

Angenommen, ein spezifischer Abschnitt der DNA hat die Sequenz: 5'-ATGCCGTAGCTA-3'. Gib die dazugehörige mRNA-Sequenz an und übersetze diese in die entsprechende Aminosäuresequenz. Berücksichtige dabei die Regeln des genetischen Codes. Beachte die Richtung der Synthese und die Konvention der Sequenzdarstellung.

Lösung:

Translation einer spezifischen DNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenz

Schritt 1: Transkription der DNA in mRNA

Der gegebene DNA-Abschnitt hat die Sequenz:

5'-ATGCCGTAGCTA-3'

Die RNA-Polymerase synthetisiert den mRNA-Strang in 5'-nach-3'-Richtung unter Verwendung des komplementären DNA-Strangs. Der komplementäre DNA-Strang lautet:

3'-TACGGCATCGAT-5'

Die resultierende mRNA-Sequenz, die komplementär zum komplementären DNA-Strang ist, lautet:

5'-AUGCCGUAGCUA-3'

Schritt 2: Translation der mRNA in eine Aminosäuresequenz

Die mRNA wird nun in 3-Basen-Codons aufgeteilt, die jeweils eine Aminosäure kodieren. Wir beginnen mit dem Startcodon AUG:

• AUG - Startcodon, kodiert für Methionin (Met)
• CCG - kodiert für Prolin (Pro)
• UAG - Stopcodon, beendet die Translation
• CUA - Da die Translation durch das Stopcodon UAG bereits beendet wurde, wird dieses Codon nicht übersetzt.

Ergebnis

Die resultierende Aminosäuresequenz lautet:

Methionin (Met) - Prolin (Pro)

Hinweis: Die Translation stoppt beim ersten Stopcodon (UAG), sodass nachfolgende Sequenzen nicht mehr in Aminosäuren übersetzt werden.

c)

Angenommen, eine Mutation führt zu einem Austausch des Startcodons AUG durch ein Stopcodon UAG in der mRNA. Beschreibe die Auswirkungen dieser Mutation auf die Proteinbiosynthese. Welche Konsequenzen könnte dies auf die Funktion des Proteins haben und welche komplementären Mechanismen könnten unter Umständen dieser Mutation entgegenwirken?

Lösung:

Auswirkungen einer Mutation des Startcodons auf die Proteinbiosynthese

Wenn eine Mutation dazu führt, dass das Startcodon AUG durch ein Stopcodon UAG in der mRNA ersetzt wird, hat dies erhebliche Auswirkungen auf die Proteinbiosynthese.

Auswirkungen auf die Translation

Normalerweise:

• Das Startcodon AUG dient als Signal für den Beginn der Translation und kodiert für die Aminosäure Methionin (Met).
• Dies ist der Punkt, an dem das Ribosom mit der Synthese des Proteins beginnt.

Bei einer Mutation zu einem Stopcodon UAG:

• UAG ist eines der drei Stopcodons (UAA, UAG, UGA), die normalerweise das Ende der Translation signalisieren.
• Wenn das Startcodon AUG durch UAG ersetzt wird, erkennt das Ribosom dieses als Stoppsignal.
• Die Translation wird sofort abgebrochen, bevor sie überhaupt beginnt.

Konsequenzen für die Funktion des Proteins

• Das Protein wird überhaupt nicht synthetisiert, da die Translation nicht initiiert wird.
• Das Fehlen des Proteins kann zum Verlust der Funktion führen, die dieses Protein normalerweise im Zellstoffwechsel oder anderen biologischen Prozessen erfüllt.
• Abhängig von der Rolle des betroffenen Proteins könnte dies zu verschiedenen zellulären und organismischen Defekten führen.

Komplementäre Mechanismen zur Entgegenwirkung der Mutation

Einige Mechanismen könnten diese schädliche Mutation möglicherweise ausgleichen oder ihre Auswirkungen mindern:

• Alternative Startcodons: Manchmal enthält die mRNA Sequenzen, die alternative Startcodons (z.B. GUG oder UUG) enthalten könnten, die verwendet werden, wenn das primäre Startcodon nicht funktionstüchtig ist. Diese Verwendung führt jedoch oft zu einer abweichenden und möglicherweise funktionell beeinträchtigten Proteinsynthese.
• Suppressor-tRNAs: In manchen Fällen können spezielle tRNAs, sogenannte Suppressor-tRNAs, Stopcodons ignorieren und Aminosäuren in die wachsende Polypeptidkette einfügen. Diese Mechanismen sind jedoch nicht immer effizient und können zu nicht funktionierenden Proteinen führen.
• Genetische Reparaturmechanismen: In der Zelle existieren Reparaturmechanismen, wie die Exzisionsreparatur oder die homologe Rekombination, die DNA-Schäden und Mutationen identifizieren und korrigieren können, bevor die mRNA synthetisiert wird.
• Gene Duplications: Multigenfamilien oder redundante Gene können die Funktion des ausgefallenen Proteins übernehmen.