Fachmodul Genetik I - Exam

Aufgabe 1)

Du hast die Aufgabe, ein Zielgen in ein Expressionsplasmid zu klonieren. Deine Aufgabe beginnt mit der Isolierung des Genfragments und endet mit der funktionellen Analyse des exprimierten Gens. Verwende die folgenden Schritte, um den Klonierungsprozess zu beschreiben und durchzuführen: Bestimmung der Ziel-DNA durch PCR oder Restriktionsenzyme, Aufreinigung der Genfragmente durch Gelelektrophorese, Verwendung von Vektoren (Plasmide) für die Klonierung, Einfügen der Ziel-DNA in das Plasmid mittels Ligase, Transformation in Bakterien zur Vervielfältigung des Plasmids, Selektion transformierter Bakterien durch Antibiotikaresistenz, Expression des eingebauten Gens für funktionelle Analysen.

a)

Beschreibe den Ablauf der Bestimmung der Ziel-DNA, einschließlich der Auswahl von Primern für die PCR und der Verwendung von Restriktionsenzymen. Erkläre die Anforderungen an die Primersequenzen und die spezifische Rolle der Restriktionsenzyme in diesem Prozess.

Lösung:

Bestimmung der Ziel-DNA

• Auswahl von Primern für die PCR:
  • Primer sind kurze DNA-Sequenzen, die spezifisch an die Regionen binden, die amplifiziert werden sollen.
  • Die Primersequenzen sollten eine Länge von etwa 18-25 Basenpaaren haben.
  • Die Schmelztemperatur (Tm) der Primer sollte zwischen 55°C und 65°C liegen und möglichst nahe beieinander sein.
  • Es sollte vermieden werden, dass Primer Haarnadelschlaufen oder Primer-Dimere bilden.
  • Die Sequenz sollte möglichst spezifisch für die Ziel-DNA sein, um ungewollte Bindungen an andere Regionen zu vermeiden.
• Durchführung der PCR:
  • Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) amplifiziert das Zielgen.
  • Die Reaktion umfasst mehrere Schritte: Denaturierung der DNA bei 94-98°C, Anlagerung der Primer (annealing) bei 55-65°C und Elongation durch die Taq-Polymerase bei 72°C.
  • Dieser Zyklus wird typischerweise 25-35 mal wiederholt, um eine ausreichende Menge an Ziel-DNA zu erhalten.
• Verwendung von Restriktionsenzymen:
  • Restriktionsenzyme sind Proteine, die die DNA an spezifischen Basensequenzen schneiden.
  • Diese Enzyme sind essentiell, um sowohl die Ziel-DNA als auch das Plasmid an definierten Positionen zu zerschneiden und kompatible Enden zu erzeugen.
  • Die Restriktionsschnittstellen sollten in den Primern angefügt sein, um sicherzustellen, dass das Zielgen nach der Amplifikation mit den gleichen Enzymen geschnitten werden kann.
  • Durch den Einsatz von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen an den Enden des Gens und des Plasmids kann die gerichtete Klonierung gewährleistet werden, wodurch eine Verhinderung der Self-Ligation (Selbstverknüpfung) möglich wird.

b)

Nach der erfolgreichen PCR ist eine Aufreinigung des PCR-Produkts erforderlich. Erkläre den Zweck der Gelreinigung und beschreibe den Prozess der Gelelektrophorese zur Isolierung des Zielgenfragments. Warum ist dieser Schritt unerlässlich für die Klonierung?

Lösung:

Aufreinigung des PCR-Produkts durch Gelelektrophorese

• Zweck der Gelreinigung:
  • Die Gelreinigung ist notwendig, um das spezifische PCR-Produkt von unspezifischen Amplifikationsprodukten, Primern, Nukleotiden und Enzymen zu trennen.
  • Dieser Schritt gewährleistet, dass nur das gewünschte Zielgenfragment in das Plasmid kloniert wird.
  • Durch die Reinigung wird die Qualität und Effizienz der nachfolgenden Klonierung erhöht.
• Prozess der Gelelektrophorese:
  • Das PCR-Produkt wird zunächst auf ein Agarosegel aufgetragen.
  • Ein elektrisches Feld wird angelegt, wodurch die DNA-Fragmente durch das Gel wandern. Kleinere Fragmente bewegen sich schneller als größere.
  • Ein DNA-Marker (Ladder) wird mit aufgetragen, um die Größe der DNA-Fragmente zu bestimmen.
  • Nach ausreichender Laufzeit wird das Gel unter UV-Licht betrachtet, um die Banden darzustellen.
  • Die spezifische Bande, die dem Zielgen entspricht, wird ausgeschnitten.
  • Das ausgeschnittene Fragment wird durch Elution aus dem Gel extrahiert und in eine saubere Lösung zum weiteren Gebrauch überführt.
• Notwendigkeit dieses Schrittes für die Klonierung:
  • Die Gelreinigung eliminiert Kontaminationsquellen, die die Effizienz und Genauigkeit der Ligationsreaktion beeinträchtigen könnten.
  • Ohne diese Reinigung könnten unspezifische Produkte in das Plasmid eingefügt werden, was die Resultate der Klonierung verfälschen würde.
  • Dieser Schritt stellt sicher, dass nur das korrekte Ziel-DNA-Fragment in das Expressionsplasmid eingefügt wird, was für die nachfolgende funktionelle Analyse des Gens entscheidend ist.

c)

Nach der Reinigung muss das Genfragment in einen Vektor (Plasmid) kloniert werden. Beschreibe den Prozess des Einfügens des Genfragments in das Plasmid unter Verwendung einer Ligase. Welche Schritte sind erforderlich, um sicherzustellen, dass das Gen korrekt in den Vektor integriert wird?

Lösung:

Einfügen des Genfragments in das Plasmid mittels Ligase

• Vorbereitung des Vektors und Genfragments:
  • Das gereinigte Genfragment und das Plasmid müssen beide mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten werden, um kompatible Enden zu erzeugen.
  • Das Plasmid enthält in der Regel mehrere Restriktionsschnittstellen innerhalb eines Multi-Cloning-Sites (MCS), um Flexibilität bei der Auswahl der Restriktionsenzyme zu bieten.
  • Nach dem Schneiden werden die Fragmente aufgereinigt, um überschüssige Enzyme und Puffer zu entfernen.
• Ligation durch DNA-Ligase:
  • Die gereinigten DNA-Stücke (Genfragment und Plasmid) werden in einem Reaktionsmix zusammengeführt.
  • Eine DNA-Ligase, wie T4-DNA-Ligase, wird zu der Mischung hinzugefügt, um die Verknüpfung der DNA-Stücke zu katalysieren.
  • Die Ligationsreaktion erfolgt typischerweise bei 16°C über Nacht, um optimale Bedingungen für die Bindung zu bieten.
  • Die Ligase verknüpft die 3'-Hydroxygruppe eines DNA-Stranges mit der 5'-Phosphatgruppe des anderen, wodurch ein vollständiger doppelsträngiger DNA-Molekül entsteht.
• Sicherstellung der korrekten Integration:
  • Kontrollverdau: Nach der Ligation können geringe Mengen des Ligationprodukts erneut mit den gleichen Restriktionsenzymen verdaut werden. Wird das Genfragment korrekt integriert, resultiert der Verdau in Fragmenten definierter Größen.
  • PCR-Kontrolle: Mit spezifischen Primern, die innerhalb des Inserts und des Plasmides binden, kann eine PCR durchführt werden, um die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen.
  • Sequenzierung: Um sicherzugehen, dass keine Mutationen während des Prozesses eingeführt wurden, können die Grenzen (und gegebenenfalls das gesamte Insert) sequenziert werden.

d)

Nachdem das rekombinante Plasmid erstellt wurde, beschreibe die Schritte der Transformation von Bakterien und die Selektion der transformierten Bakterien. Wie überprüfst Du, ob das Plasmid korrekt in den Bakterien vorliegt? Beziehe in Deine Antwort die Nutzung von Antibiotikaresistenz und mögliche Screening-Methoden ein.

Lösung:

Transformation von Bakterien und Selektion der transformierten Bakterien

• Transformation von Bakterien:
  • Wähle eine kompetente Bakterienkultur aus (zum Beispiel E. coli), die zur Aufnahme von Plasmid-DNA fähig ist.
  • Füge das rekonstruierte Plasmid in die Kompetenz-Zellsuspension hinzu und mische vorsichtig.
  • Die Bakterien werden kurz auf Eis inkubiert (ca. 30 Minuten), um die Aufnahme des Plasmids zu erleichtern.
  • Anschließend kannst Du einen Hitzeschock durchführen (ca. 42°C für 30-60 Sekunden), um die Aufnahme des Plasmids weiter zu fördern.
  • Die Bakterien werden danach erneut auf Eis gekühlt und anschließend in einem geeigneten Medium (z. B. LB-Bouillon ohne Antibiotikum) rekonstituiert und etwa eine Stunde bei 37°C inkubiert, um ihnen Zeit zur Erholung und Expression der aufgenommenen DNA zu geben.
• Selektion transformierter Bakterien:
  • Die Bakterienkultur wird auf Agarplatten mit dem entsprechenden Antibiotikum (z.B. Ampicillin) ausgestrichen.
  • Nur die Bakterien, die das Plasmid mit dem Antibiotikaresistenzgen aufgenommen haben, werden in der Lage sein, auf diesen Platten zu wachsen.
  • Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert, bis Kolonien sichtbar werden.
• Überprüfung des Plasmids in den Bakterien:
  • Kolonie-PCR: Isoliere einzelne Kolonien und führe eine PCR unter Verwendung von Primern durch, die spezifisch für das Zielgen und das Plasmid sind.
  • Plasmidisolierung und Restriktionsverdau: Isoliere Plasmid-DNA aus einer positiven Kolonie (Miniprep) und führe einen Restriktionsverdau durch, um die Anwesenheit und Korrektheit der Inserts zu überprüfen.
  • Sequenzierung: Sequenziere die Plasmid-DNA, um sicherzustellen, dass das Zielgen korrekt und ohne Mutationen im Plasmid integriert ist.
  • Blaue/weiße Selektion (wenn zutreffend): Wenn ein zusätzliches Selektionssystem wie das lacZ-Gen verwendet wurde, erscheinen Kolonien mit Plasmiden ohne Insert blau, während diejenigen mit Insert weiß bleiben.

Aufgabe 2)

Klonierung eines Expressionsplasmids: Transformation von Zellen mit rekombinanten Plasmiden ist ein fundamentaler Schritt in der Molekularbiologie, um die Expression spezifischer Gene in Wirtszellen zu studieren. Betrachten wir ein Expressionsplasmid, das aus einem Promotor und einem Zielgen besteht. Die Transformation selbst kann entweder durch chemische Transformation mit CaCl₂ oder durch Elektroporation durchgeführt werden. Zum Zweck der Selektion enthalten die Expressionsplasmide häufig Antibiotika-Resistenzgene, sodass nur diejenigen Zellen, die erfolgreich transformiert wurden, auf Selektivmedien überleben. Einmal in der Wirtszelle, kann das Plasmid repliziert werden und das Zielgen exprimiert werden.

a)

Beschreibe den grundlegenden Prozess der chemischen Transformation unter der Verwendung von CaCl₂ und skizziere die Rolle des Calciumchlorids in diesem Prozess. Gehe insbesondere auf die Strukturveränderungen der Zellmembran ein und wie diese die Aufnahme der Plasmid-DNA beeinflussen.

• Bonusfrage: Welche Vor- und Nachteile hat die chemische Transformation im Vergleich zur Elektroporation?

Lösung:

Die chemische Transformation mittels Calciumchlorid (CaCl₂) ist eine gängige Methode zur Einführung von Plasmid-DNA in Bakterienzellen. Der grundlegende Prozess kann in mehrere Schritte unterteilt werden:

• Vorbereitung der kompetenten Zellen: Bakterien werden in einem frühen log-phasigen Wachstumsstadium geerntet und in einer kalten Lösung aus CaCl₂ suspendiert. Diese Behandlung macht die Zellmembran durchlässiger für die Aufnahme von Plasmid-DNA.
• Mischung mit Plasmid-DNA: Die kompetenten Zellen werden mit der Plasmid-DNA gemischt und für eine kurze Zeit auf Eis inkubiert, um die DNA an die Zellmembran zu binden.
• Hitze-Schock: Die Mischung aus Zellen und Plasmid-DNA wird für eine kurze Zeit (oft 42°C für 30-60 Sekunden) erhitzt. Dieser Hitzeschock führt zu kurzen Strukturveränderungen in der Zellmembran, die es der Plasmid-DNA ermöglichen, in die Zellen einzudringen.
• Regeneration und Selektion: Nach dem Hitzeschock werden die Zellen in ein nährstoffreiches Medium überführt und für eine kurze Zeit inkubiert, um sich zu erholen und die aufgenommenen Plasmide zu replizieren. Anschließend werden die Zellen auf selektiven Medien (z.B. Medien mit Antibiotika) ausplattiert, um transformierte Zellen zu identifizieren.

Rolle des Calciumchlorids:

• Bindung von Plasmid-DNA an die Zellmembran: Calciumionen (Ca²⁺) spielen eine entscheidende Rolle bei der Bindung der negativ geladenen Plasmid-DNA an die auch negativ geladene Zellmembran, indem sie die negativen Ladungen neutralisieren und eine Annäherung der DNA an die Zelloberfläche ermöglichen.
• Erhöhung der Membranpermeabilität: Ca²⁺-Ionen stabilisieren zusätzlich die Zellmembran und reduzieren die Wahrscheinlichkeit, dass sie während des Hitzeschocks reißt, was es der Plasmid-DNA ermöglicht, durch die Membran in das Zellinnere zu gelangen.

Vor- und Nachteile der chemischen Transformation im Vergleich zur Elektroporation:

• Vorteile der chemischen Transformation:
  • Kostengünstig und einfach durchzuführen.
  • Benötigt keine spezielle Ausrüstung wie bei der Elektroporation.
• Nachteile der chemischen Transformation:
  • Weniger effizient in Bezug auf die Transformationseffizienz im Vergleich zur Elektroporation.
  • Manchmal schwieriger bei bestimmten Bakterienstämmen oder Eukaryoten anwendbar.
• Vorteile der Elektroporation:
  • Höhere Transformationseffizienz.
  • Kann bei einer breiteren Palette von Organismen und Zelltypen angewendet werden.
• Nachteile der Elektroporation:
  • Kostenintensive Ausrüstung erforderlich.
  • Erhöhter Aufwand in der Protokolloptimierung und Handhabung.

b)

Angenommen, du hast ein Expressionsplasmid mit einem Ampicillin-Resistenzgen und willst die Effizienz der Transformation überprüfen. Du transformierst 100 µl von kompetenten E. coli-Zellen mit dem Plasmid und plattierst sie auf LB-Agar-Platten, die 100 µg/ml Ampicillin enthalten. Nach der Inkubation über Nacht zählst du 250 Kolonien. Berechne die Transformations-Effizienz in Kolonien pro Mikrogramm Plasmid-DNA unter der Annahme, dass du 10 ng Plasmid-DNA verwendet hast.

• Stelle die Berechnung im Detail dar.

Lösung:

Um die Effizienz der Transformation zu berechnen, müssen wir die Anzahl der Kolonien pro Mikrogramm (µg) Plasmid-DNA bestimmen. Hier sind die detaillierten Schritte zur Berechnung:

• Gegebene Daten:
  • Anzahl der Kolonien: 250
  • Verwendetes Plasmid-DNA: 10 ng (Nanogramm)
  • 1 µg (Mikrogramm) = 1000 ng

Transformationseffizienz (TE) wird definiert als die Anzahl der Kolonien pro Mikrogramm (µg) Plasmid-DNA. Die Berechnung erfolgt in folgenden Schritten:

1. Konvertiere die Menge der verwendeten Plasmid-DNA von Nanogramm (ng) zu Mikrogramm (µg): \[\text{Menge der Plasmid-DNA} = 10 \text{ ng} = 10 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ µg}}{1000 \text{ ng}} = 0,01 \text{ µg}\]
2. Berechne die Transformationseffizienz (TE): \[\text{TE} = \frac{\text{Anzahl der Kolonien}}{\text{Menge der verwendeten Plasmid-DNA in Mikrogramm (µg)}}\]
3. Setze die gegebenen Werte in die Formel ein: \[\text{TE} = \frac{250 \text{ Kolonien}}{0,01 \text{ µg}} = 25,000 \text{ Kolonien/µg}\]

Die Transformationseffizienz beträgt somit 25.000 Kolonien pro Mikrogramm Plasmid-DNA.

Aufgabe 3)

Du hast in einem Experiment einen Luciferase Reporter-Assay verwendet, um die Transkriptionsaktivität verschiedener Promoter- und Enhancer-Sequenzen zu analysieren. Hierbei wurden die Promoter/Enhancer-Sequenzen vor das Luciferase-Gen kloniert und in Zellen transfiziert. Anschließend wurde die Luciferase-Aktivität durch die Messung der Lumineszenz nachgewiesen. Um die Aktivität der verschiedenen Selektionsequenzen zu vergleichen, wurden die Lumineszenzwerte gemessen und gegenübergestellt.

a)

Beschreibe den allgemeinen Ablauf eines Luciferase Reporter-Assays und erkläre, wie er zur Bestimmung der Transkriptionsaktivität von Promoter- und Enhancer-Sequenzen genutzt werden kann.

Lösung:

Allgemeiner Ablauf eines Luciferase Reporter-Assays

• Klonierung: Zunächst werden die zu untersuchenden Promoter- oder Enhancer-Sequenzen vor das Luciferase-Gen in einen Expressionsvektor kloniert.
• Transformation: Diese plasmidischen Vektoren werden anschließend in die zu untersuchenden Zellen transfiziert.
• Expression: In den transfizierten Zellen wird das Luciferase-Gen unter der Kontrolle der Promoter- oder Enhancer-Sequenzen transkribiert und in mRNA umgeschrieben. Die mRNA wird anschließend in Luciferase-Protein translatiert.
• Messung der Lumineszenz: Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden die Zellen mit einem Luciferase-Substrat (meistens Luciferin) behandelt. Die Luciferase katalysiert die Umwandlung des Substrats in ein lichtemittierendes Produkt.
• Detektion: Die ausgestrahlte Lumineszenz wird mit einem Luminometer gemessen.
• Datenanalyse: Die Lumineszenzwerte, die proportional zur Menge des produzierten Luciferase-Proteins sind, geben Aufschluss über die Aktivität der Promoter- oder Enhancer-Sequenzen.

Erklärung der Bestimmung der Transkriptionsaktivität

• Da die Expression der Luciferase direkt von der Aktivität des vorangeschalteten Promoters oder Enhancers abhängig ist, kann die gemessene Lumineszenz genutzt werden, um diese Aktivität zu quantifizieren.
• Durch den Vergleich der Lumineszenzwerte verschiedener getesteter Sequenzen kannst Du Rückschlüsse auf deren Transkriptionsaktivität ziehen. Höhere Lumineszenzwerte deuten auf eine höhere Aktivität der entsprechenden Promoter- oder Enhancer-Sequenz hin.
• Dieses System ermöglicht somit die Untersuchung, welche Sequenzen eine stärkere oder schwächere Transkriptionsaktivität in den Zellen auslösen.

b)

Angenommen, Du hast zwei verschiedene Promotersequenzen, P1 und P2, die Du in separaten Luciferase Assays getestet hast. Die Lumineszenzwerte für P1 und P2 betragen 1500 und 3000 Einheiten jeweils. Berechne das Verhältnis der Transkriptionsaktivität zwischen P2 und P1.

Lösung:

Berechnung des Verhältnisses der Transkriptionsaktivität zwischen P2 und P1

• Gegebene Daten:
  • Lumineszenzwert für P1 = 1500 Einheiten
  • Lumineszenzwert für P2 = 3000 Einheiten
• Um das Verhältnis der Transkriptionsaktivität zwischen P2 und P1 zu berechnen, kannst Du die folgenden Schritte durchführen:
• Berechnung:

Das Verhältnis der Transkriptionsaktivität (R) zwischen P2 und P1 ist definiert als:

Formel:

 R = \frac{{\text{{Lumineszenz für P2}}}}{{\text{{Lumineszenz für P1}}}} 

Einsetzen der gegebenen Werte:

 R = \frac{{3000}}{{1500}} 

Vereinfachung:

 R = 2 

Ergebnis

• Das Verhältnis der Transkriptionsaktivität zwischen P2 und P1 ist 2. Das bedeutet, dass die Transkriptionsaktivität von Promoter P2 doppelt so hoch ist wie die von Promoter P1.

c)

Diskutiere mögliche Ursachen für unterschiedliche Lumineszenzwerte zwischen verschiedenen Proben und wie Du experimentelle Artefakte ausschließen könntest, um valide Daten zu erhalten.

Lösung:

Mögliche Ursachen für unterschiedliche Lumineszenzwerte zwischen verschiedenen Proben

• Unterschiedliche Effizienz der Transfektion: Variationen in der Effizienz, mit der die Plasmide in die Zellen transfiziert werden, können zu unterschiedlichen Mengen an Luciferase-Expression führen.
• Zellgesundheit und -zyklus: Unterschiede in der Gesundheit oder dem Zellzyklusstadium der Zellen können die Transkriptions- und Translationsraten beeinflussen.
• Plasmid-Konzentration und Qualität: Unterschiedliche Konzentrationen oder Qualitäten der verwendeten Plasmid-DNA können die Expression des Luciferase-Gens beeinflussen.
• Variabilität in der Luciferase-Assay-Reaktion: Schwankungen bei der Zugabe des Substrats oder der Reaktionsbedingungen können die gemessene Lumineszenz beeinflussen.
• Promoter- und Enhancer-Sequenzen: Inherent unterschiedliche Aktivitäten der getesteten Promoter- und Enhancer-Sequenzen selbst.

Methoden zur Ausschließung experimenteller Artefakte und zur Gewährleistung valider Daten

• Replikate: Führe Experimente in mehreren biologischen und technischen Replikaten durch, um Variabilität zu minimieren und statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten.
• Kontrollen: Verwende geeignete Kontrollen, wie z.B. einen leeren Vektor (negativ Kontrolle) und einen Vektor mit einem bekannten, starken Promoter (positiv Kontrolle), um Grundlinienwerte zu etablieren.
• Normalisierung: Normalisiere die Lumineszenzwerte auf die Zellzahl oder auf die Aktivität eines zweiten, konstitutiv exprimierten Reporter-Gens (z.B. Renilla Luciferase), um Unterschiede in der Zellzahl oder der Transfektionseffizienz auszugleichen.
• Verwendung von Standardprotokollen: Nutze gut etablierte und standardisierte Protokolle für die Transfektion, Zellkultur und Luciferase-Assay-Durchführung, um die Konsistenz zwischen Experimenten zu gewährleisten.
• Plasmid-Quantifizierung und -Qualität: Bestimme die Konzentration und Qualität der Plasmide vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass vergleichbare Mengen und Qualität der DNA verwendet werden.
• Kontrolle der Zellkulturbedingungen: Stelle sicher, dass die Zellen unter gleichbleibenden und optimalen Bedingungen kultiviert werden, um Unterschiede in der Zellgesundheit und -dichte zu minimieren.

Aufgabe 4)

Transkriptionskontrolle ist ein vielseitiger Prozess, der sicherstellt, dass Gene je nach Bedarf und Umweltbedingungen verstärkt oder abgeschwächt exprimiert werden. Betrachte die Mechanismen, die Transkriptionsfaktoren, Enhancer, Silencer und epigenetische Modifikationen umfassen. Der lac-Operon dient als klassisches Beispiel für die Genregulation bei Prokaryoten über ein Operon.

a)

• Aufgabe: Erläutere das Prinzip des lac-Operons und beschreibe seine Rolle bei der Genregulation in Prokaryoten. Gehe dabei insbesondere auf die Funktion der regulatorischen Elemente (Promoter, Operator, repressor-Gen und lac-Gene) ein.

Lösung:

• Prinzip des lac-Operons: Das lac-Operon ist ein genetisches Regelsystem, das in Prokaryoten, insbesondere in Bakterien wie Escherichia coli, vorkommt. Es reguliert den Metabolismus von Laktose, d.h., es steuert die Produktion von Enzymen, die für den Abbau von Laktose in Glukose und Galaktose notwendig sind. Struktur des lac-Operons: Das lac-Operon besteht aus mehreren wichtigen Komponenten: • Promoter: Dies ist die DNA-Sequenz, an der die RNA-Polymerase bindet, um mit der Transkription der lac-Gene zu beginnen. • Operator: Dies ist die DNA-Sequenz, an der ein Repressorprotein (produziert vom Repressor-Gen) bindet. Wenn der Repressor an den Operator gebunden ist, wird die Transkription blockiert. • Repressor-Gen (lacI): Dieses Gen codiert für das Repressorprotein, das an den Operator binden kann. • lac-Gene: Diese Gene codieren für Proteine, die für den Laktoseabbau notwendig sind. Die wichtigsten sind:
  • LacZ: codiert für die Beta-Galaktosidase, ein Enzym, das Laktose in Glukose und Galaktose spaltet.
  • LacY: codiert für die Laktose-Permease, ein Transportprotein, das Laktose in die Zelle transportiert.
  • LacA: codiert für die Transacetylase, deren Funktion weniger gut verstanden ist, aber angenommen wird, dass sie eine Rolle im Laktosemetabolismus spielt.
  Funktion des lac-Operons: • Wenn keine Laktose vorhanden ist, bindet das Repressorprotein an den Operator und verhindert die Transkription der lac-Gene. • Wenn Laktose vorhanden ist, bindet ein Stoffwechselprodukt von Laktose, Allolaktose, an den Repressor. Dies verändert die Form des Repressors, wodurch er nicht mehr an den Operator binden kann. Dadurch wird die RNA-Polymerase nicht blockiert und die Transkription der lac-Gene kann stattfinden. • Wenn Glukose vorhanden ist, wird die Konzentration des zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) niedrig gehalten. Da cAMP zusammen mit dem CAP-Protein (Catabolite Activator Protein) die Bindung der RNA-Polymerase an den Promoter erleichtert, führt ein niedriger cAMP-Spiegel zu einer geringeren Transkription der lac-Gene, selbst wenn Laktose vorhanden ist. Dies ist als Katabolitrepression bekannt.

b)

• Aufgabe: Diskutiere, wie epigenetische Kontrolle die Genexpression in Eukaryoten beeinflusst. Betrachte die Rolle von DNA-Methylierung und Histon-Modifikation. Erkläre, wie diese Mechanismen zu dauerhaften Veränderungen in der Genexpression führen können, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

Lösung:

• Epigenetische Kontrolle der Genexpression in Eukaryoten: Epigenetische Kontrolle bezieht sich auf Änderungen in der Genexpression, die ohne Veränderung der DNA-Sequenz auftreten. Diese Veränderungen können durch verschiedene Mechanismen wie DNA-Methylierung und Histon-Modifikation vermittelt werden. Diese Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression und können zu dauerhaften, manchmal sogar vererbbaren, Veränderungen führen. 1. DNA-Methylierung: • Definition: DNA-Methylierung ist ein biochemischer Prozess, bei dem eine Methylgruppe (\text{-CH_3}) an ein Cytosin-Nucleotid in der DNA angehängt wird, typischerweise an CpG-Dinukleotiden (Cytosin-Guanin-Sequenzen). • Funktion: Methylierte DNA-Sequenzen werden oft als Erkennungsstellen für Proteine verwendet, die die Transkription repressieren. Dies bedeutet, dass durch Methylierung von Promotorregionen von Genen deren Transkription unterdrückt werden kann. • Konsequenzen: DNA-Methylierung kann häufig zu einer langfristigen Stilllegung von Genen führen. Dies ist besonders wichtig in Entwicklungsprozessen und in der Zelldifferenzierung. Fehlregulierte DNA-Methylierung kann zu Krankheiten wie Krebs führen. 2. Histon-Modifikation: • Definition: Histone sind Proteine, um die DNA gewickelt ist, und die Struktur des Chromatins beeinflussen. Histonmodifikationen umfassen verschiedene chemische Veränderungen wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung, die an spezifischen Aminosäuren der Histonproteine stattfinden. • Funktion: Diese Modifikationen können die Struktur des Chromatins verändern, wodurch die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie beeinflusst wird. • Konsequenzen:
  • Histon-Acetylierung: Diese meist auf Lysin-Aminosäuren auftretende Modifikation lockert die DNA-Histon-Interaktion und fördert die Genexpression, indem sie die DNA für die Transkriptionsmaschinerie zugänglicher macht.
  • Histon-Methylierung: Diese Modifikation kann entweder zur Genaktivierung oder -repression führen, abhängig davon, welche Aminosäuren der Histone methyliert werden und wie viele Methylgruppen angehängt werden. Trimethylierung von Histon H3 am Lysin 27 (H3K27me3) ist beispielsweise eine bekannte Markierung für transkriptionelle Repression.
  Zusammenfassend: Epigenetische Mechanismen wie DNA-Methylierung und Histon-Modifikation sind entscheidend für die fein abgestimmte Regulation der Genexpression in Eukaryoten. Sie ermöglichen es den Zellen, auf Umweltbedingungen zu reagieren und während der Entwicklung und Zelldifferenzierung spezialisierte Zustände zu erreichen. Diese Änderungen können stabil und manchmal sogar über Zellgenerationen hinweg vererbt werden, ohne dass die zugrunde liegende DNA-Sequenz verändert wird.

c)

• Aufgabe: Transkriptionsfaktoren können durch verschiedene Mechanismen aktiviert oder inhibiert werden. Angenommen, ein spezifischer Transkriptionsfaktor wird durch Phosphorylierung aktiviert. Beschreibe, wie die Aktivierung dieses Faktors die Genexpression verstärken könnte. Erkläre möglicher Feedback-Schleifen, die durch diesen Transkriptionsfaktor in der Zelle initiiert werden könnten. Verwende mathematische Modelle oder Gleichungen, um die Dynamik des Systems zu veranschaulichen.

Lösung:

• Aktivierung von Transkriptionsfaktoren durch Phosphorylierung: Transkriptionsfaktoren sind Proteine, die an spezifische DNA-Sequenzen binden und die Transkription von Genen regulieren. Wenn ein spezifischer Transkriptionsfaktor durch Phosphorylierung aktiviert wird, bedeutet dies, dass eine Phosphatgruppe (\text{PO}_4^{3-}) kovalent an das Protein gebunden wird, oft durch die Wirkung einer Kinase.

• 1. Phosphorylierung und Genexpression:
  • Initiale Aktivierung: Die Phosphorylierung kann die Konformation des Transkriptionsfaktors ändern, wodurch dieser eine höhere Affinität für die DNA-Bindestelle in der Promotorregion eines Zielgens erhält.
  • Verstärkte Transkription: Einmal gebunden, erleichtert der aktivierte Transkriptionsfaktor die Rekrutierung der RNA-Polymerase und anderer notwendiger Co-Aktivatoren. Dies führt zu einer erhöhten Rate der Transkription des Zielgens.

• 2. Feedback-Schleifen: Transkriptionsfaktoren können Feedback-Schleifen in der Zelle initiieren, um die Expression von Genen zu regulieren. Es gibt zwei Haupttypen von Feedback-Schleifen: positive und negative. Positive Feedback-Schleife:
  • Wenn der aktivierte Transkriptionsfaktor ein Zielgen aktiviert, das ein Protein codiert, welches wiederum die Aktivierung des ursprünglichen Transkriptionsfaktors verstärkt oder seine eigene Expression erhöht, spricht man von einer positiven Feedback-Schleife.
  • Mathematisch kann dies durch eine Differentialgleichung dargestellt werden:

  •  \[ \frac{d[T_1]}{dt} = k_1 \times \frac{[TF]}{K_m + [TF]} - d_1 \times [T_1] \] 

  • Hierbei ist \([T_1]\) die Konzentration des Transkriptionsfaktors, \([TF]\) die Menge des aktivierten Transkriptionsfaktors, \(k_1\) die Syntheserate, \(K_m\) die Michaelis-Menten-Konstante und \(d_1\) die Abbaurate.
  Negative Feedback-Schleife:
  • Wenn der aktivierte Transkriptionsfaktor ein Zielgen aktiviert, das ein Protein codiert, welches die Aktivität des ursprünglichen Transkriptionsfaktors inhibiert, spricht man von einer negativen Feedback-Schleife.
  • Mathematisch kann dies durch eine Differentialgleichung dargestellt werden:

  •  \[ \frac{d[T_2]}{dt} = k_2 \times \frac{[TF]}{K_m + [TF]} - d_2 \times [T_2] - i \times [TF] \] 

  • Hierbei ist \([T_2]\) die Konzentration des Transkriptionsfaktors, \([TF]\) die Menge des aktivierten Transkriptionsfaktors, \(k_2\) die Syntheserate, \(K_m\) die Michaelis-Menten-Konstante, \(d_2\) die Abbaurate und \(i\) die Inhibitionskonstante.

• Zusammenfassend: Phosphorylierung aktiviert den Transkriptionsfaktor, erhöht seine Bindungsaffinität zu DNA und steigert die Genexpression. Feedback-Schleifen, ob positiv oder negativ, regulieren die Expression, stabilisieren oder dämpfen Schwankungen. Dies sorgt für robuste, präzise Genregulation nach spezifischen zellulären Bedingungen.