Fachmodul Immunologie I - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest in einem Labor und verwendest einen Durchflusszytometer zur Charakterisierung einer Mischung aus immunologischen Zellen. Die Mischung enthält T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen. Du möchtest die Zellpopulationen anhand ihrer physikalischen Eigenschaften (Zellgröße und Granularität) und der Expression von spezifischen Markern (CD3 für T-Zellen, CD19 für B-Zellen, und CD14 für Makrophagen) identifizieren.

a)

Beschreibe, wie Du die Vorwärtsstreuung (FSC) und die Seitwärtsstreuung (SSC) verwenden würdest, um zwischen den verschiedenen Zelltypen zu unterscheiden. Welche Eigenschaften der Zellen werden durch FSC und SSC reflektiert, und wie unterscheiden sich T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen in Bezug auf diese Eigenschaften?

Lösung:

Die Verwendung der Vorwärtsstreuung (FSC) und der Seitwärtsstreuung (SSC) im Durchflusszytometer ist ein grundlegendes Verfahren zur Charakterisierung und Unterscheidung von Zellpopulationen. Hier ist eine detaillierte Beschreibung, wie diese Parameter genutzt werden können, um zwischen T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen zu unterscheiden:

• Vorwärtsstreuung (FSC): Die Vorwärtsstreuung misst das Licht, das in einem kleinen Winkel nach vorne gestreut wird. Dies ist ein Indikator für die Zellgröße. Größere Zellen streuen mehr Licht nach vorne als kleinere Zellen.
• T-Zellen: Sind normalerweise mittelgroß.
• B-Zellen: Sind ebenfalls mittelgroß, ähnlich den T-Zellen, können jedoch etwas größer sein.
• Makrophagen: Sind in der Regel die größten Zellen in der Mischung und zeigen daher die höchste FSC-Intensität.
• Seitwärtsstreuung (SSC): Die Seitwärtsstreuung misst das Licht, das in einem größeren Winkel zur Seite gestreut wird. Dies ist ein Indikator für die Granularität und die inneren Komplexitäten der Zelle. Zellen mit höherer Granularität und mehr inneren Strukturen streuen mehr Licht seitwärts.
• T-Zellen: Haben in der Regel eine niedrigere Granularität und somit eine geringere SSC-Signatur.
• B-Zellen: Haben eine moderate Granularität und entsprechend eine moderate SSC-Signatur.
• Makrophagen: Sind sehr granuläre Zellen mit vielen inneren Komplexitäten und haben daher die höchste SSC-Intensität.

Zusammenfassend:

• FSC: Unterschiede in der Zellgröße ermöglichen es, Makrophagen (größer) von T-Zellen und B-Zellen (mittelgroß) zu unterscheiden.
• SSC: Unterschiede in der Granularität und inneren Komplexitäten ermöglichen es, Makrophagen (hohe Granularität) von T-Zellen (niedrigere Granularität) und B-Zellen (moderat granulär) zu unterscheiden.

Durch die Kombination von FSC und SSC kannst Du im Durchflusszytometer effektiv die verschiedenen Zelltypen basierend auf ihren physikalischen Eigenschaften identifizieren und voneinander unterscheiden.

b)

Angenommen, Du hast die Zellmischung mit Fluoreszenz-gebundenen Antikörpern gegen CD3, CD19 und CD14 gefärbt. Erkläre, wie Du den Durchflusszytometer einstellen würdest, um diese Marker zu detektieren. Welche Parameter (Fluoreszenzintensitäten) würdest Du für jede Färbung verwenden, und wie interpretierst Du die Dot-Plots und Histogramme zur Identifikation der verschiedenen Zellpopulationen?

Lösung:

Um die Zellmischung mit einem Durchflusszytometer zu analysieren und die verschiedenen Zellpopulationen basierend auf den Fluoreszenz-gebundenen Antikörpern gegen CD3, CD19 und CD14 zu identifizieren, musst Du sorgfältig die Einstellungen des Durchflusszytometers anpassen. Hier ist ein Schritt-für-Schritt-Leitfaden:

• Vorbereitung und Färbung: Färbe die Zellen mit fluoreszenzgebundenen Antikörpern gegen CD3 (für T-Zellen), CD19 (für B-Zellen) und CD14 (für Makrophagen). Jede dieser Fluoreszenzmarkierungen sollte ein separates fluorochrom gebunden haben. Typischerweise könnten das die folgenden Fluorochrome sein:
  • CD3: FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)
  • CD19: PE (Phycoerythrin)
  • CD14: APC (Allophycocyanin)
• Durchflusszytometer-Einstellungen:
  • Stelle die Kanäle des Durchflusszytometers auf die entsprechenden Fluorochrome ein:
    • FITC-Kanal (für CD3): Emissionspeak um 530 nm
    • PE-Kanal (für CD19): Emissionspeak um 575 nm
    • APC-Kanal (für CD14): Emissionspeak um 660 nm
  • Stelle die Spannung und Kompensierung des Detektors ein, um ein optimales Signal zu erhalten und Übersprechen zwischen den Kanälen zu minimieren.
• Datenerfassung: Erfasse die Daten für FSC, SSC sowie für die drei Fluoreszenzkanäle (FITC, PE und APC), um die Expression von CD3, CD19 und CD14 zu analysieren.
• Interpretation der Dot-Plots und Histogramme:
  • Erstelle Dot-Plots für jede Kombination von zwei Fluoreszenzparametern und zusätzliche Histogramme für jeden einzelnen Fluoreszenzparameter.
  • Beispiel: Dot-Plot für CD3 (FITC) vs. CD19 (PE) zeigt die Verteilung von T-Zellen (CD3+), B-Zellen (CD19+), und Doppelnegative (Makrophagen, die weder CD3 noch CD19 exprimieren).
  • Plot für CD3 (FITC) vs. CD14 (APC) zeigt die Verteilung von T-Zellen (CD3+), Makrophagen (CD14+), und Doppelnegative (B-Zellen, die weder CD3 noch CD14 exprimieren).
  • Plot für CD19 (PE) vs. CD14 (APC) zeigt die Verteilung von B-Zellen (CD19+), Makrophagen (CD14+), und Doppelnegative (T-Zellen, die weder CD19 noch CD14 exprimieren).
• Analyse und Identifikation:
  • T-Zellen: Identifiziere diese Zellen anhand der Fluoreszenz im FITC-Kanal (grüne Fluoreszenz, CD3+).
  • B-Zellen: Identifiziere diese Zellen anhand der Fluoreszenz im PE-Kanal (orange-rote Fluoreszenz, CD19+).
  • Makrophagen: Identifiziere diese Zellen anhand der Fluoreszenz im APC-Kanal (rote Fluoreszenz, CD14+).

Zusammenfassung: Durch genaue Einstellung der Fluoreszenzkanäle und sorgfältige Analyse der Dot-Plots und Histogramme kannst Du die verschiedenen Zellpopulationen in Deiner Mischung effektiv identifizieren und voneinander unterscheiden.

c)

Eine der Zellpopulationen zeigt eine abnorm hohe Variabilität in der Fluoreszenzintensität für einen der Marker. Angenommen, diese Populationsvarianz könnte auf technische Probleme zurückzuführen sein. Welche möglichen Fehlerquellen könnten eine solche Varianz verursachen und wie würdest Du diese in Deinem Experiment ausschließen? Berechne auch den Koeffizienten der Variabilität (CV) für eine Zellpopulation, wenn die Standardabweichung der Fluoreszenzintensität 50 und der Mittelwert 500 beträgt.

Lösung:

Wenn eine Zellpopulation eine abnorm hohe Variabilität in der Fluoreszenzintensität für einen der Marker zeigt, gibt es mehrere mögliche technische Fehlerquellen, die dieses Problem verursachen könnten. Hier sind einige dieser Fehlerquellen und die Schritte, um sie auszuschließen:

• Unzureichende oder ungleichmäßige Färbung:
  • Mögliche Ursache: Wenn die Zellen nicht gleichmäßig gefärbt werden, kann dies zu Variabilität in der Fluoreszenz führen.
  • Lösung: Stelle sicher, dass die Färbungsprotokolle streng eingehalten werden, einschließlich der genauen Antikörperkonzentration und Inkubationszeit. Überprüfe, ob die Zellen gründlich gemischt und gewaschen werden.
• Photobleaching:
  • Mögliche Ursache: Fluorochrome können durch Lichtexposition abgebaut werden, was die Fluoreszenzintensität vermindert.
  • Lösung: Minimiere die Exposition der gefärbten Zellen gegenüber Licht, insbesondere UV-Licht, und verarbeite die Proben schnell.
• Instrumentkalibrierung:
  • Mögliche Ursache: Eine schlechte Kalibrierung des Durchflusszytometers kann zu variierenden Messergebnissen führen.
  • Lösung: Überprüfe regelmäßig die Kalibrierung und Justierung des Durchflusszytometers anhand von Standardpartikeln.
• Detektor-Empfindlichkeit:
  • Mögliche Ursache: Variabilität in der Detektor-Empfindlichkeit kann ungleiche Ergebnisse liefern.
  • Lösung: Justiere die Detektor-Einstellungen und überprüfe die Stabilität des Lasers und der Fluoreszenzdetektoren.
• Pipettierfehler:
  • Mögliche Ursache: Fehler beim Pipettieren können zu ungleichen Zell- oder Antikörperkonzentrationen führen.
  • Lösung: Verwende kalibrierte Pipetten und wiederhole die Färbung mehrmals, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse konsistent sind.
• Autofluoreszenz:
  • Mögliche Ursache: Zelluläre Komponenten oder Detritus können eine natürliche Autofluoreszenz aufweisen, die die Messergebnisse beeinflusst.
  • Lösung: Führe Kontrollen ohne Antikörper durch, um den Hintergrund der Autofluoreszenz zu bestimmen, und subtrahiere diesen von den Messergebnissen.

Um eine abnorm hohe Variabilität zu kontrollieren, sollten all diese Faktoren sorgfältig überprüft und gegebenenfalls angepasst werden.

Berechnung des Koeffizienten der Variabilität (CV):

Der Koeffizient der Variabilität (CV) ist ein Maß für die relative Standardabweichung und wird folgendermaßen berechnet:

Formel:

CV = (Standardabweichung / Mittelwert) * 100%

In diesem Fall sind die Werte:

• Standardabweichung = 50
• Mittelwert = 500

Also:

CV = (50 / 500) * 100% = 10%

Der CV beträgt somit 10%. Dies bedeutet, dass die Standardabweichung 10% des Mittelwerts beträgt, was auf eine moderate Variabilität hinweist.

Aufgabe 2)

In diesem Übungsbeispiel betrachten wir die molekularen Signalwege der Immunantwort. Diese Signalwege aktivieren und regulieren Immunzellen, damit sie Pathogene erkennen und eliminieren können. Zu den wichtigen Komponenten gehören Rezeptoren wie TLRs, BCRs und TCRs sowie Signalmoleküle wie Zytokine und Chemokine. Die Signaltransduktion erfolgt über verschiedene Wege, darunter der MAP-Kinase-Weg, der NF-κB-Weg und der JAK-STAT-Weg. Diese Prozesse führen zur Genexpression und induzieren eine Zellantwort, wobei negative Feedback-Mechanismen eine wichtige Rolle bei der Regulation spielen.

a)

1.) Beschreibe den NF-κB-Weg in der Signaltransduktion.

Erkläre die Schritte beginnend mit der Aktivierung eines Toll-like-Rezeptors (TLR) bis zur Genexpression. Erwähne dabei mindestens vier wichtige Moleküle/Proteine, die an diesem Weg beteiligt sind.

Lösung:

1.) Beschreibe den NF-κB-Weg in der Signaltransduktion.

Der NF-κB-Weg ist ein zentraler Signalweg im Immunsystem, der zur Aktivierung von Genen führt, die an der Immunantwort beteiligt sind. Hier sind die Schritte, beginnend mit der Aktivierung eines Toll-like-Rezeptors (TLR) bis zur Genexpression:

• Erkennung und Bindung eines Pathogens: Ein Pathogen wird durch einen Toll-like-Rezeptor (TLR) auf der Oberfläche einer Immunzelle erkannt. Dieser Rezeptor bindet spezifische Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs).
• Aktivierung des Adaptorproteins MyD88: Die Bindung des Pathogens an den TLR führt zur Rekrutierung und Aktivierung des Adaptorproteins MyD88 (Myeloid differentiation primary response 88). MyD88 ist entscheidend für die Weiterleitung des Signals ins Zellinnere.
• Recruitment und Aktivierung von IRAK: MyD88 bindet und aktiviert IRAK (Interleukin-1 receptor-associated kinase), eine Kinase, die eine Kaskade von Phosphorylierungsereignissen in Gang setzt.
• Aktivierung von TRAF6 und IKK-Komplex: IRAK aktiviert den Adapter TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6), welcher anschließend den IKK-Komplex (IκB kinase complex) aktiviert. Der IKK-Komplex besteht aus den Untereinheiten IKKα, IKKβ und IKKγ, auch bekannt als NEMO.
• Abbau von IκB und Freisetzung von NF-κB: Der aktivierte IKK-Komplex phosphoryliert das Inhibitorprotein IκB, das an NF-κB gebunden ist. Die Phosphorylierung führt zum Abbau von IκB über das Ubiquitin-Proteasom-System, wodurch NF-κB freigesetzt wird.
• Translokation in den Zellkern und Genexpression: Nach der Freisetzung transloziert NF-κB in den Zellkern, wo es an DNA-Bindungsstellen auf Promotorregionen spezifischer Gene bindet und deren Transkription aktiviert. Diese Gene kodieren für verschiedene Zytokine, Chemokine und andere Moleküle, die an der Immunantwort beteiligt sind.

b)

2.) Analysiere die Rolle der Zytokine in der Immunantwort.

Diskutiere, wie Zytokine durch den JAK-STAT-Weg zur Genexpression beitragen. Nenne zwei Beispiele für Zytokine und beschreibe deren spezifische Funktionen in der Immunantwort.

Lösung:

2.) Analysiere die Rolle der Zytokine in der Immunantwort.

Zytokine sind essenzielle Signalmoleküle im Immunsystem, die Kommunikation zwischen Zellen ermöglichen und die Immunantwort koordinieren. Der JAK-STAT-Weg (Janus-Kinase-Signaltransducer und Aktivator der Transkription) ist von zentraler Bedeutung für die Vermittlung der Effekte von Zytokinen, indem er Signale von der Zelloberfläche zur Genexpression im Zellkern weiterleitet.

• Bindung und Aktivierung: Zytokine binden an spezifische Zytokinrezeptoren auf der Oberfläche von Zielzellen. Diese Bindung führt zur Dimerisierung (Zusammenlagerung) der Rezeptoren, welche dann die Janus-Kinasen (JAKs) rekrutieren.
• Phosphorylierung und Aktivierung: Die JAKs phosphorylieren sich gegenseitig und dann die Rezeptoren. Diese Phosphorylierung stellt Bindungsstellen für STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) Proteine bereit.
• Aktivierung und Dimerisierung von STATs: Die STAT-Proteine binden an die phosphorylierten Rezeptoren und werden von den JAKs phosphoryliert. Dies führt zur Dimerisierung der STAT-Proteine, welche dann in den Zellkern translozieren.
• Genexpression: Im Zellkern binden die dimerisierten STAT-Proteine an spezifische DNA-Sequenzen und initiieren die Transkription von Genen, die für die Immunantwort wichtig sind. Dies schließt die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen, Antigen-präsentierenden Molekülen und anderen Effektormolekülen ein.

Hier sind zwei Beispiele für Zytokine und ihre spezifischen Funktionen in der Immunantwort:

• Interleukin-6 (IL-6): IL-6 ist ein pro-inflammatorisches Zytokin, das eine Vielzahl von Funktionen hat. Es fördert die Differenzierung von B-Zellen zu Plasmazellen, die Antikörper produzieren, und aktiviert T-Zellen. Es spielt auch eine Rolle bei der Akutphasereaktion, die bei systemischen Infektionen oder Verletzungen auftritt, und stimuliert die Produktion von Akutphasenproteinen in der Leber.
• Interferon-gamma (IFN-γ): IFN-γ ist ein Schlüsselzytokin in der Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene wie Viren und bestimmte Bakterien. Es wird hauptsächlich von aktivierten T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) produziert. IFN-γ aktiviert Makrophagen und verstärkt ihre Fähigkeit, Pathogene zu phagozytieren und abzutöten. Es erhöht auch die Expression von MHC-Klasse-I- und -II-Molekülen, was die Antigenpräsentation und die Aktivierung von T-Zellen verbessert.

c)

3.) Der MAP-Kinase-Weg: Ein mathematischer Ansatz.

In einer bestimmten Zellpopulation wird durch den MAP-Kinase-Weg die Konzentration des aktiven ERK (extrazellulär regulierte Kinase) abhängig von der Zeit beschrieben durch: \[\frac{d[ERK_{Aktiv}]}{dt} = k_1 \times [Stimulus] - k_2 \times [ERK_{Aktiv}]\], wobei \[k_1 \text{ und } k_2\] konstante Werte sind. Löse diese Differenzialgleichung unter der Annahme, dass \[Stimulus \text{ ein konstanter Wert } S_0\] ist und \[ [ERK_{Aktiv}] (t=0) = 0\].

Lösung:

3.) Der MAP-Kinase-Weg: Ein mathematischer Ansatz.

Um die gegebene Differenzialgleichung zu lösen, beginnen wir mit:

\[\frac{d[ERK_{Aktiv}]}{dt} = k_1 \times [Stimulus] - k_2 \times [ERK_{Aktiv}]\]

Da der Stimulus ein konstanter Wert ist, nennen wir ihn \(S_0\). Somit wird die Gleichung zu:

\[\frac{d[ERK_{Aktiv}]}{dt} = k_1 \times S_0 - k_2 \times [ERK_{Aktiv}]\]

Diese Differenzialgleichung ist eine lineare Differenzialgleichung erster Ordnung, die wir mit der Methode der Trennung der Variablen lösen können.

Wir bringen alle Terme, die \([ERK_{Aktiv}]\) enthalten, auf eine Seite der Gleichung und die restlichen Terme auf die andere Seite:

\[\frac{d[ERK_{Aktiv}]}{dt} + k_2 \times [ERK_{Aktiv}] = k_1 \times S_0\]

Um diese Gleichung zu lösen, verwenden wir den Integrationsfaktor:

\[\text{Integrationsfaktor} = e^{k_2 t}\]

Wir multiplizieren die gesamte Gleichung mit diesem Integrationsfaktor:

\[e^{k_2 t} \frac{d[ERK_{Aktiv}]}{dt} + k_2 e^{k_2 t} [ERK_{Aktiv}] = k_1 S_0 e^{k_2 t}\]

Die linke Seite der Gleichung ist nun das vollständige Differential eines Produktes:

\[\frac{d}{dt} \bigg(e^{k_2 t} [ERK_{Aktiv}] \bigg) = k_1 S_0 e^{k_2 t}\]

Wir integrieren nun beide Seiten der Gleichung:

\[e^{k_2 t} [ERK_{Aktiv}] = \frac{k_1 S_0}{k_2} e^{k_2 t} + C\]

Hier ist \(C\) die Integrationskonstante. Wir lösen jetzt nach \([ERK_{Aktiv}]\) auf:

\[[ERK_{Aktiv}] = \frac{k_1 S_0}{k_2} + C e^{-k_2 t}\]

Um die Integrationskonstante \(C\) zu bestimmen, verwenden wir die Anfangsbedingung \([ERK_{Aktiv}] (t=0) = 0\):

\[0 = \frac{k_1 S_0}{k_2} + C \cdot e^{0}\]

Somit ist \(C\):

\[C = - \frac{k_1 S_0}{k_2}\]

Die endgültige Lösung der Differenzialgleichung ist daher:

\[[ERK_{Aktiv}] = \frac{k_1 S_0}{k_2} \bigg( 1 - e^{-k_2 t} \bigg)\]

Diese Lösung beschreibt die zeitliche Abhängigkeit der Konzentration von aktivem ERK in der Zellpopulation.

d)

4.) Negative Feedback-Mechanismen

Beschreibe einen negativen Feedback-Mechanismus innerhalb des JAK-STAT-Weges. Erkläre, wie dieser Mechanismus die Signaltransduktion und die Genexpression reguliert und warum er für die Kontrolle der Immunantwort wichtig ist.

Lösung:

4.) Negative Feedback-Mechanismen

Ein negativer Feedback-Mechanismus innerhalb des JAK-STAT-Weges ist die Regulation durch Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS)-Proteine. Diese Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Dämpfung der Signaltransduktion und der Genexpression und tragen so zur Kontrolle der Immunantwort bei.

• SOCS-Proteine: SOCS-Proteine werden als Reaktion auf die Aktivierung des JAK-STAT-Weges induziert. Ein Beispiel ist SOCS1, ein Protein, das als Feedback-Inhibitor fungiert, um die JAK-STAT-Signale zu regulieren.
• Mechanismus der Regulation: Nachdem Zytokine an ihre Rezeptoren gebunden haben und den JAK-STAT-Weg aktiviert haben, kommt es zur Induktion und Expression von SOCS-Proteinen. Diese SOCS-Proteine können dann an die Janus-Kinasen (JAKs) oder die Zytokinrezeptoren binden und deren Aktivität hemmen. SOCS1 bindet direkt an JAKs, inhibiert ihre Kinase-Aktivität und markiert sie für den Abbau durch das Proteasom.
• Hemmung der JAK-Aktivität: SOCS1 kann an die JAKs binden und deren Kinase-Aktivität hemmen, wodurch die Signaltransduktion reduziert wird.
• Ubiquitinierung und Abbau: SOCS-Proteine können die Ubiquitinierung von JAKs und anderen Signalproteinen fördern, was zu deren Abbau durch das Proteasom führt.
• Regulation der Genexpression: Durch die Hemmung der JAK-Aktivität wird der Phosphorylierungsgrad von STAT-Proteinen reduziert. Dies führt dazu, dass weniger phosphorylierte STATs in den Zellkern gelangen und an spezifische Promotoren von Zielgenen binden. Die Genexpression von entzündungsfördernden Zytokinen und anderen Effektormolekülen wird somit herunterreguliert.
• Bedeutung der Kontrolle der Immunantwort: Solche negativen Feedback-Mechanismen sind entscheidend, um zu verhindern, dass die Immunantwort übermäßig aktiviert wird. Eine unkontrollierte Aktivierung des JAK-STAT-Weges könnte zu chronischen Entzündungen oder Autoimmunerkrankungen führen. Indem SOCS-Proteine die Signaltransduktion dämpfen, sorgen sie dafür, dass die Immunantwort zeitlich begrenzt und auf das Notwendige beschränkt bleibt, um Gewebeschäden und pathologische Zustände zu vermeiden.

Aufgabe 3)

Antigenpräsentation und MHC-KomplexeDer Prozess der Antigenpräsentation ist entscheidend für die Aktivierung der adaptiven Immunantwort. Antigene werden von Zellen aufgenommen, prozessiert und dann durch MHC-Komplexe auf der Zelloberfläche präsentiert. Es gibt zwei Hauptklassen von MHC-Molekülen: MHC I und MHC II. Während MHC I Moleküle endogene Antigene an CD8+ T-Zellen präsentieren, sind MHC II Moleküle verantwortlich für die Präsentation von exogenen Antigenen an CD4+ T-Zellen. Wichtige Schritte dieses Prozesses sind die Antigenaufnahme, die Antigenprozessierung und die Präsentation. Professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs) wie dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen spielen eine zentrale Rolle in diesem Prozess. Zudem sind die Gene, die für MHC-Moleküle kodieren, hochpolymorph, was eine große Vielfalt in der Immunantwort ermöglicht.

a)

Beschreibe die Unterschiede zwischen MHC I und MHC II Molekülen in Bezug auf ihre Struktur und Funktion. Gehe dabei besonders auf die Arten von Antigenen ein, die sie präsentieren, und auf welche T-Zellen sie abzielen.

Lösung:

Unterschiede zwischen MHC I und MHC II Molekülen in Bezug auf Struktur und Funktion:

• Struktur:
  • MHC I: MHC I Moleküle bestehen aus einer schweren Kette (Alpha-Kette) und einer kleineren Beta-2-Mikroglobulin-Kette. Die Alpha-Kette hat drei Domänen (α1, α2, und α3). Die Peptidbindungsstelle wird von den Domänen α1 und α2 gebildet.
  • MHC II: MHC II Moleküle bestehen aus zwei gleich großen Ketten, einer Alpha-Kette und einer Beta-Kette. Jede dieser Ketten hat zwei Domänen (α1, α2 und β1, β2). Die Peptidbindungsstelle wird von den Domänen α1 und β1 gebildet.
• Funktion:
  • MHC I: MHC I Moleküle präsentieren endogene Antigene, die aus dem Zytoplasma der Zelle stammen. Diese Antigene werden im Proteasom prozessiert und dann durch den Transporter TAP (Transporter associated with Antigen Processing) in das Endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert, wo sie an MHC I Moleküle binden. Die MHC I-Antigen-Komplexe werden dann zur Zelloberfläche transportiert und präsentieren die Antigene an CD8+ T-Zellen (zytotoxische T-Zellen).
  • MHC II: MHC II Moleküle präsentieren exogene Antigene, die von der Zelle durch Endozytose aufgenommen wurden. Diese Antigene werden in endolysosomalen Kompartimenten prozessiert und binden anschließend an MHC II Moleküle. Die MHC II-Antigen-Komplexe werden dann zur Zelloberfläche transportiert und präsentieren die Antigene an CD4+ T-Zellen (T-Helferzellen).
• Antigenarten:
  • MHC I: Endogene Antigene (z. B. virusinfizierte oder tumorigene Zellen).
  • MHC II: Exogene Antigene (z. B. Bakterien, die durch Phagozytose oder Endozytose aufgenommen wurden).
• Ziel-T-Zellen:
  • MHC I: Präsentieren Antigene an CD8+ T-Zellen.
  • MHC II: Präsentieren Antigene an CD4+ T-Zellen.

b)

Erkläre den Prozess der Antigenaufnahme, Prozessierung und Präsentation für professionelle antigenpräsentierende Zellen. Wie tragen diese Schritte zur Diversität der Immunantwort bei und warum ist die Hochpolymorphie der MHC-Gene dabei von Bedeutung? Verwende dabei mathematische Beispiele, um die Diversität der möglichen MHC-Interaktionen zu verdeutlichen.

Lösung:

Erklärung des Prozesses der Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation für professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs):

• Antigenaufnahme:
  • Professionelle APCs wie dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen nehmen Antigene durch Phagozytose (für größere Partikel wie Bakterien) oder Endozytose (für kleinere Partikel oder lösliche Antigene) auf.
• Antigenprozessierung:
  • Exogene Antigene (die hauptsächlich von MHC II Molekülen präsentiert werden) gelangen in den Endosom-Lysosom-Weg, wo sie durch Proteasen in kleinere Fragmente gespalten werden.
  • Endogene Antigene (die von MHC I Molekülen präsentiert werden) werden im Zytoplasma durch das Proteasom abgebaut. Die resultierenden Peptide werden durch den TAP-Komplex (Transporter associated with Antigen Processing) ins Endoplasmatische Retikulum (ER) transportiert und dort an MHC I Moleküle gebunden.
• Antigenpräsentation:
  • Seitens exogener Antigene binden die MHC II Moleküle an diese in spezialisierten Kompartimenten wie MIIC (MHC class II compartment). Diese Komplexe werden zur Zelloberfläche transportiert und an CD4+ T-Zellen präsentiert.
  • Endogene Antigene, die an MHC I Moleküle gebunden haben, werden ebenfalls zur Zelloberfläche transportiert und präsentieren die fraglichen Antigene an CD8+ T-Zellen.
• Beiträge zur Diversität der Immunantwort und Bedeutung der Hochpolymorphie der MHC-Gene:
  • Die hohe Diversität der Immunantwort wird durch die Vielzahl der verschiedenen MHC-Allele in der Population ermöglicht. Jeden Typ MHC-Molekül einzeln betrachtend, besitzt der Mensch eine Vielzahl von Allelen, die verschiedene Antigene binden können.
  • Die Hochpolymorphie der MHC-Gene bewirkt, dass zahlreiche unterschiedliche Versionen dieser MHC-Moleküle existieren. Vertreter dieser Diversität können mathematische Beispiele verdeutlichen:
  • Angenommen, eine Einzelperson trägt sechs unterschiedliche MHC I Allele und sechs unterschiedliche MHC II Allele und jedes Allel kann je 10.000 verschiedene Antigene binden. Daraus folgt:
  • Für MHC I Moleküle: \[(6 \text{ Allele}) \times (10.000 \text{ Peptide}) = 60.000 \text{ mögliche MHC I-Peptid-Komplexe}\]
  • Für MHC II Moleküle: \[(6 \text{ Allele}) \times (10.000 \text{ Peptide}) = 60.000 \text{ mögliche MHC II-Peptid-Komplexe}\]
  • Dies zeigt, dass ein Individuum eine beträchtliche Vielfalt an präsentierten Antigenen besitzt, was eine effektive Immunantwort gegen zahlreiche unterschiedliche Pathogene ermöglicht.

Aufgabe 4)

RNA-Interferenz zur GenfunktionsanalyseMethode zur Stilllegung spezifischer Gene durch die Zufuhr von doppelsträngiger RNA (dsRNA), die zur Degradation der entsprechenden mRNA führt.

• doppelsträngige RNA (dsRNA) wird in die Zelle eingeführt
• dsRNA aktiviert den RNA-Induced Silencing Complex (RISC)
• RISC zerlegt die Ziel-mRNA, verhindert Translation
• gezielte Stilllegung eines Gens: Analyse der Genfunktion
• hohe Spezifität: minimaler Off-Target-Effekt

a)

Erkläre den Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi) Schritt für Schritt. Beginne mit der Einführung der dsRNA in die Zelle und beschreibe, wie dies zur Stilllegung eines spezifischen Gens führt. Diskutiere die Rolle des RISC-Komplexes und die Spezifität der Methode.

Lösung:

Mechanismus der RNA-Interferenz (RNAi)RNA-Interferenz (RNAi) ist ein zellulärer Mechanismus, der zur Stilllegung spezifischer Gene verwendet wird. Der Prozess beginnt mit der Einführung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in die Zelle und führt zur gezielten Degradation der entsprechenden mRNA. Dies kann in den folgenden Schritten beschrieben werden:

• Einführung der dsRNA: Doppelsträngige RNA (dsRNA) wird in die Zelle eingeführt. Die dsRNA kann entweder künstlich synthetisiert und in die Zelle eingebracht werden oder durch virale Infektion produziert werden.
• Aktivierung des RISC-Komplexes: Die eingeführte dsRNA wird von einem Enzym namens Dicer erkannt und in kleinere Fragmente, sogenannte small interfering RNAs (siRNAs), geschnitten. Diese siRNAs bestehen typischerweise aus etwa 21-23 Nukleotidpaaren.
• Bindung an den RISC-Komplex: Die siRNAs werden dann in den RNA-Induced Silencing Complex (RISC) integriert. Der RISC-Komplex enthält Proteine wie Argonaute, die eine zentrale Rolle im RNAi-Mechanismus spielen.
• Ziel-mRNA-Erkennung und -Spaltung: Eine der beiden Stränge der siRNA wird abgebaut, während der andere Strang, der sogenannte Leitstrang, als Vorlage dient, um komplementäre Ziel-mRNA zu erkennen. Sobald die Ziel-mRNA gebunden ist, spaltet der RISC-Komplex diese, wodurch die mRNA degradiert und ihre Translation in ein Protein verhindert wird.
• Gen-Stilllegung und Analyse der Genfunktion: Durch die gezielte Stilllegung eines Gens kann die Funktion dieses Gens analysiert werden. Wenn das Genprodukt fehlt, können Wissenschaftler beobachten, welche biologischen Prozesse gestört sind, um die Funktion des Gens zu verstehen.
• Hohe Spezifität: Die Methode ist hochspezifisch, da die siRNA nur an die komplementäre Ziel-mRNA bindet. Dadurch wird das Risiko unerwünschter Off-Target-Effekte minimiert.

Zusammengefasst führt die Einführung von dsRNA in die Zelle über eine Kaskade von Mechanismen zur gezielten Stilllegung eines spezifischen Gens. Der RISC-Komplex spielt dabei eine entscheidende Rolle, indem er die Ziel-mRNA erkennt und spaltet. Dank der hohen Spezifität der Methode können Wissenschaftler Gene präzise untersuchen und besser verstehen, welche Rollen sie in verschiedenen biologischen Prozessen spielen.

b)

Angenommen, Du möchtest die Funktion eines unbekannten Gens namens 'Gene X' analysieren, das im Zellzyklus der Fruchtfliege eine Rolle spielt. Beschreibe den experimentellen Ablauf, den Du zur Anwendung der RNA-Interferenz einsetzen würdest, um die Funktion von 'Gene X' zu untersuchen. Welche Kontrollen würdest Du in Dein Experiment einbauen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse spezifisch für 'Gene X' sind?

Lösung:

Experimenteller Ablauf zur Analyse der Funktion von 'Gene X' mittels RNA-Interferenz (RNAi)Um die Funktion des unbekannten Gens 'Gene X', das im Zellzyklus der Fruchtfliege eine Rolle spielt, mittels RNA-Interferenz zu untersuchen, würdest Du den folgenden experimentellen Ablauf einhalten:

• Design und Synthese der dsRNA: Zuerst wird die Sequenz von 'Gene X' analysiert, um spezifische siRNA-Sequenzen zu designen. Diese Sequenzen werden dann synthetisiert, um doppelsträngige RNA (dsRNA) zu erzeugen, die spezifisch für 'Gene X' ist.
• Einführung der dsRNA in die Fruchtfliegenzellen: Die synthetisierte dsRNA wird in die Zellen der Fruchtfliege durch Mikroinjektion oder durch ein virales Vektorsystem eingeführt. Dieser Schritt ist entscheidend, damit die dsRNA in die Zielzellen gelangt.
• Aktivierung des RISC-Komplexes: Sobald die dsRNA in den Zellen vorhanden ist, wird sie von Dicer erkannt und in siRNA-Fragmente zerlegt. Diese Fragmente werden in den RISC-Komplex integriert, der die Ziel-mRNA von 'Gene X' erkennt und degradiert.
• Analyse der Gen-Stilllegung: Nachdem die Funktion von 'Gene X' durch RNAi gestillt wurde, werden die Zellen oder Organismen auf Veränderungen im Zellzyklus untersucht. Dies kann durch Zellteilungsassays, mikroskopische Beobachtungen oder molekulare Marker des Zellzyklus erfolgen.

Kontrollen zur Sicherstellung der SpezifitätUm sicherzustellen, dass die Ergebnisse spezifisch für 'Gene X' sind und nicht durch allgemeine Nebenwirkungen der RNAi oder Off-Target-Effekte verursacht werden, sollten folgende Kontrollen in Dein Experiment eingebaut werden:

• Negative Kontrolle: Eine dsRNA-Sequenz, die keine Homologie zu irgendeinem Gen der Fruchtfliege hat, wird verwendet, um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte spezifisch für die Stillelegung von 'Gene X' sind und nicht durch das Einbringen von dsRNA in die Zellen verursacht werden.
• Positive Kontrolle: Eine dsRNA-Sequenz, die bekannt dafür ist, ein anderes Gen im Zellzyklus der Fruchtfliege effektiv zu stilllegen, kann verwendet werden, um zu zeigen, dass der RNAi-Mechanismus unter den experimentellen Bedingungen funktioniert.
• Western Blot oder qPCR: Eine quantitative Analyse der mRNA- oder Proteinspiegel von 'Gene X' vor und nach der Behandlung mit dsRNA kann durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass 'Gene X' spezifisch und effektiv gestillt wurde.
• Off-Target-Effekte minimieren: Mehrere siRNA-Sequenzen gegen verschiedene Regionen von 'Gene X' können getestet werden, um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte aufgrund der spezifischen Degradation von 'Gene X'-mRNA und nicht durch Off-Target-Effekte auftreten.

Zusammengefasst ermöglicht dieser experimentelle Ansatz eine gezielte und spezifische Stilllegung von 'Gene X' mittels RNAi, sowie die Analyse seiner Funktion im Zellzyklus der Fruchtfliege, während gleichzeitig geeignete Kontrollen eingebaut werden, um die Spezifität der Ergebnisse zu gewährleisten.

c)

Eine Forschergruppe hat festgestellt, dass RNAi in ihren Experimenten Off-Target-Effekte zeigt, die zur Stilllegung von nicht-zielgerichteten Genen führen. Diskutiere mögliche Ursachen für diese Off-Target-Effekte und beschreibe Methoden oder Strategien, die verwendet werden könnten, um diese Effekte zu minimieren.

Lösung:

Diskussion der Ursachen von Off-Target-Effekten bei RNAi und Methoden zu deren MinimierungRNA-Interferenz (RNAi) ist eine mächtige Methode zur Stilllegung spezifischer Gene, aber sie kann auch Off-Target-Effekte verursachen, die zur unbeabsichtigten Degradation oder Stilllegung von nicht-zielgerichteten Genen führen. Hier sind einige mögliche Ursachen für diese Off-Target-Effekte sowie Strategien zu deren Minimierung:

• Unvollständige Komplementarität: Die siRNA kann teilweise komplementäre Sequenzen in anderen mRNA-Molekülen erkennen und binden, was zur Degradation dieser nicht-zielgerichteten mRNAs führt.
• MicroRNA-ähnliche Effekte: Die siRNA kann wie eine endogene MicroRNA (miRNA) wirken und regulatorische Elemente in der 3'-untranslatierten Region (3'-UTR) von nicht-zielgerichteten mRNAs beeinflussen, was die Translation unterdrückt.
• Generische zelluläre Effekte: Die Einführung von dsRNA kann Stressantworten in der Zelle induzieren, die zu globalen Veränderungen in der Genexpression führen.

Methoden zur Minimierung von Off-Target-Effekten

• Sorgfältiges Design der siRNA: Verwende bioinformatische Tools, um siRNA-Sequenzen zu designen, die spezifisch für das Zielgen sind und keine signifikante Homologie zu nicht-zielgerichteten Genen aufweisen. Algorithmen können helfen, siRNA-Sequenzen zu finden, die die beste Balance zwischen Effizienz und Spezifität bieten.
• Verwendung von mehreren siRNAs: Setze mehrere unterschiedliche siRNAs gegen verschiedene Bereiche des Zielgens ein. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass beobachtete Effekte tatsächlich auf die Stilllegung dieses Gens zurückzuführen sind und nicht auf Off-Target-Effekte.
• KontrollsiRNAs: Verwende KontrollsiRNAs, die keine Homologie zu irgendeinem Gen in der Zelle haben. Dies hilft, Effekte zu identifizieren, die durch das Vorhandensein von siRNAs selbst verursacht werden und nicht durch spezifische Zielgen-Stilllegung.
• Western Blot und qPCR-Validierung: Überprüfe die Levels des Zielproteins und der Ziel-mRNA durch Western Blot und quantitative PCR (qPCR), um sicherzustellen, dass die Effekte spezifisch für das Zielgen sind.
• Niedrigere siRNA-Konzentrationen: Verwende die niedrigste siRNA-Konzentration, die eine effektive Stilllegung des Zielgens ermöglicht, um Off-Target-Effekte zu minimieren.
• Verwendung von Off-Target-Analysen: Nutze Hochdurchsatzsequenzierung oder mikroarraybasierte Ansätze, um Off-Target-Effekte systematisch zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Daten können zur Verbesserung des siRNA-Designs verwendet werden.

Zusammengefasst ist es entscheidend, die Ursachen von Off-Target-Effekten zu verstehen und geeignete Strategien anzuwenden, um diese Effekte zu minimieren. Sorgfältiges Design der siRNA, Verwendung von Kontrollen und Validierung durch molekulare Methoden tragen dazu bei, spezifische und zuverlässige Ergebnisse bei der RNAi-gestützten Genfunktionsanalyse zu erzielen.

d)

Berechne die Effizienz der Genstilllegung durch RNAi. Angenommen, in einem Experiment wird die Menge der mRNA von 'Gene X' um 80% reduziert. Welchen prozentualen Anteil der ursprünglichen mRNA von 'Gene X' verbleibt nach der Behandlung mit dsRNA? Zeige alle Schritte Deines Rechenwegs.

Lösung:

Berechnung der Effizienz der Genstilllegung durch RNAiUm die Effizienz der Genstilllegung durch RNAi zu berechnen, wenn die Menge der mRNA von 'Gene X' um 80% reduziert wird, gehen wir wie folgt vor:1. Ursprüngliche Menge der mRNA bestimmen:Die ursprüngliche Menge der mRNA von 'Gene X' wird als 100% definiert.2. Reduzierte Menge der mRNA berechnen:Die mRNA-Menge wird um 80% reduziert, was bedeutet, dass 80% der ursprünglichen mRNA degradiert wird.3. Verbleibende Menge der mRNA berechnen:Nachdem 80% der mRNA reduziert wurden, verbleibt:100% - 80% = 20%Das bedeutet, dass 20% der ursprünglichen Menge der mRNA von 'Gene X' nach der Behandlung mit dsRNA noch vorhanden ist.Zusammengefasst zeigen die Berechnungen die folgenden Schritte auf:

• Ursprüngliche Menge der mRNA = 100%
• Reduzierung der mRNA = 80%
• Verbleibende Menge der mRNA = 100% - 80% = 20%

Somit verbleiben nach der Behandlung mit dsRNA noch 20% der ursprünglichen Menge der mRNA von 'Gene X'.