Fachmodul Biochemie I - Exam

Aufgabe 1)

Reinigung eines Enzyms aus PflanzenDer Prozess der Isolierung eines spezifischen Enzyms aus pflanzlichen Geweben umfasst mehrere Schritte:

• Homogenisierung der Pflanzenprobe: Zerkleinern und Suspension in Pufferlösung.
• Zentrifugation: Trennung der Zelltrümmer von der löslichen Phase.
• Präzipitation: Fällung von Proteinen durch Ammoniumsulfat oder Ethanol.
• Dialyse: Entfernung von kleinen Molekülen und Salzen.
• Chromatographie: Einsatz von Ionenaustausch-, Gel- oder Affinitätschromatographie zur Reinigung.
• Enzymaktivitätsassay: Überprüfung der Reinheit und Aktivität des Enzyms.

a)

Beschreibe detailliert den Prozess der Homogenisierung und die darauffolgende Zentrifugation. Diskutiere die Gründe für die Wahl eines bestimmten Puffers und wie dieser den Homogenisierungsprozess beeinflusst. Stelle sicher, dass Deine Antwort die biochemischen Prinzipien erklärt, die während der Zentrifugation wirken.

Lösung:

Homogenisierung und Zentrifugation bei der Reinigung eines Enzyms aus PflanzenHomogenisierung der Pflanzenprobe:Der erste Schritt bei der Isolierung eines spezifischen Enzyms aus pflanzlichen Geweben ist die Homogenisierung. Dieser Prozess beinhaltet:

• Zerkleinern: Die Pflanzenprobe wird mechanisch zerkleinert, oft mit einem Mixer oder Homogenisator. Dies zerstört die Zellwände und setzt den Zellinhalt frei.
• Suspension in Pufferlösung: Die zerkleinerten Pflanzenteile werden in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert. Die Wahl des Puffers ist entscheidend und hängt von mehreren Faktoren ab:

• pH-Wert: Der Puffer sollte den optimalen pH-Wert für die Stabilität und Aktivität des Enzyms aufrechterhalten. Oft wird ein Puffer wie Tris-HCl oder Phosphatpuffer verwendet, der einen bestimmten pH-Wert konstant hält.
• Ionenstärke: Eine geeignete Ionenstärke unterstützt die Löslichkeit und Stabilität der Proteine, indem sie elektrostatische Wechselwirkungen ausgleicht.
• Protease-Inhibitoren: Um die Zerstörung des Zielenzyms durch proteolytische Enzyme zu verhindern, werden oft Protease-Inhibitoren dem Puffer hinzugefügt.
• Reduktionsmittel: In einigen Fällen werden Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) hinzugefügt, um die Oxidation von thiolhaltigen Enzymen zu verhindern.

Zentrifugation:Nachdem die Pflanzenprobe homogenisiert und in Pufferlösung suspendiert wurde, folgt die Zentrifugation. Diese dient dazu, Zelltrümmer von der löslichen Phase zu trennen.

• Mechanismus der Zentrifugation: In diesem Schritt wird die Suspension bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Durch die Zentrifugalkraft setzen sich die schweren Zelltrümmer am Boden des Zentrifugenröhrchens ab, während die löslichen Proteine, einschließlich des Zielenzyms, in der Überstandsflüssigkeit (Supernatant) bleiben.
• Biochemische Prinzipien: Die Trennung basiert auf Unterschieden in der Dichte und Größe der Partikel. Zelltrümmer, die größer und dichter sind, sedimentieren schneller als die löslichen Proteine. Dies führt zu einer klaren Phase, die das Zielenzym enthält, und einer pelletierten Phase, die die Zelltrümmer enthält.
• Dauer und Geschwindigkeit: Die genaue Dauer und Geschwindigkeit der Zentrifugation sind wichtig. Typische Bedingungen sind etwa 10.000 bis 15.000 U/min (Umdrehungen pro Minute) für 10 bis 30 Minuten, abhängig von der Art der Pflanze und dem Zielenzym.

Durch die Wahl eines geeigneten Puffers und die Effizienz der Zentrifugation wird sichergestellt, dass das Zielenzym in einer möglichst reinen und aktiven Form für die nachfolgenden Reinigungsschritte zur Verfügung steht.

Aufgabe 2)

Die Expression rekombinanter Proteine in E. coli und Pflanzen ist ein essenzieller Bestandteil der biotechnologischen Forschung, Medizin und Industrie. Dabei spielen verschiedene Faktoren wie die Plasmidaufnahme, Promotoren, Optimierung der Genexpression, posttranslationale Modifikationen und Endproduktausbeute eine wichtige Rolle.

• Plasmidaufnahme (Transformation): E. coli durch Hitzeschock oder Elektroporation; Pflanzen durch Agrobacterium-vermittelten Transfer.
• Promotoren: Spezifische Promotoren für E. coli (z.B. T7) und Pflanzen (z.B. 35S).
• Optimierung der Genexpression durch Codon-Optimierung, Fusion an Tags (z.B. His-Tag) für Reinigung.
• Posttranslationale Modifikationen: In E. coli limitiert; in Pflanzen möglich.
• Endproduktausbeute: Abhängig von Expressionssystem und genetischer Konstruktion.
• Caveats: Mögliche Bildung von Einschlusskörpern in E. coli; Regulation der Genexpression in Pflanzen komplexer.

a)

a) Beschreibe den Prozess der Transformation in E. coli und vergleiche ihn mit der Transformation in Pflanzen. Worauf muss bei der Transformation in beiden Systemen besonders geachtet werden?

Lösung:

a) Transformation in E. coli vs. Pflanzen

Der Prozess der Transformation bezieht sich auf die Einführung von Fremd-DNA in eine Zelle. Sowohl in E. coli als auch in Pflanzen gibt es spezifische Methoden, die für die Transformation verwendet werden. Lassen uns diese Prozesse näher betrachten und vergleichen:

• Transformation in E. coli:
  • Hitzeschock-Transformation: - E. coli Zellen werden in einem Kältemedium (CaCl₂) in Anwesenheit der zu transformierenden Plasmid-DNA inkubiert. - Die Zellen werden kurz auf 42°C erhitzt, was die Zellmembran destabilisiert und so die Aufnahme der Plasmid-DNA ermöglicht.
  • Elektroporation: - Die Zellen werden in einem Elektrolytmedium in Anwesenheit von Plasmid-DNA platziert. - Ein kurzer elektrischer Puls wird angelegt, der temporär Poren in die Zellmembran reißt, durch die die DNA in die Zellen gelangen kann.
• Transformation in Pflanzen:
  • Agrobacterium-vermittelter Transfer: - Pflanzenzellen werden mit Agrobacterium tumefaciens inkubiert, einem Bodenbakterium, das natürliche Gentransfersysteme verwendet. - Die im Agrobacterium eingeführte rekombinante Plasmid-DNA wird in das pflanzliche Genom integriert.
  • Biolistik (Genkanone): - DNA-beschichtete mikroskopische Partikel (z.B. Gold- oder Wolframkügelchen) werden durch hohe Geschwindigkeit in Pflanzengewebe geschossen. - Einige Partikel dringen in die Zellen ein und die DNA kann im Zellkern integriert werden.

Besonderheiten bei der Transformation in beiden Systemen:

• Transformation in E. coli:
  • Plasmidstabilität und Selektion: Es ist wichtig sicherzustellen, dass E. coli die transformierte Plasmid-DNA stabil behält und selektierbare Marker (z.B. Antibiotikaresistenzen) verwendet werden, um transformierende Zellen auszuwählen.
  • Einschlusskörper: In E. coli kann es zur Bildung von Einschlusskörpern kommen, was die Funktionalität und Reinheit der rekombinanten Proteine beeinträchtigen kann.
• Transformation in Pflanzen:
  • Effizienz: Agrobacterium-vermittelte Transformation ist relativ effizient für zweikeimblättrige Pflanzen (Dicots), aber weniger effizient für einkeimblättrige Pflanzen (Monocots) wie Getreide.
  • Genomische Integration: Die Integration der DNA ins pflanzliche Genom kann unvorhersehbare Effekte haben, wie Gen-Silencing oder Instabilität der integrierten DNA.

b)

b) Erkläre, wie spezifische Promotoren für E. coli (z.B. T7) und Pflanzen (z.B. 35S) funktionieren. Welche Vorteile bietet die Verwendung dieser Promotoren in den jeweiligen Systemen?

Lösung:

b) Spezifische Promotoren für E. coli und Pflanzen

Promotoren sind DNA-Sequenzen, die die Transkription eines Gens durch RNA-Polymerase initiieren. Die Wahl des Promotors ist entscheidend für die Effizienz und Kontrolle der Genexpression in verschiedenen Organismen. Hier betrachten wir spezifische Promotoren für E. coli und Pflanzen und erläutern ihre Funktionsweise sowie die Vorteile ihrer Verwendung.

• Promotoren in E. coli:
  • T7-Promotor: - Der T7-Promotor stammt vom Bakteriophagen T7 und wird von der T7-RNA-Polymerase erkannt. - Diese Polymerase besitzt eine sehr hohe Transkriptionsrate und ist spezifisch für den T7-Promotor.
  • Vorteile:
    • Hohe Expressionsrate: Der T7-Promotor ermöglicht eine sehr hohe Produktion des Zielproteins, da die T7-RNA-Polymerase spezifisch und äußerst effizient ist.
    • Kontrollierte Expression: Die Expression kann durch das lac-Operon-System kontrolliert werden, bei dem die T7-RNA-Polymerase nur in Anwesenheit von Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) produziert wird.
• Promotoren in Pflanzen:
  • Cauliflower Mosaic Virus 35S (CaMV 35S) Promotor: - Der 35S-Promotor stammt vom Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) und ist bekannt für seine starke konstitutive Aktivität in vielen Pflanzenarten. - Dieser Promotor ist aktiv in fast allen pflanzlichen Geweben und Entwicklungsstadien.
  • Vorteile:
    • Breite Wirtsspezifität: Der 35S-Promotor ist in einer Vielzahl von Pflanzenarten, sowohl in Mono- als auch in Dikotylen, hochwirksam.
    • Starke konstitutive Expression: Er ermöglicht eine kontinuierliche und hohe Expression des Zielgens in den meisten Geweben.

Zusammengefasst bieten spezifische Promotoren wie der T7-Promotor in E. coli und der 35S-Promotor in Pflanzen deutliche Vorteile in Bezug auf die Effizienz und Steuerung der Genexpression in den jeweiligen Systemen. Die Wahl des geeigneten Promotors ist daher entscheidend für den Erfolg der rekombinanten Proteinproduktion.

c)

c) Diskutiere die Limitationen der posttranslationalen Modifikationen in E. coli und wie diese in Pflanzen umgehen werden können. Welche Auswirkungen haben diese Unterschiede auf die Endproduktausbeute?

Lösung:

c) Limitationen der posttranslationalen Modifikationen in E. coli und Pflanzen

Posttranslationale Modifikationen (PTMs) sind chemische Veränderungen, die nach der Proteinbiosynthese an Proteinen vorgenommen werden und für ihre Funktion, Stabilität und Lokalisation unerlässlich sind. Diese Modifikationen können Phosphorylierung, Glykosylierung, Ubiquitinierung und andere umfassen. E. coli und Pflanzen haben unterschiedliche Kapazitäten für PTMs, was erhebliche Auswirkungen auf die Funktionalität und Menge der produzierten rekombinanten Proteine hat.

• Limitationen der posttranslationalen Modifikationen in E. coli:
  • Mangel an komplexen PTMs: E. coli besitzt nicht die notwendigen Enzyme und zellulären Apparate, um komplexe PTMs wie N- und O-Glykosylierung, die in höheren Eukaryoten häufig sind, durchzuführen.
  • Einfache PTMs: Während E. coli einfache Modifikationen wie Phosphorylierungen und Acetylierungen durchführen kann, sind diese oft nicht ausreichend für die richtige Proteinstruktur und Funktion von menschlichen oder pflanzlichen Proteinen.
  • Inklusionskörper: In E. coli produzierte rekombinante Proteine neigen dazu, sich als unlösliche Aggregate (Inklusionskörper) zu bilden, was ihre biologische Aktivität beeinträchtigt.
• Umgehung der Limitationen in Pflanzen:
  • Komplexe PTMs: Pflanzenzellen haben die Fähigkeit, komplexe PTMs wie Glykosylierungen durchzuführen, ähnlich wie in menschlichen Zellen. Dies führt oft zu voll funktionsfähigen rekombinanten Proteinen.
  • Proteinfaltung und -prozessierung: Pflanzen bieten ein eukaryotisches System mit den notwendigen Chaperonen und Enzymen zur korrekten Faltung und Prozessierung komplexer Proteine.
  • Geringere Aggregation: Rekombinante Proteine, die in Pflanzen produziert werden, neigen weniger zur Bildung von Inklusionskörpern und sind in der Regel löslicher und funktioneller.

Auswirkungen auf die Endproduktausbeute:

• In E. coli:
  • Geringere Funktionalität: Fehlende oder unvollständige PTMs können die Funktionalität und Stabilität der rekombinanten Proteine beeinträchtigen, was zu einer geringeren Ausbeute an bioaktivem Protein führen kann.
  • Verlust durch Aggregation: Die Bildung von Inklusionskörpern kann dazu führen, dass ein signifikanter Anteil des produzierten Proteins unlöslich und somit biologisch inaktiv ist.
• In Pflanzen:
  • Erhöhte Funktionalität: Vollständige und korrekte PTMs in Pflanzen führen zu funktionelleren und stabileren rekombinanten Proteinen, was die Ausbeute an bioaktivem Protein erhöht.
  • Bessere Löslichkeit: Die geringere Neigung zur Aggregation in Pflanzen führt zu höheren Mengen an löslichem und funktionellem Protein.

Zusammengefasst sind die Kapazitäten für posttranslationale Modifikationen in Pflanzen denjenigen in E. coli überlegen, was zu funktionelleren Proteinen und einer höheren Endproduktausbeute führt.

Aufgabe 3)

Benenne und erkläre die zentralen Prozesse des Kohlenhydratstoffwechsels in Pflanzen. Erläutere insbesondere die Rolle der Photosynthese, der Glykolyse, des Zitronensäurezyklus und des Pentosephosphatwegs. Gehe außerdem auf die wichtigste Enzyme wie Rubisco, ATP-Synthase, Hexokinase und Phosphofruktokinase ein und erkläre ihre Funktionen. Welche Hauptprodukte werden durch diese Prozesse erzeugt und warum sind sie für die Pflanze essentiell?

a)

Beschreibe den gesamten Photosyntheseprozess in Pflanzen. Gehe dabei besonders auf die lichtabhängigen und die lichtunabhängigen Reaktionen ein. Verwende die folgende Formel als Ausgangspunkt und erklär die Produkte, die dabei gebildet werden:

• Photosynthese:
  • Betrachte die Rolle der Rubisco im Calvin-Zyklus und erkläre ihre Funktion.

Lösung:

Photosynthese in Pflanzen

Der Photosyntheseprozess in Pflanzen ist ein komplexer Ablauf, der hauptsächlich in den Chloroplasten der Pflanzenzellen stattfindet. Dieser Prozess wird in zwei Hauptphasen eingeteilt: die lichtabhängigen Reaktionen und die lichtunabhängigen Reaktionen, die auch als Calvin-Zyklus bekannt sind. Die allgemeine Formel für die Photosynthese lautet:

6 CO₂ + 6 H₂O + Lichtenergie → C₆H₁₂O₆ + 6 O₂

• Lichtabhängige Reaktionen:
  • Diese Reaktionen finden in der Thylakoidmembran der Chloroplasten statt.
  • Sie benötigen Licht, um die Energie in Form von ATP (Adenosintriphosphat) und NADPH (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat) zu erzeugen.
  • Der Prozess beginnt, wenn Licht von den Chlorophyllmolekülen absorbiert wird und die Elektronen in einem höheren Energiezustand angeregt werden.
  • Diese angeregten Elektronen werden dann durch die Elektronentransportkette bewegt, was zur Bildung von ATP und NADPH führt. Diese Moleküle sind Energiespeicher, die in den lichtunabhängigen Reaktionen verwendet werden.
  • Ein Nebenprodukt dieser Reaktionen ist Sauerstoff (O₂), der aus der Spaltung von Wasser entsteht.
• Lichtunabhängige Reaktionen (Calvin-Zyklus):
  • Diese Reaktionen finden im Stroma der Chloroplasten statt und benötigen kein Licht.
  b
  • Der Calvin-Zyklus verwendet ATP und NADPH, die in den lichtabhängigen Reaktionen erzeugt wurden, um Kohlendioxid (CO₂) in Glucose (C₆H₁₂O₆) zu fixieren.
  • Ein wichtiges Enzym hierbei ist Rubisco (Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase), das CO₂ mit Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP) fixiert, um eine stabile Verbindung zu erzeugen.

Die Rolle der Rubisco im Calvin-Zyklus:

• Rubisco ist das häufigste und eines der wichtigsten Enzyme im Calvin-Zyklus.
• Es katalysiert die erste bedeutende Reaktion des Calvin-Zyklus, bei der CO₂ mit RuBP fixiert wird, um 3-Phosphoglycerinsäure (3-PGA) zu bilden.
• Die entstandene 3-PGA wird in einer Reihe von Reaktionen unter Verwendung von ATP und NADPH weiter zu Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) umgewandelt.
• Ein Teil des produzierten G3P wird genutzt, um Glucose und andere Kohlenhydrate zu synthetisieren, die als Energiequelle und für das Wachstum der Pflanze verwendet werden.
• Rubisco ist essenziell, da es die Geschwindigkeit des gesamten Calvin-Zyklus bestimmt und somit die Effizienz der Photosynthese beeinflusst.

Zusammenfassend lässt sich sagen:

• Die lichtabhängigen Reaktionen erzeugen ATP und NADPH und spalten Wasser, um Sauerstoff freizusetzen.
• Die lichtunabhängigen Reaktionen (Calvin-Zyklus) fixieren CO₂ und produzieren Glucose, wobei Rubisco eine zentrale Rolle spielt.
• Die durch die Photosynthese produzierten Hauptprodukte (Glucose und Sauerstoff) sind essentiell für das Überleben der Pflanze. Glucose dient als primäre Energiequelle und Baustoff, während Sauerstoff ein Nebenprodukt ist, das für die Atmung lebender Organismen entscheidend ist.

Dieser Prozess ist grundlegend für das Leben auf der Erde, da er die Basis für die Nahrungskette bildet und den Sauerstoffgehalt der Atmosphäre aufrechterhält.

b)

Erläutere die Schritte der Glykolyse und nenne die Hauptprodukte, die dabei entstehen. Verwende die folgende Formel und erkläre, was mit ATP und NADH während der Glykolyse passiert:

• Glykolyse (vereinfachtes Schema):
  • Erkläre die Rolle von Hexokinase und Phosphofruktokinase innerhalb der Glykolyse und warum diese Enzyme essentiell sind.

Lösung:

Glykolyse in Pflanzen

Die Glykolyse ist ein zentraler Stoffwechselweg, der in nahezu allen lebenden Organismen vorkommt. In Pflanzen findet sie im Cytoplasma der Zellen statt und dient dazu, Glucose (C₆H₁₂O₆) in Pyruvat (C₃H₄O₃) abzubauen, wobei Energie in Form von ATP und NADH gewonnen wird. Die vereinfachte Formel der Glykolyse lautet:

C₆H₁₂O₆ → 2 C₃H₄O₃ + 2 ATP + 2 NADH

Im Folgenden werden die verschiedenen Schritte der Glykolyse beschrieben:

• Schritt 1: Phosphorylierung von Glucose
  • Die Glykolyse beginnt mit der Phosphorylierung von Glucose zu Glucose-6-phosphat (G6P), wobei ein Molekül ATP zu ADP umgewandelt wird.
  • Dieses erste Reaktionsschritt wird durch das Enzym Hexokinase katalysiert, welches sehr wichtig ist, um die Glucose in der Zelle zu halten und sie für den weiteren Abbau vorzubereiten.
• Schritt 2: Umwandlung von G6P zu Fructose-6-phosphat (F6P)
  • Glucose-6-phosphat wird durch das Enzym Phosphoglucoseisomerase in Fructose-6-phosphat umgewandelt.
• Schritt 3: Phosphorylierung von F6P
  • Fructose-6-phosphat wird durch ein weiteres Molekül ATP zu Fructose-1,6-bisphosphat (F1,6BP) phosphoryliert, wobei das Enzym Phosphofruktokinase (PFK) eine zentrale Rolle spielt.
  • Phosphofruktokinase ist ein Schlüsselregulationsenzym in der Glykolyse und bestimmt die Geschwindigkeit des gesamten Prozesses.
• Schritt 4: Spaltung von F1,6BP
  • Fructose-1,6-bisphosphat wird durch das Enzym Aldolase in zwei dreikohlige Moleküle gespalten: Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P).
  • DHAP wird durch das Enzym Triosephosphatisomerase in G3P umgewandelt, sodass zwei Moleküle G3P vorliegen.
• Schritte 5-10: Energiegewinnungsphase
  • Die beiden G3P-Moleküle werden in einer Serie von Reaktionen, bei denen NAD+ zu NADH reduziert und ATP produziert wird, zu Pyruvat umgewandelt.
  • Insgesamt werden aus einem Glucose-Molekül durch Substratkettenphosphorylierung vier Moleküle ATP gebildet. Da jedoch zwei ATP initial verbraucht wurden, bleibt ein Nettogewinn von zwei Molekülen ATP pro Molekül Glucose.
  • Zwei Moleküle NADH werden ebenfalls produziert, die später in der Atmungskette zur ATP-Bildung verwendet werden können.

Die Rolle von Hexokinase und Phosphofruktokinase:

• Hexokinase: Dieses Enzym katalysiert den ersten Schritt der Glykolyse und sorgt dafür, dass Glucose zu Glucose-6-phosphat phosphoryliert wird. Dies ist ein kritischer Schritt, da die phosphorylierte Form der Glucose in der Zelle behalten wird und nicht durch die Zellmembran diffundieren kann.
• Phosphofruktokinase (PFK): PFK katalysiert den dritten Schritt der Glykolyse, bei dem Fructose-6-phosphat zu Fructose-1,6-bisphosphat phosphoryliert wird. Dieser Schritt ist stark reguliert und wird durch verschiedene Metaboliten und Energiezustände der Zelle beeinflusst. PFK ist ein Schlüsselregulator und bestimmt die Flussrate der Glykolyse.

Zusammenfassend lässt sich sagen:

• Die Glykolyse ist ein essentieller Prozess für die Energiegewinnung in Pflanzenzellen.
• Die Hauptprodukte der Glykolyse sind Pyruvat, ATP und NADH.
• Hexokinase und Phosphofruktokinase sind entscheidende Enzyme, die die Effizienz und Regulation der Glykolyse bestimmen.

c)

Der Pentosephosphatweg ist ein weiterer bedeutender Prozess im Kohlenhydratstoffwechsel. Erkläre dessen Rolle und welche besonderen Produkte dabei entstehen. Gehe zusätzlich auf die Bedeutung dieses Weges für die Synthese von Nukleotiden ein.

Lösung:

Pentosephosphatweg und seine Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel

Der Pentosephosphatweg (auch als Pentosephosphatzyklus oder Hexosemonophosphatweg bekannt) ist ein essenzieller Stoffwechselweg, der parallel zur Glykolyse in den Zellen abläuft. Dieser Weg hat unterschiedliche Rollen und führt zur Herstellung wichtiger Zwischenprodukte, die für verschiedene biosynthetische Prozesse genutzt werden.

Der Pentosephosphatweg kann in zwei Hauptphasen unterteilt werden:

• Oxidative Phase:
  • In dieser Phase wird Glucose-6-phosphat (G6P) oxidiert und in Ribulose-5-phosphat (Ru5P) umgewandelt, wobei NADP+ zu NADPH reduziert wird.
  • Der erste Schritt dieser Phase wir von dem Enzym Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase katalysiert und ist ein entscheidender Kontrollpunkt des Weges.
• Nicht-oxidative Phase:
  • In dieser Phase werden die Fünf-Kohlenstoff-Zucker, die in der oxidativen Phase gebildet wurden, reorganisiert und zu Glykolyse-Intermediaten wie Fructose-6-phosphat (F6P) und Glycerinaldehyd-3-phosphat (G3P) umgewandelt.
  • Diese Phase ermöglicht eine flexible Anpassung an den Bedarf der Zelle an Ribose-5-phosphat (R5P), das für die Synthese von Nukleotiden benötigt wird.

Hauptprodukte des Pentosephosphatwegs:

• NADPH:
  • NADPH (Nicotinamidadenindinukleotidphosphat) ist ein Reduktionsmittel und wird in vielen anabolen Prozessen, wie der Fettsäuresynthese und der Bekämpfung von oxidativem Stress, verwendet.
• Ribose-5-phosphat (R5P):
  • Ribose-5-phosphat ist ein essentielles Vorläufermolekül für die Synthese von Nukleotiden und Nukleinsäuren (DNA und RNA).
• Intermediatprodukte:
  • Die aus der nicht-oxidativen Phase entstehenden Intermediatprodukte wie Fructose-6-phosphat und Glycerinaldehyd-3-phosphat können wieder in die Glykolyse eingeschleust werden.

Bedeutung des Pentosephosphatwegs für die Nukleotidsynthese:

• Der Pentosephosphatweg ist von entscheidender Bedeutung für die Bereitstellung von Ribose-5-phosphat, das als Grundgerüst für die Synthese von Nukleotiden dient. Nukleotide sind die Bausteine der DNA und RNA und daher essentiell für die Zellteilung, das Wachstum und die Vermehrung.
• NADPH, das im Pentosephosphatweg produziert wird, spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Synthese von Nukleotiden, da es als Reduktionsmittel in verschiedenen biosynthetischen Prozessen dient.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Pentosephosphatweg eine duale Rolle im Stoffwechsel der Pflanze spielt: Er liefert NADPH für anabole Prozesse und schützt die Zelle vor oxidativem Stress, und er stellt Ribose-5-phosphat für die Nukleotidsynthese zur Verfügung. Beide Hauptprodukte, NADPH und R5P, sind für das Überleben und das Wachstum der Pflanze von wesentlicher Bedeutung.

d)

Berechne die Nettoausbeute an ATP, die durch den vollständigen Abbau eines Moleküls Glukose bis zum Ende des Zitronensäurezyklus generiert wird. Berücksichtige dabei alle Schritte der Glykolyse, den Übergang von Pyruvat zu Acetyl-CoA und den eigentlichen Zitronensäurezyklus. Gehe auf die Bedeutung der Energieproduktion für die Pflanze ein.

Lösung:

Nettoausbeute an ATP beim Abbau eines Glukosemoleküls bis zum Ende des Zitronensäurezyklus

Der vollständige Abbau eines Glukosemoleküls durchläuft verschiedene Prozesse, nämlich die Glykolyse, den Übergang von Pyruvat zu Acetyl-CoA und den Zitronensäurezyklus (auch als Citratzyklus oder Krebs-Zyklus bekannt). Jeder dieser Prozesse trägt zur Produktion von ATP bei. Im Folgenden werden die Nettoausbeute an ATP und die beteiligten Schritte beschrieben:

• Glykolyse:
  • In der Glykolyse wird Glukose (C₆H₁₂O₆) in zwei Moleküle Pyruvat umgewandelt.
  • Nettoproduktion von ATP: 2 ATP (4 ATP werden produziert, aber 2 ATP werden in der Investitionsphase verbraucht).
  • Produktion von NADH: 2 NADH (die später in der Atmungskette verwendet werden können).
• Übergang von Pyruvat zu Acetyl-CoA:
  • Jedes Pyruvat-Molekül wird in Acetyl-CoA umgewandelt. Dies geschieht zweimal pro Molekül Glukose, da zwei Pyruvat-Moleküle aus einer Glukose gebildet werden.
  • Produktion von NADH: 2 NADH (1 NADH pro Pyruvat-Molekül).
• Zitronensäurezyklus:
  • Jedes Acetyl-CoA-Molekül tritt in den Zitronensäurezyklus ein, wo es weiter oxidiert wird.
  • Produktion von ATP (durch Substratkettenphosphorylierung): 2 ATP (1 ATP pro Acetyl-CoA-Molekül).
  • Produktion von NADH: 6 NADH (3 NADH pro Acetyl-CoA-Molekül).
  • Produktion von FADH₂: 2 FADH₂ (1 FADH₂ pro Acetyl-CoA-Molekül).

Berechnung der Netto-ATP-Ausbeute:

• Direkte ATP-Produktion:2 ATP (Glykolyse) + 2 ATP (Zitronensäurezyklus) = 4 ATP
• ATP aus NADH:
  • Glykolyse: 2 NADH \times 2.5 ATP pro NADH = 5 ATP
  • Übergang (Pyruvat zu Acetyl-CoA): 2 NADH \times 2.5 ATP pro NADH = 5 ATP
  • Zitronensäurezyklus: 6 NADH \times 2.5 ATP pro NADH = 15 ATP
• ATP aus FADH₂: 2 FADH₂ \times 1.5 ATP pro FADH₂ = 3 ATP

• Gesamtsumme der erzeugten ATP: 4 (direkt) + 25 (aus NADH) + 3 (aus FADH₂) = 32 ATP

Bedeutung der Energieproduktion für die Pflanze:

• ATP ist das universelle Energiegeld der Zelle. Es wird verwendet, um eine Vielzahl von zellulären Prozessen anzutreiben, einschließlich Transport, Synthese und Signalgebung.
• Durch die Produktion von ATP aus Glukose kann die Pflanze Energie effizient nutzen, um Wachstumsprozesse, zelluläre Reparaturen und andere Biosynthesewege zu unterstützen.
• Die bei der Atmung erzeugte Energie wird auch für die Aufrechterhaltung des zellulären Gleichgewichts und die Anpassung an Umweltveränderungen benötigt.

Aufgabe 4)

Du hast die Aufgabe, die Methoden der PCR und Klonierung in einem Experiment zur Amplifikation und zum Einfügen einer spezifischen DNA-Sequenz in einen bakteriellen Vektor durchzuführen. Verwende die folgenden Informationen:

• PCR (Polymerase Chain Reaction) besteht aus drei Hauptschritten: Denaturierung (95°C), Annealing (50-65°C) und Elongation (72°C), und nutzt die Taq-Polymerase als Hauptenzym.
• Zur Klonierung wird die Ziel-DNA mit Restriktionsenzymen geschnitten und anschließend mit Ligase in einen Plasmidvektor ligiert.
• Die Transformation beschreibt das Einführen des rekombinanten Plasmids in Bakterienzellen.
• Nach der Transformation müssen rekombinante Klone durch Screening identifiziert werden.

a)

a) Beschreibe den Prozess der PCR im Detail, einschließlich der spezifischen Temperaturen und der Rolle der Taq-Polymerase.

Lösung:

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen. Der Prozess besteht aus drei Hauptschritten: Denaturierung, Annealing und Elongation. Hier sind die Schritte im Detail beschrieben:

• Denaturierung (95°C): Während dieses ersten Schritts wird die doppelsträngige DNA in einzelne Stränge getrennt. Dies geschieht durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf 95°C, wodurch die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren der DNA aufgebrochen werden.
• Annealing (50-65°C): Im zweiten Schritt wird die Temperatur gesenkt, typischerweise auf einen Bereich zwischen 50 und 65°C. Dies ermöglicht das Anlagern (Anheften) von spezifischen Primern an die Einzelstrang-DNA. Die genaue Temperatur hängt von der Schmelztemperatur (Tm) der verwendeten Primer ab.
• Elongation (72°C): Während des dritten Schritts erfolgt die Synthese des neuen DNA-Strangs. Bei 72°C wird die Taq-Polymerase, ein thermostabiles Enzym, aktiv. Die Taq-Polymerase verlängert die DNA-Stränge, indem sie Nukleotide an die Primer anfügt und einen neuen komplementären Strang bildet.

Die Taq-Polymerase spielt eine entscheidende Rolle in der PCR. Sie ist hitzestabil und kann daher in der hitzigen Umgebung der Denaturierungsschritte aktiv bleiben. Dieses Enzym synthetisiert neue DNA-Stränge, indem es freie dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate) an den Primer bindet und so die Sequenz verlängert.

b)

b) Angenommen, Du möchtest eine spezifische DNA-Sequenz, die 1500 Basenpaare lang ist, vervielfältigen. Wie viele Zyklen der PCR müsstest Du theoretisch durchlaufen, um eine Menge von 1.000.000 Kopien aus einer einzigen Kopie zu erhalten? Verwende die Formel:

• N = N0 \times 2^n ,
• wobei N die Endmenge der DNA-Kopien ist, N0 die Anfangsmenge (1) und n die Anzahl der Zyklen darstellt.

Lösung:

Um die erforderliche Anzahl von PCR-Zyklen zu berechnen, kannst Du die gegebene Formel verwenden:

• \( N = N_0 \times 2^n \)

Hierbei ist \( N \) die Endmenge der DNA-Kopien (in diesem Fall 1.000.000), \( N_0 \) die Anfangsmenge (1) und \( n \) die Anzahl der Zyklen, die wir berechnen möchten. Umgestellt lautet die Formel für \( n \):

• \( n = \frac{\text{log}(N/N_0)}{\text{log}(2)} \)

Setze die Werte ein:

• \( N = 1.000.000 \)
• \( N_0 = 1 \)

Dann gilt:

• \( n = \frac{\text{log}(1.000.000/1)}{\text{log}(2)} \)
• \( n = \frac{\text{log}(1.000.000)}{\text{log}(2)} \)

Da \( \text{log}(1.000.000) \approx 6 \) (weil 1.000.000 = 10^6 und log(10^6) = 6) und \( \text{log}(2) \approx 0.3010 \), ergibt sich:

• \( n = \frac{6}{0.3010} \)
• \( n \approx 19.93 \)

Da die Anzahl der Zyklen eine ganze Zahl sein muss, rundest Du auf die nächste ganze Zahl auf:

• \( n = 20 \)

Du müsstest also theoretisch 20 Zyklen der PCR durchführen, um aus einer einzigen Kopie 1.000.000 Kopien zu erhalten.

c)

c) Erläutere den Mechanismus, wie Restriktionsenzyme und Ligase genutzt werden, um eine spezifische DNA-Sequenz in einen Plasmidvektor zu klonieren. Nenne dazu auch spezifische Enzymnamen, die häufig verwendet werden.

Lösung:

Um eine spezifische DNA-Sequenz in einen Plasmidvektor zu klonieren, werden Restriktionsenzyme und Ligase verwendet. Im Folgenden wird der Mechanismus dieser Methode erläutert:

• Schneiden der Ziel-DNA mit Restriktionsenzymen: Restriktionsenzyme, auch Restriktionsendonukleasen genannt, erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden die DNA an diesen Erkennungsstellen. Diese Enzyme erzeugen entweder Sticky Ends (klebrige Enden) oder Blunt Ends (stumpfe Enden). Ein häufig verwendetes Restriktionsenzym ist EcoRI, das die Sequenz 5'-GAATTC-3' erkennt und schneidet.
• Schneiden des Plasmidvektors: Der Plasmidvektor wird ebenfalls mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten. Dies stellt sicher, dass die Enden des Plasmids und der Ziel-DNA kompatibel sind und aneinander haften (bei klebrigen Enden).
• Ligation der Ziel-DNA in den Plasmidvektor: Sobald die Ziel-DNA und der Plasmidvektor geschnitten wurden, werden sie durch das Enzym DNA-Ligase miteinander verbunden. Die Ligase katalysiert die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen den benachbarten Nukleotiden und schließt die Lücken im Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA. Ein oft verwendetes Enzym hierfür ist die T4-DNA-Ligase.

Zusammengefasst:

• Verwendung von EcoRI, um sowohl die Ziel-DNA als auch den Plasmidvektor zu schneiden und komplementäre sticky ends zu erzeugen.
• Die geschnittenen DNA-Fragmente werden gemischt und durch T4-DNA-Ligase verbunden.

Auf diese Weise wird die spezifische DNA-Sequenz in den Plasmidvektor integriert, was die Grundlage für die anschließende Transformation und Selektion rekombinanter Klone bildet.

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d) Beschreibe die Schritte und Methoden, die für das Screening und die Identifikation rekombinanter Klone verwendet werden können. Welche Marker oder Assays könntest Du nutzen, um erfolgreich transformierte Bakterien zu erkennen?

Lösung:

Nach der Transformation müssen rekombinante Klone durch Screening und Identifikation der erfolgreich transformierten Bakterien erkannt werden. Hier sind die Schritte und Methoden, die dabei verwendet werden können:

• Selektion auf Antibiotikaresistenz: Oft enthalten die Plasmidvektoren ein Gen, das Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum verleiht (z.B. Ampicillin, Kanamycin). Die transformierten Bakterien werden auf einem Nährmedium kultiviert, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Nur die Zellen, die das Plasmid erfolgreich aufgenommen haben, können unter diesen Bedingungen wachsen.
• Blaue/weiße Selektion (LacZ-Komplementation): Ein weiteres gängiges Merkmal in Plasmidvektoren ist das LacZ-Gen, das für das Enzym Beta-Galactosidase kodiert. Wenn die Ziel-DNA in den LacZ-Rahmen eingefügt wird, disruptiert sie das Gen. Die transformierten Bakterien werden auf einem Medium mit X-Gal kultiviert. Bakterien ohne Insert (nicht-rekombinant) bleiben blau, während solche mit insertierter Ziel-DNA (rekombinant) weiß bleiben. Diese Methode erfordert einen Vektor mit einem funktionsfähigen LacZ-Gen und das Vorhandensein von X-Gal und IPTG im Medium.
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Um die Anwesenheit der Ziel-DNA im Plasmid zu bestätigen, können Kolonien direkt auf PCR getestet werden. Ein Teil der Kolonie wird in eine PCR-Reaktion gegeben und spezifische Primer werden verwendet, um die Ziel-DNA zu amplifizieren. Sind die richtigen PCR-Produkte vorhanden, ist die Ziel-DNA im Plasmid vorhanden.
• Plasmid-Isolation und Restriktionsenzym-Analyse: Eine weitere Bestätigungsmethode besteht darin, Plasmid-DNA aus den transformierten Bakterien zu isolieren und mit denselben oder anderen geeigneten Restriktionsenzymen zu schneiden. Die geschnittenen Produkte werden durch Gel-Elektrophorese analysiert. Das Muster der DNA-Banden kann bestätigen, ob die Ziel-DNA eingefügt wurde.
• Sequenzanalyse: Schließlich kann die genaueste Methode zur Bestätigung rekombinanter Klone die DNA-Sequenzierung sein. Dabei wird die DNA-Sequenz des eingefügten Fragments bestimmt, um zu überprüfen, dass die korrekte Sequenz vorhanden ist und keine Mutationen eingeführt wurden.

Zusammengefasst kann das Screening rekombinanter Klone Methoden wie Antibiotikaresistenz-Selektion, blaue/weiße Selektion, PCR, Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung umfassen. Diese Methoden bieten verschiedene Ansätze, um sicherzustellen, dass die Transformation erfolgreich war und die Ziel-DNA korrekt in den Plasmidvektor eingefügt wurde.