Fachmodul Entwicklungsbiologie II - Exam

Aufgabe 1)

In der Genregulation spielen Promotoren und Enhancer-Elemente eine entscheidende Rolle. Promotoren sind DNA-Sequenzen, die als Startpunkte für die Transkription dienen und RNA-Polymerase binden. Sie enthalten oft charakteristische Erkennungssequenzen wie die TATA-Box. Enhancer hingegen sind DNA-Elemente, die die Transkriptionsrate erhöhen können, indem sie Transkriptionsfaktoren binden. Diese Enhancer befinden sich häufig weit von dem Zielgen entfernt und können durch die Schleifenbildung der DNA funktional mit dem Promotor interagieren. Diese Interaktionen tragen zur zeit- und ortsspezifischen Genexpression bei, was besonders während der Entwicklung wichtig ist.

a)

Erkläre den Mechanismus der Schleifenbildung und wie diese zur Interaktion zwischen Promotoren und Enhancern beiträgt. Warum ist diese Schleifenbildung für die Genexpression während der Entwicklung besonders wichtig?

Lösung:

Mechanismus der Schleifenbildung:

• Schleifenbildung tritt auf, wenn Teile der DNA in einer Art und Weise gefaltet werden, dass weit entfernte DNA-Abschnitte physisch in Kontakt kommen.
• Diese Schleifenbildung wird durch Proteine vermittelt, die bestimmte Bereiche der DNA erkennen und binden.
• Transkriptionsfaktoren und Mediator-Komplexe spielen eine zentrale Rolle dabei, die DNA in eine Schleife zu zwingen, sodass Enhancer-Elemente näher an die Promotoren gebracht werden.
• Ein typisches Beispiel sind die Cohesin-Proteine, die helfen, die DNA zu stabilisieren und in einer Schleife zu halten.

Interaktion zwischen Promotoren und Enhancern:

• Durch die Schleifenbildung können Enhancer-Elemente, die sich möglicherweise Tausende von Basenpaaren entfernt vom Promotor befinden, Transkriptionsfaktoren rekrutieren, die dann den Promotor erreichen.
• Diese Interaktion erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die RNA-Polymerase an den Promotor bindet und die Transkription des Zielgens initiiert.
• Die räumliche Nähe dank der Schleifenbildung macht es den Transkriptionsfaktoren leichter, direkt mit dem Promotor und der RNA-Polymerase zu interagieren.

Bedeutung der Schleifenbildung für die Genexpression während der Entwicklung:

• Während der Entwicklung eines Organismus müssen bestimmte Gene zu bestimmten Zeiten und in bestimmten Zellen aktiviert oder deaktiviert werden.
• Die zeit- und ortsspezifische Genexpression wird häufig durch die spezifische Aktivität von Enhancern reguliert.
• Schleifenbildung ermöglicht es, dass ein und derselbe Enhancer verschiedene Promotoren in verschiedenen Zellen oder Entwicklungsstadien aktivieren kann.
• Dadurch wird die komplexe Genregulation ermöglicht, die für die richtige Entwicklung und Zellfunktion erforderlich ist.

b)

Angenommen, ein Experiment zeigte, dass die Deletion eines bestimmten Enhancers zur drastischen Verringerung der Expression eines Zielgens führt. Beschreibe ein mögliches experimentelles Vorgehen, um zu bestätigen, dass dieser Enhancer spezifisch mit dem Zielgen interagiert. Welche Methoden könnten in diesem Kontext verwendet werden?

Lösung:

Mögliches experimentelles Vorgehen zur Bestätigung der Interaktion eines Enhancers mit einem Zielgen:

• Natürliches Vorkommen prüfen: Vergleiche die Sequenzen und Aktivitäten von Enhancern und Promotoren in verschiedenen Geweben, um natürliche Interaktionen und Expressionsmuster zu identifizieren.
• Deletion oder Mutation: Stelle sicher, dass die Deletion oder Mutation des Enhancers zur spezifischen Reduktion des Zielgens führt und keine anderen Gene oder Regionen beeinflusst.
• Transiente Transfektion: Klone den Promotor und den Enhancer in einen Reportervektor (z. B. Luciferase). Transfiziere Zellen mit diesem Reporterkonstrukt und messe die Reportergenexpression. Füge dann eine Mutation oder Deletion im Enhancer hinzu und beobachte die Auswirkungen auf die Reportergenexpression.
• Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP): Führe ChIP-Experimente durch, um festzustellen, ob Transkriptionsfaktoren oder Mediator-Komplexe am Enhancer und Promotor binden. Der Nachweis der gleichen Faktoren an beiden Stellen unterstützt die Idee einer direkten Interaktion.
• 3C (Chromosome Conformation Capture): Diese Methode wird verwendet, um physische Interaktionen zwischen verschiedenen DNA-Regionen zu analysieren. Kreuzverknüpfe die DNA und schneide sie mit einem Restriktionsenzym. Ligiere die DNA und reverse die Kreuzverknüpfungen, um die Interaktion zwischen Promotor und Enhancer zu analysieren.
• 4C und 5C (Sequenzierung-Methoden): Verwende diese Methoden zur detaillierten Kartierung von DNA-DNA-Interaktionen. Besonders nützlich, wenn mehrere Enhancer und Promotoren analysiert werden sollen.
• CRISPR/Cas9 Knock-In und Knock-Out: Verwende die CRISPR-Technologie, um den Enhancer spezifisch zu löschen oder zu verändern, und beobachte die Auswirkungen auf die Genexpression. Verwende Kontrollen, um sicherzustellen, dass die Veränderungen spezifisch sind.
• Enhancer-Aktivitätsanalyse in vivo: Generiere transgene Organismen mit mutierten oder deletierten Enhancern und untersuche die Auswirkungen auf die Genexpression und das Phänotyp.

Fazit: Eine Kombination dieser Methoden kann eine robuste Bestätigung liefern, dass ein bestimmter Enhancer spezifisch mit einem Zielgen interagiert. Jedes der oben beschriebenen Experimente bietet einzigartige Einblicke und Daten, die zusammen zu einer klaren Schlussfolgerung führen können.

c)

Betrachte die folgende hypothetische Situation: In einer bestimmten Zelllinie bindet die RNA-Polymerase mit hoher Affinität an den Promotor eines wichtigen Entwicklungsgenes, jedoch wird das Gen nicht exprimiert. Welche Faktoren könnten für diese fehlende Genexpression verantwortlich sein, und wie könnte man experimentell vorgehen, um diese Faktoren zu identifizieren und zu kontrollieren?

Lösung:

Mögliche Faktoren für die fehlende Genexpression trotz hochaffiner Bindung der RNA-Polymerase:

• Absence of Activating Transcription Factors: Es könnten wichtige Transkriptionsfaktoren fehlen, die notwendig sind, um die Expression des Gens zu aktivieren.
• Presence of Repressive Transcription Factors: Repressive Transkriptionsfaktoren könnten die Genexpression unterdrücken, indem sie entweder direkt an den Promotor oder an nahegelegene regulatorische Elemente binden.
• Chromatin Structure: Die Chromatinstruktur könnte so konfiguriert sein, dass sie die Transkription verhindert, zum Beispiel durch die Anwesenheit von dicht gepacktem Heterochromatin.
• DNA Methylation: Methylierung der DNA an Promotor- oder Enhancer-Regionen könnte die Bindung von Transkriptionsfaktoren und damit die Genexpression verhindern.
• Histone Modifications: Posttranslationale Modifikationen der Histone, wie Methylierung oder Deacetylierung, könnten die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie beeinträchtigen.
• Absence of Enhancer Interaction: Möglicherweise interagiert der Promotor nicht effektiv mit entfernten Enhancern, die für die Aktivierung der Transkription notwendig sind.

Experimentelle Vorgehensweise zur Identifizierung und Kontrolle dieser Faktoren:

• Analyse der Transkriptionsfaktoren: Verwende Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP), um die Anwesenheit von aktivierenden oder repressiven Transkriptionsfaktoren am Promotor zu überprüfen. Verwende Antikörper gegen spezifische Transkriptionsfaktoren und analysiere die gebundenen DNA-Sektionen mittels qPCR oder Sequenzierung.
• Chromatinstruktur und Modifikationen: Führe ATAC-seq oder DNase-seq durch, um die Zugänglichkeit der Chromatinstruktur zu analysieren. Verwende ChIP-seq mit Antikörpern gegen spezifische Histonmodifikationen oder Chromatin-remodeling-Komplexe.
• DNA-Methylierung: Untersuche die Methylierungsmuster der DNA mittels Bisulfit-Sequenzierung oder methylierungs-spezifischer PCR (MSP) an den Promotor- und Enhancer-Regionen.
• Histon-Modifikationen: Verwende ChIP-seq mit Antikörpern gegen spezifische Histonmodifikationen, um zu analysieren, welche Modifikationen im Bereich des Promotors und der Enhancer vorliegen.
• 3C-Techniken: Verwende Chromosome Conformation Capture (3C), 4C oder Hi-C, um physische Interaktionen zwischen Promotor und Enhancer zu untersuchen und festzustellen, ob eine Schleifenbildung der DNA stattfindet.
• Reporter-Assays: Klone den Promotor des Gens in einen Reportervektor (z. B. Luciferase-Reporter) und transfiziere die Zellen. Mutationen oder Deletionen in potentiellen regulatorischen Elementen (z. B. Enhancer oder repressive Elemente) können dann systematisch analysiert werden.
• CRISPR/Cas9-Editing: Setze CRISPR/Cas9 ein, um spezifische Transkriptionsfaktoren oder Chromatin-modifizierende Enzyme zu deaktivieren oder zu aktivieren. Beobachte die Auswirkungen dieser Änderungen auf die Genexpression.

Aufgabe 2)

Epigenetische Modifikationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression, ohne dass die DNA-Sequenz selbst verändert wird. Diese Modifikationen beinhalten chemische Veränderungen der DNA oder der Histone, wie DNA-Methylierung und verschiedene Histonmodifikationen (Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung). Sie regulieren die Chromatinstruktur und die Zugänglichkeit der Gene. Bemerkenswerterweise sind diese Modifikationen reversibel und können vererbt werden. Sie sind wesentlich an der Zell-Differenzierung und der Genomstabilität beteiligt.

a)

Erkläre, wie DNA-Methylierung die Genexpression beeinflussen kann. Diskutiere dabei den Prozess, die Enzyme, die daran beteiligt sind, und den biologischen Ausgang dieser Modifikation.

Lösung:

DNA-Methylierung ist eine Form der epigenetischen Modifikation, bei der eine Methylgruppe (\texttt{-CH3}) an die DNA, speziell an das Cytosin in einem CpG-Dinukleotid, angehängt wird. Diese Modifikation kann die Genexpression erheblich beeinflussen.

• Prozess der DNA-Methylierung:Bei der DNA-Methylierung wird eine Methylgruppe an das fünfte Kohlenstoffatom des Cytosinrings in CpG-Dinukleotiden angehängt, wodurch 5-Methylcytosin entsteht. Dieser Prozess wird von DNA-Methyltransferasen (DNMTs) katalysiert, die die Methylgruppe von S-Adenosylmethionin (SAM) auf das Cytosin übertragen.
• Beteiligte Enzyme:
  • DNMT1: Dieses Enzym ist für die Aufrechterhaltung der Methylierungsmuster während der DNA-Replikation verantwortlich. DNMT1 erkennt hemimethylierte DNA und methyliert den neu synthetisierten Strang.
  • DNMT3A und DNMT3B: Diese Enzyme sind für die „de novo“-Methylierung verantwortlich, das heißt, sie etablieren neue Methylierungsmuster in der DNA.
  • DNMT3L: Dieses Protein ist ein Ko-Faktor für DNMT3A und DNMT3B und reguliert deren Aktivität und Spezifität.
• Biologischer Ausgang:DNA-Methylierung führt oft zur Unterdrückung der Genexpression. Dies kann durch mehrere Mechanismen geschehen:
  • Direkte Behinderung: Die Methylgruppen können die Bindung von Transkriptionsfaktoren an die DNA erschweren, was die Transkription verhindert.
  • Rekrutierung von Bindungsproteinen: Methylierte CpGs können Proteine wie Methyl-CpG-bindende Domänenproteine (MBDs) rekrutieren, die weitere Chromatin-verdichtende Faktoren anziehen und somit die Transkription aktiv hemmen.
  • Wechselwirkungen mit Histonmodifikationen: DNA-Methylierung kann mit anderen epigenetischen Modifikationen wie Histonmethylierung und -deacetylierung interagieren, was zur Etablierung einer repressiven Chromatinstruktur führt.
  Diese Methylierungsmuster sind entscheidend für die Zell-Differenzierung und Genomstabilität. Abnormale DNA-Methylierungsmuster können zu Krankheiten wie Krebs führen, wobei sowohl Hyper- als auch Hypomethylierung beobachtet werden können.

b)

Beschreibe drei verschiedene Arten von Histonmodifikationen und erläutere, wie jede dieser Modifikationen die Chromatinstruktur und dadurch die Genexpression beeinflusst.

Lösung:

Histonmodifikationen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Genexpression durch die Veränderung der Chromatinstruktur. Hier sind drei verschiedene Arten von Histonmodifikationen und deren Einfluss auf die Chromatinstruktur und die Genexpression:

• Histonacetylierung:Bei der Histonacetylierung werden Acetylgruppen (-COCH₃) an die Lysinreste der Histonproteine angehängt. Dieser Prozess wird von Enzymen namens Histon-Acetyltransferasen (HATs) katalysiert.
  • Einfluss auf die Chromatinstruktur: Die Acetylierung neutralisiert die positive Ladung der Lysinreste, was die elektrostatische Wechselwirkung zwischen den Histonen und der negativ geladenen DNA verringert. Dies führt zur Öffnung der Chromatinstruktur, bekannt als Euchromatin.
  • Einfluss auf die Genexpression: Die offene Struktur des Euchromatins erleichtert den Zugang der Transkriptionsmaschinerie zur DNA, was in der Regel zu einer erhöhten Genexpression führt.
• Histonmethylierung:Histonmethylierung bezieht sich auf die Addition von Methylgruppen an Lysin- oder Argininreste der Histone. Diese Modifikation wird von Histon-Methyltransferasen (HMTs) ausgeführt.
  • Einfluss auf die Chromatinstruktur: Die Auswirkungen der Histonmethylierung auf die Chromatinstruktur hängen von der spezifischen Stelle und Anzahl der Methylgruppen ab. Zum Beispiel kann die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 4 (H3K4me3) eine aktivierende Wirkung haben, während die Trimethylierung an Lysin 27 (H3K27me3) repressiv wirkt.
  • Einfluss auf die Genexpression: H3K4me3 ist oft mit aktiven Genen assoziiert, da es die Chromatinstruktur öffnet und die Bindung von Transkriptionsfaktoren erleichtert. Im Gegensatz dazu ist H3K27me3 mit einer geschlossenen Chromatinstruktur, bekannt als Heterochromatin, und somit mit der Genstilllegung verbunden.
• Histonphosphorylierung:Bei der Histonphosphorylierung werden Phosphatgruppen an Serin-, Threonin- oder Tyrosinreste der Histone angehängt. Diese Modifikation wird von Kinasen katalysiert und kann durch Phosphatasen entfernt werden.
  • Einfluss auf die Chromatinstruktur: Die Phosphorylierung führt zu einer negativen Ladungsänderung der Histonproteine, was die Interaktionen zwischen Histonen und DNA sowie anderen Histonmodifikationen beeinflussen kann. Diese Modifikation ist häufig mit Chromatin-Remodeling während der Mitose und der DNA-Schadensantwort assoziiert.
  • Einfluss auf die Genexpression: Die Phosphorylierung von Histon H3 an Serin 10 (H3S10ph) ist oft mit der Genaktivierung während der Mitose verbunden. Sie kann die DNA zugänglicher für Transkriptionsfaktoren machen und somit die Genexpression erhöhen.

c)

Betrachte eine Hypothese, laut der epigenetische Modifikationen zu einer Erhöhung der Genomstabilität beitragen. Welche experimentellen Ansätze würdest Du vorschlagen, um diese Hypothese zu testen, und welche Ergebnisse würdest Du erwarten, um die Hypothese zu stützen oder zu widerlegen?

Lösung:

Um die Hypothese zu testen, dass epigenetische Modifikationen zur Erhöhung der Genomstabilität beitragen, können verschiedene experimentelle Ansätze verwendet werden. Hier sind einige Ansätze, die Du in Betracht ziehen kannst:

• Experiment 1: Inhibition von epigenetischen Modifikationen
  • Ansatz: Verwende spezifische Inhibitoren, um DNMTs (DNA-Methyltransferasen) und/oder HDACs (Histon-Deacetylasen) in Zellkulturen zu hemmen. Die Zellen werden dann in Bezug auf ihre Genomstabilität untersucht.
  • Erwartete Ergebnisse: Wenn epigenetische Modifikationen zur Genomstabilität beitragen, sollten Zellen, die mit Inhibitoren behandelt wurden, eine erhöhte Rate an DNA-Schäden, Chromosomenbrüchen und genomischen Abnormalitäten aufweisen.
• Experiment 2: CRISPR-Cas9 Mediated Knockout von epigenetischen Regulatoren
  • Ansatz: Nutze CRISPR-Cas9-Technologie, um Gene, die für DNMTs (z.B. DNMT1) und HATs (z.B. p300) kodieren, in Zelllinien gezielt auszuschalten. Die genomische Integrität dieser Knockout-Zellen wird dann durch verschiedene Assays (z.B. Comet-Assay, karyotypische Analyse) bewertet.
  • Erwartete Ergebnisse: Bei einem Verlust von DNMTs oder HATs sollte eine Zunahme von Chromosomeninstabilitäten und DNA-Schäden zu beobachten sein, falls diese epigenetischen Modifikationen zur Genomstabilität beitragen.
• Experiment 3: Vergleich der Genomstabilität in Zellen mit unterschiedlichen Methylierungsmustern
  • Ansatz: Vergleich von Zelllinien mit hoher und niedriger DNA-Methylierung unter Nutzung von Knockdown-Strategien oder chemischen Behandlung zur Beeinflussung der DNA-Methylierung. Anschließend wird die Genomstabilität mit Hilfe von DNA-Schadensmarkern (z.B. γ-H2AX) und weiteren genomischen Analysen untersucht.
  • Erwartete Ergebnisse: Zellen mit reduzierter DNA-Methylierung könnten eine größere Neigung zu DNA-Schäden und genomischer Instabilität zeigen.
• Experiment 4: Tiermodell-Studien
  • Ansatz: Erstelle transgene Mausmodelle, die bestimmte DNMTs oder HATs mutieren oder ausschalten. Überprüfe die langfristigen Effekte auf die Genomstabilität durch Verwendung von Tumorinzidenz-Studien, karyotypischen Analysen und Untersuchung von DNA-Schadensreaktionen in verschiedenen Geweben.
  • Erwartete Ergebnisse: Mäuse mit Mutationen oder Knockouts in epigenetischen Enzymen sollten eine erhöhte Prädisposition für Tumore und genomische Instabilitäten aufweisen, was die Hypothese stützen würde.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erwarteten Ergebnisse eine erhöhte Genomstabilität in Gegenwart funktionsfähiger epigenetischer Modifikationen und eine verminderte Stabilität bei Funktionsverlust zeigen sollten, wenn die Hypothese korrekt ist. Diese experimentellen Ansätze bieten verschiedene Möglichkeiten, die Rolle epigenetischer Modifikationen bei der Genomstabilität zu untersuchen und die Hypothese zu testen.

Aufgabe 3)

Der Notch-Signalweg ist ein entscheidender Mechanismus in der Entwicklungsbiologie und reguliert die Zellkommunikation sowie Zellschicksalsentscheidungen. Der Signalweg beginnt mit der Bindung von Delta/Serrate/Jagged-Liganden an den Notch-Rezeptor, was eine Rezeptorspaltung auslöst. Dieser Prozess führt zur Freisetzung der Notch intracellular domain (NICD), die in den Kern wandert und dort mit dem CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex (CBF1/Su(H)/Lag-1) interagiert. Dies führt zur Aktivierung der Zielgenexpression, wie zum Beispiel der Hes- und Hey-Gene. Der Notch-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Neurogenese, Angiogenese und Zellproliferation. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs kann zu Krankheiten wie Krebs führen.

a)

1. Analysiere die Rolle des NICD im Notch-Signalweg im Detail:

• Erkläre die molekulare Mechanik der Freisetzung des NICD und seinen Transport in den Zellkern.
• Diskutiere, wie die Interaktion des NICD mit dem CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex zur Genexpression führt. Fokussiere Dich insbesondere auf die Schritte, die zur Aktivierung der Hes- und Hey-Gene führen.

Lösung:

Der Notch-Signalweg ist ein entscheidender Mechanismus in der Entwicklungsbiologie und reguliert die Zellkommunikation sowie Zellschicksalsentscheidungen. Der Signalweg beginnt mit der Bindung von Delta/Serrate/Jagged-Liganden an den Notch-Rezeptor, was eine Rezeptorspaltung auslöst. Dieser Prozess führt zur Freisetzung der Notch intracellular domain (NICD), die in den Kern wandert und dort mit dem CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex (CBF1/Su(H)/Lag-1) interagiert. Dies führt zur Aktivierung der Zielgenexpression, wie zum Beispiel der Hes- und Hey-Gene. Der Notch-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Neurogenese, Angiogenese und Zellproliferation. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs kann zu Krankheiten wie Krebs führen.

1. Analysiere die Rolle des NICD im Notch-Signalweg im Detail:

• Erkläre die molekulare Mechanik der Freisetzung des NICD und seinen Transport in den Zellkern.Die Freisetzung des NICD erfolgt in mehreren Schritten:
• Bindung der Liganden: Die Bindung von Delta/Serrate/Jagged-Liganden an den Notch-Rezeptor auf der Zelloberfläche führt zu einer Konformationsänderung des Rezeptors.
• Proteolytische Spaltung: Diese Konformationsänderung ermöglicht die proteolytische Spaltung des Notch-Rezeptors durch das Enzym ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) und später durch das Gamma-Sekretase-Komplex. Dieser Spaltungsprozess setzt die NICD frei.
• Transport in den Zellkern: Nach der Freisetzung wird die NICD durch das Zytoplasma transportiert und tritt in den Zellkern ein. Dies geschieht durch nucleäre Lokalisationssignale (NLS) in der NICD, die von Importinen (Kerntransportproteinen) erkannt werden.
• Diskutiere, wie die Interaktion des NICD mit dem CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex zur Genexpression führt. Fokussiere Dich insbesondere auf die Schritte, die zur Aktivierung der Hes- und Hey-Gene führen.
• CSL-Bindung: Im Zellkern bindet die NICD an den CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex (CBF1/Su(H)/Lag-1), der normalerweise als Repressor fungiert und die Transkription seiner Zielgene verhindert.
• Komplex-Bildung: Die Bindung der NICD führt zu einer Konformationsänderung des CSL-Komplexes, was die Rekrutierung von Koaktivatoren wie Mastermind-like (MAML) ermöglicht.
• Aktivierung der Transkription: Der NICD-CSL-MAML-Komplex rekrutiert dann zusätzliche Transkriptionsfaktoren und Chromatin-Remodellierungsfaktoren, die zur Aktivierung der Transkription beitragen.
• Zielgenexpression: Schließlich wird die Transkription der Zielgene wie Hes- und Hey-Gene aktiviert. Die Hes- und Hey-Gene kodieren für bHLH (basic Helix-Loop-Helix)-Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Zelldifferenzierung und -proliferation spielen.

b)

2. Betrachte eine hypoaktive Mutation im Notch-Rezeptor, die seine Spaltung verhindert:

• Beschreibe die möglichen Auswirkungen dieser Mutation auf die Neurogenese und Angiogenese. Wie wirkt sich dies auf die Zellproliferation aus?
• Berechne die erwartete Veränderung der Genexpression von Zielgenen wie Hes und Hey, wenn die Notch-Signalisierung um 70% reduziert ist. Gehe davon aus, dass die Genexpression von der Konzentration des aktivierten NICD linear abhängt und die Ausgangsaktivität bei 100% angibt.

Lösung:

Der Notch-Signalweg ist ein entscheidender Mechanismus in der Entwicklungsbiologie und reguliert die Zellkommunikation sowie Zellschicksalsentscheidungen. Der Signalweg beginnt mit der Bindung von Delta/Serrate/Jagged-Liganden an den Notch-Rezeptor, was eine Rezeptorspaltung auslöst. Dieser Prozess führt zur Freisetzung der Notch intracellular domain (NICD), die in den Kern wandert und dort mit dem CSL-Transkriptionsfaktor-Komplex (CBF1/Su(H)/Lag-1) interagiert. Dies führt zur Aktivierung der Zielgenexpression, wie zum Beispiel der Hes- und Hey-Gene. Der Notch-Signalweg spielt eine entscheidende Rolle in der Neurogenese, Angiogenese und Zellproliferation. Eine Fehlregulation dieses Signalwegs kann zu Krankheiten wie Krebs führen.

2. Betrachte eine hypoaktive Mutation im Notch-Rezeptor, die seine Spaltung verhindert:

• Beschreibe die möglichen Auswirkungen dieser Mutation auf die Neurogenese und Angiogenese. Wie wirkt sich dies auf die Zellproliferation aus?
• Neurogenese: Eine hypoaktive Mutation im Notch-Rezeptor, die seine Spaltung verhindert, würde zu einer verminderten Freisetzung der NICD führen. Dies könnte zu einer reduzierten Hemmung der neuronalen Differenzierung führen. Normalerweise sorgt der Notch-Signalweg dafür, dass nicht zu viele neuronale Vorläuferzellen zu Neuronen differenzieren. Eine verminderte Notch-Aktivität könnte daher zu einer Überproduktion von Neuronen auf Kosten anderer Zelltypen im Gehirn führen.
• Angiogenese: Auch die Angiogenese könnte beeinträchtigt werden. Der Notch-Signalweg ist wichtig für die Regulierung der Bildung und Verzweigung von Blutgefäßen. Eine verringerte Notch-Signalisierung könnte zu unzureichender Blutgefäßbildung und strukturellen Anomalien in den bestehenden Gefäßen führen, was wiederum die Versorgung von Geweben mit Sauerstoff und Nährstoffen beeinträchtigen könnte.
• Zellproliferation: Die Zellproliferation könnte ebenfalls negativ beeinflusst werden, da der Notch-Signalweg eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus spielt. Eine verminderte Notch-Signalisierung könnte zu einer unkontrollierten Zellproliferation oder zu einem Mangel an Zellteilung führen, abhängig vom Zelltyp und Kontext. Dies könnte eine Dysregulation von Gewebshomöostase und Potenzial für die Entstehung von Tumoren nach sich ziehen.
• Berechne die erwartete Veränderung der Genexpression von Zielgenen wie Hes und Hey, wenn die Notch-Signalisierung um 70% reduziert ist. Gehe davon aus, dass die Genexpression von der Konzentration des aktivierten NICD linear abhängt und die Ausgangsaktivität bei 100% angibt.
• Gegeben, dass die Ausgangsaktivität der Genexpression von Hes und Hey bei 100% liegt, bedeutet eine Reduktion der Notch-Signalisierung um 70%, dass nur 30% der ursprünglichen Aktivierung erhalten bleibt.
• Wenn die Genexpression linear von der Konzentration des NICD abhängt, dann würde eine 70%ige Reduktion der Notch-Signalisierung zu einer proportionellen Reduktion der Genexpression führen.
• Berechnung:
• Ursprüngliche Genexpression = 100%
• Reduktion = 70%
• Verbleibende Genexpression = 100% - 70% = 30%
• Daher würde die Genexpression der Zielgene Hes und Hey auf 30% der Ausgangsaktivität reduziert werden.

Aufgabe 4)

Wnt-SignalwegDer Wnt-Signalweg ist ein Signaltransduktionsweg, der Zellwachstum, Zellteilung und Zellmigration reguliert.

• Wichtig für Embryonalentwicklung und Krebs.
• Wnt-Proteine binden an Frizzled-Rezeptoren.
• Aktivierung führt zur Stabilisierung von β-Catenin.
• β-Catenin transloziert in den Zellkern und aktiviert Zielgene.
• Kann klassisch (Kanoinisch) oder nicht-kanonisch sein.
• Kanonischer Weg: Beteiligt an Genregulation durch β-Catenin.
• Nicht-kanonischer Weg: Funktioniert unabhängig von β-Catenin.

a)

Erläutere den Unterschied zwischen dem kanonischen und dem nicht-kanonischen Wnt-Signalweg und erkläre, wie die Stabilisierung von β-Catenin im kanonischen Wnt-Signalweg zustande kommt. Welche Rolle spielt GSK-3β dabei?

Lösung:

Unterschied zwischen dem kanonischen und dem nicht-kanonischen Wnt-Signalweg

• Kanonischer Wnt-Signalweg: Dieser Weg ist hauptsächlich mit der Genregulation durch β-Catenin verbunden. Hierbei kommt es zur Stabilisierung und Akkumulation von β-Catenin im Cytoplasma, welches anschließend in den Zellkern transloziert und Zielgene aktiviert.
• Nicht-kanonischer Wnt-Signalweg: Dieser funktioniert unabhängig von β-Catenin und ist eher mit Zellbewegung und -morphogenese verbunden. Der nicht-kanonische Weg nutzt alternative Signaltransduktionspfade, die nicht die Stabilisierung von β-Catenin beinhalten.

Stabilisierung von β-Catenin im kanonischen Wnt-Signalweg:Unter normalen Bedingungen, wenn kein Wnt-Signal vorhanden ist, wird β-Catenin stetig abgebaut. Dies geschieht durch einen Zerstörungskomplex, der u.a. GSK-3β, AXIN, APC (Adenomatous Polyposis Coli) und CK1 (Casein Kinase 1) enthält.

• GSK-3β (Glycogen-Synthase-Kinase 3 Beta) phosphoryliert β-Catenin, was zur Erkennung und Ubiquitinierung von β-Catenin führt und es schließlich für den proteasomalen Abbau markiert.
• Wenn Wnt-Proteine an die Frizzled-Rezeptoren und Co-Rezeptoren (LRP5/6) binden, wird der Zerstörungskomplex inaktiviert.
• Dies führt zur Stabilisierung und Akkumulation von β-Catenin im Cytoplasma.

Anschließend transloziert das stabilisierte β-Catenin in den Zellkern, wo es an TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren bindet und die Transkription von Zielgenen aktiviert.

b)

Berechne, unter der Annahme, dass all Deine Zellen die gleiche Konzentration von β-Catenin aufweisen, die Stabilitätskonstante \(K_s\) von β-Catenin in einem Zellmodell mit folgendem Ansatz: Besitzt eine Zelle bei Equilibrium ohne Wnt-Signale \(C_0 = 15 \mu M\) von destabilisiertem β-Catenin und mit Wnt-Signalen eine 25% höhere Konzentration insgesamt, wird \(K_s = \frac{C_{gesamt} - C_0}{C_0}\). Was sagt Dir dieser Wert über die Aktivierung des Signals in der Zelle aus?

Lösung:

Berechnung der Stabilitätskonstante (K_s) von β-CateninUnter den gegebenen Annahmen:

• Die Konzentration von β-Catenin ohne Wnt-Signale: C₀ = 15 μM
• Die Konzentration von β-Catenin steigt bei Vorhandensein von Wnt-Signalen um 25%: C_gesamt = C₀ + 0.25C₀

Berechnung der Gesamt-Konzentration (C_gesamt)C_gesamt = 15 μM + 0.25 × 15 μM = 15 μM + 3.75 μM = 18.75 μMBerechnung der Stabilitätskonstante (K_s)Der Ansatz für die Berechnung der Stabilitätskonstante ist:K_s = \(\frac{C_{gesamt} - C_0}{C_0}\)Setzen wir die Werte ein:K_s = \(\frac{18.75 \text{ μM} - 15 \text{ μM}}{15 \text{ μM}}\) = \(\frac{3.75 \text{ μM}}{15 \text{ μM}}\) = 0.25Interpretation des Wertes von K_sEin K_s-Wert von 0.25 zeigt, dass die Stabilität von β-Catenin in Anwesenheit des Wnt-Signals um 25% erhöht ist. Dies bedeutet, dass das Wnt-Signal eine signifikante Aktivierung des Wnt-Signalwegs in der Zelle bewirkt. Die Stabilisierung und Akkumulation von β-Catenin führt dazu, dass β-Catenin in den Zellkern transloziert, wo es Zielgene aktivieren kann. Dies trägt zu den physiologischen Effekten des Wnt-Signalwegs bei, wie zum Beispiel Zellwachstum, Zellteilung und Zellmigration.