Grundpraktikum Biochmie und Bioanalytik - Cheatsheet.pdf

HPLC und Massenspektrometrie

Definition:

Techniken zur Trennung und Identifikation von Molekülen.

Details:

• HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie): Trennmethode basierend auf Flüssigphase und Stationärphase
• Wichtige Parameter: Retentionszeit, Flussrate, Säulentyp
• Massenspektrometrie (MS): Identifikation und Quantifizierung von Verbindungen durch Messung des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses (m/z)
• Kopplung von HPLC und MS zur hochaufgelösten Analyse (LC-MS)
• Typische Anwendungen: Proteomics, Metabolomics, Pharmakokinetik

Western Blotting

Definition:

Methode zur Detektion spezifischer Proteine in einer Probe mittels Gel-Elektrophorese und Antikörperbindung. Neechtest nach der Protein-Isolation.

Details:

• Trennung der Proteine nach Größe durch SDS-PAGE
• Transfer der Proteine vom Gel auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF)
• Blockieren unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran
• Inkubation mit primären Antikörpern, die spezifisch an das Zielprotein binden
• Inkubation mit sekundären Antikörpern, die an die primären Antikörper binden und ein Nachweissystem enthalten (z.B. Enzym oder Fluoreszenzmarker)
• Detektion und Analyse der Signale, z.B. mittels Chemilumineszenz oder Fluoreszenz
• Berechnung der relativen Proteinmengen durch Vergleich der Signalintensitäten

PCR-Analyse und Nukleinsäuren

Definition:

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifikation spezifischer DNA-Abschnitte. Nukleinsäuren wie DNA und RNA sind Träger genetischer Information.

Details:

• Denaturierung der DNA bei ca. 94 °C
• Primeranlagerung bei ca. 50-65 °C
• Elongation durch Taq-Polymerase bei 72 °C
• \[ n_{\text{Zyklen}} = 2^{n} \] für die Berechnung der DNA-Menge
• Nötige Komponenten: DNA Matrize, Primer, dNTPs, Puffer, Taq-Polymerase
• Nukleinsäuren bestehen aus Basen, Zucker und Phosphatgruppen

Enzymkinetik und -mechanismen

Definition:

Analyse der Geschwindigkeit enzymkatalysierter Reaktionen und deren Mechanismen

Details:

• Michaelis-Menten-Gleichung: \[V_0 = \frac{V_{max} [S]}{K_m + [S]}\]
• Lineweaver-Burk-Diagramm: Doppelt-reziproke Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung \[\frac{1}{V_0} = \frac{K_m}{V_{max} [S]} + \frac{1}{V_{max}}\]
• Inhibitorentypen: kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv (Einfluss auf \(K_m\) und \(V_{max}\))
• Enzymmechanismen: Schlüssel-Schloss-Prinzip, Induced Fit
• Wichtige Parameter: \(K_m\) (Michaelis-Konstante), \(V_{max}\) (maximale Reaktionsgeschwindigkeit), \(k_{cat}\) (Wechselzahl)

Fluoreszenzmikroskopie und Konfokalmikroskopie

Definition:

Fluoreszenzmikroskopie: Visualisierung von Strukturen durch Fluorophorenmarkierung und spezifische Lichtanregung. Konfokalmikroskopie: optische Schnittbilder durch Fokussierung auf eine bestimmte Ebene und Ausschluss von Streulicht.

Details:

• Fluoreszenzmikroskopie: Anregung von Fluorophoren mit spezifischen Wellenlängen, Emission fluoreszierenden Lichts.
• Ermöglicht Untersuchung spezifischer Strukturen innerhalb von Zellen.
• Konfokalmikroskopie: Verwendung von Punktlichtquellen und Lochblenden zur Reduktion von Streulicht und Verbesserung der optischen Auflösung.
• 3D-Visualisierung durch Schichtenweise Abtastung der Probe.
• Höhere Auflösung und Detailgenauigkeit im Vergleich zur herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie.

Proteinreinigung und -charakterisierung

Definition:

Verfahren zur Isolierung und Analyse von Proteinen

Details:

• Proteingewinnung: Zellaufschluss, Zentrifugation
• Chromatographie: Affinitäts-, Ionenaustausch-, Gelfiltration
• Elektrophorese: SDS-PAGE, 2D-Gelelektrophorese
• Reinheitsprüfung: Western Blot, Massenspektrometrie
• Quantifizierung: Bradford-Assay, BCA-Assay
• Strukturanalyse: NMR, Röntgenkristallographie

Bioinformatik-Werkzeuge zur Datenanalyse

Definition:

Tools zur Analyse großer biologischer Datenmengen.

Details:

• Sequenzanalyse: BLAST, ClustalW
• Genomanalyse: Genome Browser, IGV
• Proteinstruktur: PyMOL, Swiss-Model
• Datenvisualisierung: R, Python (Biopython, Matplotlib)

Molekularbiologie und Genexpression

Definition:

Molekularbiologie untersucht die molekularen Grundlagen der biologischen Aktivität, Genexpression umfasst die Prozesse, durch die genetische Informationen genutzt werden, um Proteine und RNA zu synthetisieren.

Details:

• DNA-Replikation: Verdopplung der DNA vor der Zellteilung
• Transkription: Umschreiben von DNA in mRNA
• Translation: Umsetzung von mRNA in Proteine durch Ribosomen
• Genregulation: Steuerung der Genexpression durch Transkriptionsfaktoren, Enhancer, Silencer
• Operon-Modell: Genregulation in Prokaryonten
• Epigenetik: Modifikationen der DNA, die die Genexpression beeinflussen, ohne die DNA-Sequenz zu ändern
• Techniken: PCR, Gelelektrophorese, Northern Blot, Western Blot