Praxis-Biowissenschaftliche Forschung - Exam.pdf

Aufgabe 1)

Du hast kürzlich in einer Biologievorlesung die Struktur und Funktion von DNA, RNA und Proteinen studiert. DNA ist bekannt für ihre doppelhelikale Struktur und die Speicherung genetischer Information. RNA hingegen hat eine einsträngige Struktur und ist für die Übertragung genetischer Information verantwortlich. Proteine sind Polypeptide mit vielfältigen Funktionen wie z.B. Katalyse, Struktur, Transport und Signalübertragung.

Erinnerst du dich an Folgendes?:

• DNA: Phosphat-Zucker-Rückgrat, Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C), Guanin (G)
• RNA: Phosphat-Zucker-Rückgrat, Adenin (A), Uracil (U), Cytosin (C), Guanin (G)
• Proteine: Polypeptidkette aus Aminosäuren, Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur
• Transkription: DNA zu mRNA
• Translation: mRNA zu Protein
• Funktionen von Proteinen: Katalyse (Enzyme), Struktur (Kollagen), Transport (Hämoglobin), Signalübertragung (Hormone)

a)

Erklärungsfrage: Beschreibe den Prozess der Transkription und Translation, und erkläre die Unterschiede zwischen DNA und RNA hinsichtlich ihrer jeweiligen Strukturen und Basenpaarbindungen.

Berücksichtige hierbei die folgenden Punkte:

• Den Ablauf der Transkription von DNA zu mRNA
• Den Ablauf der Translation von mRNA zu einem Protein
• Die Strukturunterschiede zwischen DNA und RNA
• Die Basenpaarbindungen bei DNA und RNA

Lösung:

Transkription:

Der Prozess der Transkription ist der erste Schritt der Genexpression, in dem ein DNA-Abschnitt in mRNA (messenger RNA) umgeschrieben wird. Dies geschieht in mehreren Schritten:

• Initiation: Ein Enzym namens RNA-Polymerase bindet an eine spezifische DNA-Sequenz, den Promotor, und entwindet die DNA-Doppelhelix.
• Elongation: Die RNA-Polymerase liest den Matrizenstrang der DNA in 3'-5'-Richtung und synthetisiert eine komplementäre mRNA in 5'-3'-Richtung. Sie verwendet dabei die Basen Adenin (A), Uracil (U), Cytosin (C) und Guanin (G).
• Termination: Sobald die RNA-Polymerase ein Terminator-Signal erreicht, stoppt die Transkription, und die mRNA wird freigesetzt.
• Post-transkriptionale Modifikationen: Bevor die mRNA das Zellkern verlässt, wird sie prozessiert. Dazu gehören das Hinzufügen einer 5'-Kappe und eines 3'-Poly-A-Schwanzes sowie das Spleißen, bei dem Introns entfernt und Exons verbunden werden.

Translation:

Die Translation ist der Prozess, bei dem die mRNA-Sequenz in eine Aminosäurekette, also ein Protein, übersetzt wird. Dieser Prozess findet im Cytoplasma statt und läuft in mehreren Schritten ab:

• Initiation: Die mRNA bindet an eine Ribosom-Einheit. Ein tRNA-Molekül mit einer Aminosäure bindet an das Startcodon (AUG) der mRNA.
• Elongation: Das Ribosom bewegt sich entlang der mRNA, und tRNA-Moleküle bringen entsprechende Aminosäuren zu den jeweiligen Codons der mRNA. Diese Aminosäuren werden durch Peptidbindungen miteinander verknüpft, wodurch eine Polypeptidkette entsteht.
• Termination: Wenn das Ribosom auf ein Stoppcodon (UAA, UAG, UGA) trifft, endet die Translation, und das fertige Protein wird freigesetzt.

Strukturunterschiede zwischen DNA und RNA:

• DNA: DNA hat eine doppelhelikale Struktur und besteht aus zwei komplementären Strängen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaare verbunden sind. Die Basen sind Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G). Das Rückgrat der DNA besteht aus Phosphat- und Zuckermolekülen (Desoxyribose).
• RNA: RNA ist im Allgemeinen einsträngig. Die Basen der RNA sind Adenin (A), Uracil (U), Cytosin (C) und Guanin (G). Das Rückgrat der RNA besteht aus Phosphat- und Zuckermolekülen (Ribose).

Basenpaarbindungen bei DNA und RNA:

• DNA: Die Basenpaarbindungen sind spezifisch: Adenin (A) paart mit Thymin (T) über zwei Wasserstoffbrücken, und Guanin (G) paart mit Cytosin (C) über drei Wasserstoffbrücken.
• RNA: Hier paart Adenin (A) mit Uracil (U), und Guanin (G) paart mit Cytosin (C). Die Basenpaarbindungen in RNA sind nicht immer strikt, da RNA einsträngig ist und oft Sekundärstrukturen durch intramolekulare Basenpaarungen bildet.

b)

Berechnungsfrage: Angenommen, du hast ein Gen mit folgender DNA-Sequenz:

5'- ATGCTTACG -3'

1. Gib die komplementäre DNA-Sequenz an.2. Transkribiere die komplementäre DNA-Sequenz in eine mRNA-Sequenz.3. Bestimme die Anzahl der möglichen Sekundärstrukturen und Tertiärstrukturen, die das resultierende Protein haben könnte, wenn die mRNA in ein Polypeptid mit 3 verschiedenen Aminosäuren (z.B. Alanin, Valin, Glycin) translatiert wird. Beachte hierbei die Grundstrukturen der Proteinfaltung.

Lösung:

1. Komplementäre DNA-Sequenz:

Die komplementäre DNA-Sequenz zu der gegebenen Sequenz 5'- ATGCTTACG -3' wird von 3'-5' geschrieben und lautet:

3'- TACGAATGC -5'

Das ist die Sequenz auf dem Matrizenstrang der DNA.

2. Transkription der komplementären DNA-Sequenz in mRNA:

Transkribiert man die komplementäre DNA-Sequenz (3'- TACGAATGC -5') in eine mRNA-Sequenz, erhält man:

5'- AUGCUUACG -3'

Die mRNA-Sequenz ist somit: 5'- AUGCUUACG -3'

3. Bestimmung der Anzahl der möglichen Sekundär- und Tertiärstrukturen des resultierenden Proteins:

• Sekundärstrukturen: Sekundärstrukturen sind Strukturen wie Alpha-Helices und Beta-Faltblätter, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Peptidbindungen entstehen. Da der Prozess der Proteinsekundärstruktur komplex ist und stark von der Aminosäuresequenz abhängt, kann die genaue Anzahl der möglichen Sekundärstrukturen nicht ohne detaillierte Informationen über die spezifischen Wechselwirkungen und die Umgebungsbedingungen bestimmt werden.
• Tertiärstrukturen: Die Tertiärstruktur eines Proteins ist die dreidimensionale Anordnung aller Atome im Protein. Sie hängt von den intermolekularen Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten der Aminosäuren ab. Bei einem Polypeptid mit 3 verschiedenen Aminosäuren wie Alanin, Valin und Glycin gibt es theoretisch eine Vielzahl von möglichen Tertiärstrukturen, abhängig von den spezifischen Wechselwirkungen und der Faltungsenergie.

Da jede Kombination von Sekundärstrukturen (Alpha-Helix, Beta-Faltblatt, Schleifen und Windungen) zur Bildung einer Tertiärstruktur beitragen kann, und da die genaue Vorhersage der Proteinfaltung sehr komplex ist, gibt es keine einfache Methode, die exakte Anzahl der möglichen Sekundär- und Tertiärstrukturen zu bestimmen. Die Individualität der Faltung bedeutet, dass dieselbe Aminosäuresequenz unterschiedliche Strukturen annehmen kann, abhängig von der zellulären Umgebung und anderen Faktoren.

Aufgabe 2)

Der Einsatz von PCR und Gel-Elektrophorese in der biowissenschaftlichen Forschung: Du hast eine DNA-Probe erhalten und möchtest ein spezifisches Gen amplifizieren, um es anschließend mittels Gel-Elektrophorese zu analysieren. Dein Ziel ist es, die Anwesenheit und Größe des Gens zu überprüfen.

a)

Beschreibe die einzelnen Schritte, die Du bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchführen musst. Gehe dabei auf die Temperaturen und die Dauer der jeweiligen Schritte ein.

Lösung:

Schritte der Polymerase-Kettenreaktion (PCR):

• Denaturierung: In diesem Schritt wird die Doppelhelix-DNA durch Erhitzen auf etwa 94-98 °C in zwei einzelne Stränge getrennt. Dies dauert in der Regel etwa 20-30 Sekunden.
• Annealing: Die Temperatur wird auf etwa 50-65 °C gesenkt, damit die Primer an die komplementären Sequenzen auf den einzelnen DNA-Strängen binden können. Dieser Schritt dauert etwa 20-40 Sekunden. Die genaue Temperatur hängt von der Schmelztemperatur der verwendeten Primer ab.
• Elongation: Die Temperatur wird auf etwa 72 °C erhöht, was die optimale Temperatur für die Taq-Polymerase ist, um die DNA zu synthetisieren. Die Polymerase fügt in diesem Schritt dNTPs (Desoxyribonukleotid-Triphosphate) an das 3'-Ende des Primers an und verlängert so die DNA-Stränge. Die Dauer dieses Schrittes hängt von der Länge des amplifizierten DNA-Abschnitts ab, beträgt jedoch meist etwa 1 Minute pro 1.000 Basenpaare.
• Zyklische Wiederholung: Die Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation werden typischerweise 25-35 mal wiederholt, um genügend DNA zu amplifizieren.
• Endelongation: Nach den zyklischen Wiederholungen findest eine abschließende Elongationsphase statt, um sicherzustellen, dass alle DNA-Stränge vollständig synthetisiert sind. Dies dauert in der Regel etwa 5-10 Minuten bei 72 °C.
• Abkühlen: Schließlich wird die Reaktion bei etwa 4 °C abgekühlt und kann für die nachfolgende Analyse, wie zum Beispiel die Gel-Elektrophorese, verwendet werden.

b)

Erkläre, wie die Gel-Elektrophorese dazu genutzt wird, um die Ergebnisse der PCR zu analysieren. Beschreibe, wie Du die Größe der DNA-Fragmente bestimmen kannst und welcher chemische Farbstoff üblicherweise zur Visualisierung der Banden verwendet wird.

Lösung:

Analyse der PCR-Ergebnisse mittels Gel-Elektrophorese:

• Vorbereitung des Gels: Zuerst wird ein Agarosegel hergestellt, das in einer Pufferlösung gegossen wird. Das Gel wird anschließend in eine Gelkammer gelegt, die mit demselben Puffer gefüllt ist.
• Beladen der Proben: Die PCR-Produkte werden zusammen mit einem DNA-Ladepuffer in die Taschen des Gels pipettiert. Der Ladepuffer enthält Farbstoffe, die die Bewegung der Proben durch das Gel visualisieren und Glycerin oder Ficoll, das die Dichte der Proben erhöht, so dass sie in den Taschen bleiben.
• Elektrophorese: Eine elektrische Spannung wird an das Gel angelegt. DNA ist negativ geladen und wandert daher in Richtung des positiven Pols (Anode). Kleinere DNA-Fragmente bewegen sich schneller durch das Gel als größere Fragmente und trennen sich somit nach Größe.
• Visualisierung der DNA-Banden: Nach der Elektrophorese wird das Gel normalerweise mit einem chemischen Farbstoff gefärbt, um die DNA sichtbar zu machen. Ein üblicher Farbstoff ist Ethidiumbromid (EtBr), der unter UV-Licht fluoresziert, wenn er an DNA gebunden ist. Alternativ können auch sicherere Farbstoffe wie SYBR Green verwendet werden.
• Bestimmung der Größe der DNA-Fragmente: Um die Größe der DNA-Fragmente zu bestimmen, wird neben den PCR-Proben ein DNA-Leitermarker (Molekulargewichtsmaker) in das Gel geladen. Der Marker enthält DNA-Fragmente bekannter Größen. Durch den Vergleich der migrierten PCR-Produkte mit den Banden des Markers kann die Größe der PCR-Produkte abgeschätzt werden.
• Analyse der Ergebnisse: Die Bandenmuster auf dem Gel werden analysiert. Wenn das spezifische Gen erfolgreich amplifiziert wurde, sollten Banden an den erwarteten Positionen erscheinen, die der Größe des Zielgens entsprechen.

Aufgabe 3)

Ein Wissenschaftler untersucht die Regulation des glykolytischen Weges in einer Zellkultur von Säugerzellen. Beschreibe ausführlich, wie die Glykolyse durch verschiedene molekulare Mechanismen reguliert werden kann. Verwende dabei die folgenden Konzepte: enzymatische Regulation, Genexpression, Substratverfügbarkeit, zellulärer Energiestatus, Signaltransduktion, Kompartimentierung und epigenetische Faktoren.

a)

Enzymatische Regulation: Erläutere die Rolle der Phosphofruktokinase-1 (PFK-1) in der Glykolyse und wie diese durch allosterische Modulation reguliert wird. Diskutiere, wie ATP, ADP und AMP als allosterische Effektor-Moleküle wirken und beschreibe die Auswirkungen ihrer Konzentration auf die Aktivität von PFK-1. Berechne, wie sich die Aktivität von PFK-1 ändert, wenn der AMP-Gehalt in der Zelle von 0,1 mM auf 0,3 mM ansteigt, vorausgesetzt, die Michaelis-Menten-Konstante (\textit{K_m}) für AMP beträgt 0,2 mM.

Lösung:

Enzymatische Regulation: Phosphofruktokinase-1 (PFK-1) spielt eine zentrale Rolle in der Glykolyse, indem sie die Phosphorylierung von Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat katalysiert. Dieser Schritt ist ein wichtiger Kontrollpunkt, da er irreversibel ist und stark reguliert wird.

PFK-1 wird durch allosterische Modulation reguliert. Das bedeutet, dass die Aktivität des Enzyms durch die Bindung von Effektor-Molekülen an Stellen außerhalb des aktiven Zentrums beeinflusst wird. ATP, ADP und AMP sind wichtige allosterische Effektor-Moleküle:

• ATP: ATP wirkt als negativer allosterischer Modulator. Wenn die Konzentrationen von ATP hoch sind, signalisiert dies einen hohen Energiestatus, was zur Hemmung von PFK-1 führt und somit die Glykolyse verlangsamt.
• ADP und AMP: ADP und insbesondere AMP wirken als positive allosterische Modulatoren. Hohe Konzentrationen dieser Moleküle signalisieren, dass die Energiereserven der Zelle niedrig sind, was zur Aktivierung von PFK-1 führt und somit die Glykolyse beschleunigt.

Betrachten wir den Effekt der AMP-Konzentration auf die Aktivität von PFK-1 anhand der Michaelis-Menten-Gleichung:

\[ V = V_{max} \cdot \frac{[S]}{K_m + [S]} \]

Hierbei ist \( V \) die Reaktionsgeschwindigkeit, \( V_{max} \) die maximale Geschwindigkeit, \( [S] \) die Substratkonzentration und \( K_m \) die Michaelis-Menten-Konstante.

Wir betrachten zwei Fälle:

• Fall 1: \( [AMP] = 0,1 \, mM \)
• Fall 2: \( [AMP] = 0,3 \, mM \)

Die spezifische Aktivität von PFK-1 in diesen Fällen kann wie folgt berechnet werden:

\[ V_{0,1} = V_{max} \cdot \frac{0,1}{0,2 + 0,1} = V_{max} \cdot \frac{0,1}{0,3} = V_{max} \cdot \frac{1}{3} \]

\[ V_{0,3} = V_{max} \cdot \frac{0,3}{0,2 + 0,3} = V_{max} \cdot \frac{0,3}{0,5} = V_{max} \cdot \frac{3}{5} \]

Vergleichen wir die beiden Aktivitäten:

• Bei \( [AMP] = 0,1 \, mM \) ist die Aktivität: \( V_{0,1} = V_{max} \cdot \frac{1}{3} \).
• Bei \( [AMP] = 0,3 \, mM \) ist die Aktivität: \( V_{0,3} = V_{max} \cdot \frac{3}{5} \).

Daher erhöht sich die Aktivität von PFK-1, wenn der AMP-Gehalt in der Zelle von 0,1 mM auf 0,3 mM ansteigt. Die Beziehung \( \frac{3}{5} > \frac{1}{3} \) zeigt, dass die PFK-1 Aktivität bei einer höheren AMP-Konzentration zunimmt, was zu einer gesteigerten Glykolyse führt.

b)

Genexpression: Diskutiere die Rolle der Transkriptionsregulation im Rahmen der Glykolyse. Erörtere, wie Transkriptionsfaktoren die Expression glykolytischer Enzyme in Reaktion auf hormonelle Signale regulieren. Berücksichtige dabei die Rolle von Insulin und Glukagon. Erläutere auch, wie epigenetische Modifikationen wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen Einfluss auf die Genexpression nehmen können.

Lösung:

Genexpression: Die Regulation der Genexpression spielt eine wesentliche Rolle bei der Kontrolle der Glykolyse, indem sie die Menge und Aktivität der glykolytischen Enzyme in der Zelle bestimmt. Diese Regulation erfolgt auf mehreren Ebenen, darunter Transkriptionsregulation, die durch Transkriptionsfaktoren beeinflusst wird.

Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden und die Transkription von Genen aktivieren oder hemmen. Im Kontext der Glykolyse regulieren Transkriptionsfaktoren die Expression von Genen, die für Enzyme wie Hexokinase, Phosphofruktokinase-1 (PFK-1) und Pyruvatkinase kodieren, um die glykolytische Kapazität der Zelle in Reaktion auf verschiedene Signale anzupassen.

Insbesondere hormonelle Signale wie Insulin und Glukagon spielen eine entscheidende Rolle bei der Transkriptionsregulation der glykolytischen Enzyme:

• Insulin: Insulin wird von der Bauchspeicheldrüse als Reaktion auf hohe Glukosespiegel im Blut freigesetzt. Es fördert die Transkription von Genen, die Enzyme der Glykolyse kodieren. Insulin aktiviert Transkriptionsfaktoren wie SREBP-1c (Sterol Regulatory Element-Binding Protein 1c), die an Promotorregionen der glykolytischen Gene binden und ihre Expression steigern.
• Glukagon: Glukagon wird von der Bauchspeicheldrüse als Reaktion auf niedrige Blutzuckerspiegel freigesetzt. Es wirkt antagonistisch zu Insulin und hemmt die Transkription glykolytischer Enzyme. Glukagon aktiviert den cAMP-Signalweg, der zur Aktivierung von CREB (cAMP Response Element-Binding Protein) und zur Hemmung der Transkription von glykolytischen Genen führt.

Zusätzlich zur Transkriptionsregulation beeinflussen epigenetische Modifikationen die Genexpression glykolytischer Enzyme:

• DNA-Methylierung: Die Methylierung von Cytosinbasen in CpG-Dinukleotiden innerhalb der Promotorregionen von Genen kann die Genexpression hemmen. Hohe Methylierungsgrade in den Promotorregionen glykolytischer Enzyme sind mit einer reduzierten Genexpression assoziiert. Dies wirkt als ein Mechanismus, um die Expression dieser Enzyme in Reaktion auf metabolische Bedürfnisse zu modulieren.
• Histonmodifikationen: Posttranslationale Modifikationen von Histonproteinen wie Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung können die Chromatinstruktur verändern und somit den Zugang von Transkriptionsfaktoren zur DNA beeinflussen. Beispielsweise fördert die Acetylierung von Histon-H3-Lysin-9 (H3K9ac) eine offene Chromatinstruktur und erleichtert die Transkription, während die Methylierung von Histon-H3-Lysin-27 (H3K27me3) mit einer geschlossenen Chromatinstruktur und Transkriptionsrepression assoziiert ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Regulation der Genexpression durch Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikationen sowohl kurzfristige als auch langfristige Anpassungen der glykolytischen Kapazität der Zelle ermöglicht, um auf sich ändernde metabolische Anforderungen zu reagieren.

Aufgabe 4)

Im Rahmen eines Forschungsprojekts hast Du das Genom einer unbekannten Bakterienart sequenziert. Die folgenden Fragen beziehen sich auf die Analyse und Interpretation dieser genomischen Daten.

a)

Lösung:

Im Rahmen eines Forschungsprojekts hast Du das Genom einer unbekannten Bakterienart sequenziert. Die folgenden Fragen beziehen sich auf die Analyse und Interpretation dieser genomischen Daten.

• (a) Nach der Sequenzierung hast Du herausgefunden, dass ein bestimmtes Gen eine Punktmutation aufweist, die zu einem vorzeitigen Stoppcodon führt.

• Ein vorzeitiges Stoppcodon führt dazu, dass die Translation des Gens vorzeitig abgebrochen wird.
• Dadurch wird ein verkürztes Polypeptid erzeugt, das wahrscheinlich nicht alle notwendigen funktionellen Domänen enthält.
• Dies kann bewirken, dass das resultierende Protein seine normale Funktion nicht ausführen kann oder gar nicht funktionsfähig ist.
• Der Verlust der Proteinaktivität kann vielfältige Auswirkungen haben, abhängig davon, welche Rolle das Protein im Bakterium spielt. Mögliche Folgen könnten sein:
• Wenn das Protein essentiell für das Überleben des Bakteriums ist, könnte die Punktmutation letal sein und zum Tod des Bakteriums führen.
• Wenn das Protein eine Rolle in der Pathogenität spielt, könnte die Mutation die Virulenz des Bakteriums verändern.
• In manchen Fällen könnte das Protein auch nur teilweise funktionsfähig sein, was zu einer reduzierten Effizienz führt.

b)

Lösung:

Im Rahmen eines Forschungsprojekts hast Du das Genom einer unbekannten Bakterienart sequenziert. Die folgenden Fragen beziehen sich auf die Analyse und Interpretation dieser genomischen Daten.

• (b) Beschreibe, wie Du mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und anschließender Sequenzierung bestätigen kannst, dass diese Mutation in der gesamten Bakterienpopulation vorhanden ist.

• Schritt 1: Primer Design Die Primer sind kurze DNA-Sequenzen, die spezifisch an die Regionen angrenzen, die amplifiziert werden sollen. Um die Mutation zu amplifizieren, müssen Primer entworfen werden, die die flankierenden Bereiche der mutierten Region binden. Die Wahl der richtigen Primer ist entscheidend, da sie die Spezifität und Effizienz der PCR beeinflussen.
  • Der Forward-Primer: Er bindet an den Anfang des Zielbereichs der DNA.
  • Der Reverse-Primer: Er bindet am Ende des Zielbereichs der DNA.
• Schritt 2: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR wird verwendet, um die spezifische Region der DNA, die die Mutation enthält, zu amplifizieren.
  • Denaturierung: Die doppelsträngige DNA wird bei hoher Temperatur (ca. 94–98 °C) in Einzelstränge getrennt.
  • Annealing: Die Temperatur wird gesenkt (ca. 50–65 °C), damit die Primer an die spezifischen Sequenzen auf den Einzelsträngen binden können.
  • Elongation: Die Taq-Polymerase synthetisiert einen neuen DNA-Strang, indem sie die Nukleotide an die 3'-Enden der Primer anfügt und die DNA-Sequenz in 5'-3'-Richtung verlängert (bei ca. 72 °C).
  Dieser Zyklus wird typischerweise 25-35 Mal wiederholt, um die Ziel-DNA exponentiell zu vervielfältigen.
• Schritt 3: Gelelektrophorese Nach der PCR wird die Amplifikationsprodukte auf einem Agarosegel aufgetragen und durch Gelelektrophorese getrennt, um zu überprüfen, ob die PCR erfolgreich war und die erwartete Größe hat.
• Schritt 4: Sequenzierung Die amplifizierten DNA-Fragmente werden gereinigt und einer DNA-Sequenzierung unterzogen, um die genaue Nukleotidsequenz zu bestimmen.
  • Die Sequenzierung erfolgt in der Regel mittels Sanger-Sequenzierung oder einer modernen Methode wie Next-Generation Sequencing (NGS).
• Schritt 5: Datenanalyse Die erhaltenen Sequenzen werden analysiert, um die Präsenz der Punktmutation zu bestätigen und zu überprüfen, ob diese Mutation in allen untersuchten DNA-Proben vorhanden ist.
Durch diese Schritte kann sicher festgestellt werden, ob die spezifische Mutation in der gesamten Bakterienpopulation vorkommt oder ob sie nur in einer Untergruppe vorhanden ist.

c)

Lösung:

Im Rahmen eines Forschungsprojekts hast Du das Genom einer unbekannten Bakterienart sequenziert. Die folgenden Fragen beziehen sich auf die Analyse und Interpretation dieser genomischen Daten.

• (c) Du möchtest untersuchen, ob diese Mutation die Genexpression beeinflusst. Erkläre, wie Du mithilfe der Quantitativen Real-Time PCR (qPCR) die Expression des mutierten Gens im Vergleich zu einem Wildtypgen messen kannst. Welche Kontrollproben würden notwendig sein?

• Schritt 1: RNA-Extraktion Zuerst muss die gesamte RNA aus den Bakterienzellen extrahiert werden. Dazu werden sowohl die mutierten Bakterien als auch die Wildtypbakterien verwendet.
• Schritt 2: cDNA-Synthese Die extrahierte RNA wird mittels einer reversen Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Diese cDNA dient als Vorlage für die qPCR.
• Schritt 3: Design der qPCR-Primer Spezifische Primer müssen entworfen werden, die an die Regionen des mutierten Gens und des entsprechenden Wildtypgens binden. Diese Primer sollten so ausgewählt werden, dass sie spezifisch für die Zielgene sind und keine unspezifischen Amplifikationsprodukte erzeugen.
• Schritt 4: Durchführung der qPCR Die qPCR wird mit den spezifischen Primern und der cDNA durchgeführt. Hierbei werden fluoreszierende Farbstoffe verwendet, die an die amplifizierte DNA binden und dadurch die Menge der amplifizierten Produkte in Echtzeit messen können.
  • Denaturierung: Die cDNA wird bei hoher Temperatur in Einzelstränge getrennt.
  • Annealing: Die Temperatur wird gesenkt, damit die Primer an die cDNA anlagern können.
  • Elongation: Die Polymerase synthetisiert einen neuen DNA-Strang und die fluoreszierenden Farbstoffe binden an die neu synthetisierten DNA-Fragmente.
  Die Zunahme der Fluoreszenz wird während jedes Zyklus gemessen, was eine quantifizierte Darstellung der DNA-Menge gibt.
• Schritt 5: Datenanalyse Die Veränderung der Genexpression wird durch die Analyse der Ct-Werte (Threshold Cycle) festgestellt. Ein niedrigerer Ct-Wert bedeutet eine höhere Genexpression.
  • Die Genexpression des mutierten Gens wird mit der des Wildtypgens verglichen.
  • Relative Quantifizierungsmethoden wie die \(\text{ΔΔCt}\text{-Methode}\) können verwendet werden, um die Expression der Gene zu normalisieren.
• Notwendige Kontrollproben Um valide Ergebnisse zu erhalten, sind mehrere Kontrollproben notwendig:
  • Housekeeping-Gene: Diese Gene werden als interne Kontrollen verwendet, da ihre Expression konstant ist und nicht von der Mutation beeinflusst wird. Beispiele könnten Gene für 16S rRNA oder andere konstitutiv exprimierte Gene sein.
  • Negative Kontrollproben: Proben ohne cDNA (No-Template Control, NTC) werden verwendet, um sicherzustellen, dass keine Kontamination in den Reagenzien oder in der PCR-Reaktion vorliegt.
  • Positivkontrollen: Diese Kontrollen enthalten eine bekannte Menge der Ziel-DNA, um sicherzustellen, dass die PCR-Reaktion ordnungsgemäß funktioniert.

d)

Lösung:

Im Rahmen eines Forschungsprojekts hast Du das Genom einer unbekannten Bakterienart sequenziert. Die folgenden Fragen beziehen sich auf die Analyse und Interpretation dieser genomischen Daten.

• (d) Setze voraus, dass die Mutation die Aktivität eines wichtigen Stoffwechselfaktors reduziert. Entwickle ein CRISPR-Cas9 Editierungsexperiment, um diese Mutation zu korrigieren. Beschreibe die Schritte und Komponenten, die für dieses Experiment notwendig sind.

• Schritt 1: Design der gRNA (Guide RNA) Die Guide RNA (gRNA) ist eine kurze RNA-Sequenz, die an die Ziel-DNA bindet und die Cas9-Nuklease zum spezifischen Schnittort führt. Für dieses Experiment musst Du eine gRNA entwerfen, die spezifisch an die Region der Mutation bindet.
  • Die gRNA besteht aus einer CRISPR-RNA (crRNA), die an die Zielsequenz bindet, und einer Trans-aktivierenden crRNA (tracrRNA), die die Cas9-Bindung fördert.
  • Die Zielsequenz für die gRNA muss nahe der Mutation und in der Nähe eines Protospacer Adjacent Motif (PAM) liegen, da Cas9 dies für das Schneiden benötigt (häufig die Sequenz NGG).
• Schritt 2: Konstruktion des Reparaturtemplates Ein Reparaturtemplate (auch Donor-DNA genannt) wird benötigt, um die gewünschte Sequenz in die Ziel-DNA einzuführen. Dieses Template enthält:
  • Die korrekte (wildtypische) Sequenz des Gens ohne die Mutation.
  • Flankierende homologiearme Regionen auf beiden Seiten der Schnittstelle, die das Einfügen durch homologieabhängige Reparatur (HDR) erleichtern.
• Schritt 3: Zusammensetzung des CRISPR-Cas9-Komplexes Der CRISPR-Cas9-Komplex besteht aus:
  • Der Cas9-Nuklease, die die Ziel-DNA schneidet.
  • Der gRNA, die die Cas9-Nuklease zur spezifischen Mutationsstelle führt.
• Schritt 4: Zelluläre Transfektion Die Komponenten (gRNA, Cas9-Nuklease und Reparaturtemplate) werden in die Bakterienzellen eingebracht.
  • Dies kann durch verschiedene Methoden erfolgen, z.B. durch Elektroporation oder chemische Transformationen.
• Schritt 5: Screenen und Selektieren der bearbeiteten Zellen Nach der Transfektion werden die Bakterienkulturen auf ihre Veränderung hin gescreent.
  • PCR und Sequenzierung können verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Mutation erfolgreich korrigiert wurde.
• Eine Selektion kann notwendig sein, um spezifisch diejenigen Zellen zu isolieren, die die korrekte genetische Editierung aufweisen.
• Erforderliche Komponenten:
  • Cas9-Nuklease: Eine DNA-schneidende Enzym, das durch die gRNA zur Zielstelle geführt wird.
  • Guide RNA (gRNA): Eine RNA-Sequenz, die die Cas9 genau zur gewünschten Genomregion dirigiert.
  • Reparaturtemplate: Eine DNA-Sequenz, die das korrekte Erbgut enthält, um die Mutation zu reparieren.
  • Transfektionsreagenzien: Chemikalien oder Geräte, die die Einführung der CRISPR-Cas9-Komponenten in die Bakterienzellen ermöglichen.
  • PCR-Reagenzien und Sequenzierungsausrüstung: Werkzeuge, um die genetischen Veränderungen zu überprüfen und zu bestätigen.