Fachmodul Molekulare Pflanzenphysiologie I - Exam

Aufgabe 1)

PCR und Gensequenzierung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren zur exponentiellen Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen. Die Gensequenzierung ist eine Methode zur Bestimmung der exakten Reihenfolge der Nukleotide in einer DNA-Sequenz.

• PCR-Komponenten: Template-DNA, Primer, dNTPs, Taq-Polymerase, Puffer.
• PCR-Zyklen: Denaturierung bei 94°C, Annealing bei 50-65°C, Elongation bei 72°C.
• Sanger-Sequenzierung: Verwendet basenspezifische Abbruchnukleotide (ddNTPs).
• Nächste-Generation-Sequenzierung (NGS): Paralleles Sequenzieren großer Mengen von DNA.
• Methoden: Illumina, PacBio, Nanopore.

a)

Erkläre, warum die Temperatur bei den einzelnen Schritten der PCR (Denaturierung, Annealing, Elongation) variieren muss. Berechne, wie viele Kopien eines DNA-Fragments nach 25 Zyklen der PCR approximativ erzeugt werden, wenn Du mit einem einzigen DNA-Molekül startest. Zeige deinen Rechenweg.

Lösung:

Erklärung der Temperaturschritte bei der PCR:

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht auf wiederholten Zyklen aus Denaturierung, Annealing und Elongation. Die Temperaturen müssen variieren, um diese unterschiedlichen Schritte zu ermöglichen:

• Denaturierung bei 94°C: Bei dieser hohen Temperatur schmelzen die doppelsträngigen DNA-Moleküle, sodass sie in zwei Einzelstränge getrennt werden. Dies ist notwendig, um die Template-DNA für die Primer zugänglich zu machen.
• Annealing bei 50-65°C: Während dieses Schritts binden die Primer an die einzelnen DNA-Stränge. Die genaue Temperatur hängt von der Länge und Sequenz der Primer ab; sie muss niedrig genug sein, damit die Primer an die DNA binden können, aber hoch genug, um unspezifische Bindungen zu vermeiden.
• Elongation bei 72°C: Diese Temperatur ist optimal für die Taq-Polymerase, ein Enzym, das die neuen DNA-Stränge synthetisiert, indem es dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate) verwendet. Bei dieser Temperatur arbeitet die Taq-Polymerase am effizientesten.

Berechnung der Anzahl der DNA-Kopien nach 25 Zyklen:

Die Anzahl der DNA-Moleküle verdoppelt sich in jedem Zyklus der PCR. Wenn Du mit einem einzigen DNA-Molekül startest, kannst Du die Anzahl der DNA-Kopien nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen mit der Formel 2ⁿ berechnen, wobei n die Anzahl der Zyklen ist.

Für 25 Zyklen lautet die Berechnung:

• Anzahl der DNA-Kopien nach 25 Zyklen: 2²⁵
• 2²⁵ = 33.554.432

Daher würden nach 25 Zyklen der PCR approximativ 33.554.432 Kopien des DNA-Fragments erzeugt werden.

b)

Beschreibe die Unterschiede zwischen der Sanger-Sequenzierung und der Nächsten-Generation-Sequenzierung (NGS) hinsichtlich der Methodik und der Anwendungsbereiche. Erläutere, warum die NGS einen höheren Durchsatz im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung bietet.

Lösung:

Unterschiede zwischen Sanger-Sequenzierung und Nächsten-Generation-Sequenzierung (NGS)

Die Sanger-Sequenzierung und die Nächsten-Generation-Sequenzierung (NGS) sind beides Methoden zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA, weisen jedoch bedeutende Unterschiede in Methodik und Anwendungsbereichen auf:

Methodik:

• Sanger-Sequenzierung: Diese Methode basiert auf der Synthese von neuen DNA-Strängen unter Zuhilfenahme von dNTPs und speziellen ddNTPs (Didesoxynukleosidtriphosphate). Die ddNTPs führen nach ihrer Einbindung zum Abbruch der DNA-Synthese. Durch den Einsatz von vier verschiedenen ddNTPs (je eines für A, T, C, G) und fluoreszenzmarkierter Primer kann am Ende ein Fragmentmuster erstellt werden, das die Positionen der einzelnen Nukleotide aufzeigt. Die Fragmente werden dann mittels Gelelektrophorese getrennt und die Sequenz wird anhand der jeweiligen Längen bestimmt.
• Nächsten-Generation-Sequenzierung (NGS): NGS umfasst verschiedene Methoden (z.B. Illumina, PacBio, Nanopore), die alle parallel mehrere DNA-Fragmente sequenzieren. Bei der Illumina-Technologie wird die DNA fragmentiert, an Adapter gebunden und auf einer festen Oberfläche amplifiziert. Diese Kluster von DNA-Molekülen werden dann eingescannt, wobei jeder eingeschleuste Nukleotid ein Signal erzeugt, das detektiert und aufgezeichnet wird. Die parallele Sequenzierung ermöglicht eine massive Datenerzeugung in kurzer Zeit.

Anwendungsbereiche:

• Sanger-Sequenzierung: Diese Methode wird häufig für kleinere Projekte genutzt, wie zum Beispiel die Sequenzierung einzelner Gene, die Verifizierung von Klonierungsprodukten oder die Sequenzierung von PCR-Produkten. Aufgrund ihrer Genauigkeit und Zuverlässigkeit ist sie besonders geeignet für Zielsequenzen mit bekannten oder erwarteten Variationen.
• Nächsten-Generation-Sequenzierung (NGS): NGS eignet sich aufgrund ihrer hohen Datenmenge und Geschwindigkeit für große Projekte, wie Genomsequenzierung, Transkriptomstudien und Metagenomik. Sie wird auch für personalisierte Medizin und die Identifikation von genetischen Variationen in großen Populationen eingesetzt.

Erklärung des höheren Durchsatzes von NGS im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung:

Die NGS-Technologien bieten einen höheren Durchsatz im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung durch:

• Parallele Sequenzierung: NGS kann gleichzeitig Millionen bis Milliarden von DNA-Fragmente sequenzieren, während die Sanger-Sequenzierung nur ein Fragment pro Reaktion verarbeitet.
• Automatisierung und Miniaturisierung: Automatisierung der Prozesse und Verwendung von Mikrofluidik in NGS-Plattformen senken die Fehlerrate und erhöhen die Effizienz der Verarbeitung großer Probenmengen.
• Schnelligkeit und Datenvolumen: NGS-Technologien sind konzipiert, um große Mengen an Daten in deutlich kürzerer Zeit zu erzeugen. Während ein Sanger-Lauf Stunden bis Tage dauern kann, können NGS-Systeme Daten in Stunden generieren.

Daher ist NGS besonders attraktiv für Projekte, die enorme Mengen an DNA-Daten erfordern, wie z.B. die menschliche Genomsequenzierung oder umfassende genetische Studien.

Aufgabe 2)

Immunhistochemische Färbemethoden werden genutzt, um spezifische Proteine in Geweben zu lokalisieren. Dabei koppeln Antikörper an nützliche Farbstoffe oder Fluorochrome. Die Technik umfasst die Bindung eines Primärantikörpers an das Zielprotein und eines markierten Sekundärantikörpers an den Primärantikörper. Dies führt zu einer Färbung oder einem Fluoreszenzsignal, das die Position des Zielproteins anzeigt. Es gibt direkte Methoden (markierter Primärantikörper) und indirekte Methoden (markierter Sekundärantikörper). Typische Farbstoffe sind DAB für enzymatische Färbung und FITC für fluoreszente Färbung.

a)

• Beschreibe den Hauptunterschied zwischen der direkten und der indirekten Immunfluoreszenz. Gehe dabei auf die Rolle des Primär- und Sekundärantikörpers ein und nenne je ein Beispiel für einen verwendeten Farbstoff oder ein Fluorochrom.

Lösung:

• Direkte Immunfluoreszenz: Bei der direkten Immunfluoreszenz wird der Primärantikörper direkt mit einem Farbstoff oder einem Fluorochrom markiert. Dieser Primärantikörper bindet spezifisch an das Zielprotein im Gewebe. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie schneller ist, da nur ein Antikörper verwendet wird, was die Protokollzeit verkürzt und das Risiko von Nicht-Spezifischen Bindungen reduziert. Ein gängiges Fluorochrom, das in der direkten Immunfluoreszenz verwendet wird, ist Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), das grün fluoreszierend ist. Beispiel: FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)
• Indirekte Immunfluoreszenz: Bei der indirekten Immunfluoreszenz bindet der Primärantikörper spezifisch an das Zielprotein im Gewebe, ist jedoch nicht markiert. Stattdessen wird ein Sekundärantikörper verwendet, der an den Primärantikörper bindet und mit einem Farbstoff oder einem Fluorochrom markiert ist. Diese Methode bietet den Vorteil einer Signalverstärkung, da mehrere Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden können, was zu einer stärkeren Fluoreszenz führt. Ein typischer Farbstoff für die indirekte Immunfluoreszenz ist DAB (3,3'-Diaminobenzidin), das für die enzymatische Färbung verwendet wird. Beispiel: DAB (3,3'-Diaminobenzidin)

b)

• Diskutiere die Vor- und Nachteile der indirekten Immunfluoreszenz im Vergleich zur direkten Immunfluoreszenz. Berücksichtige dabei die Signalverstärkung, die Flexibilität bei der Wahl der Marker und die Einsatzmöglichkeiten.

Lösung:

• Indirekte Immunfluoreszenz

  Vorteile:
• Signalverstärkung: Da mehrere Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden können, wird das Fluoreszenzsignal verstärkt. Dies führt zu einer höheren Empfindlichkeit und ermöglicht die Detektion niedrig exprimierter Proteine.
• Flexibilität bei der Wahl der Marker: Da der Primärantikörper unmarkiert ist, kann derselbe Primärantikörper mit verschiedenen markierten Sekundärantikörpern verwendet werden. Dies bietet die Möglichkeit, verschiedene Farbstoffe und Fluorochrome zu verwenden, je nach den spezifischen Anforderungen des Experiments.
• Breitere Einsatzmöglichkeiten: Die indirekte Methode ist vielseitiger und kann an viele verschiedene Arten von Proben und Experimenten angepasst werden.
• Nachteile:
• Längere Protokollzeit: Da zwei Bindungsschritte erforderlich sind (Primär- und Sekundärantikörper), ist das Protokoll insgesamt zeitaufwändiger.
• Höheres Risiko für unspezifische Bindungen: Der zusätzliche Antikörper kann zu einer höheren Hintergrundfärbung führen, was die Interpretation der Ergebnisse erschweren kann.

• Direkte Immunfluoreszenz

  Vorteile:
• Kürzere Protokollzeit: Da nur ein markierter Primärantikörper benötigt wird, ist der Färbeprozess schneller und einfacher.
• Reduziertes Risiko von unspezifischen Bindungen: Mit einem einzigen Antikörper im Färbevorgang gibt es weniger Möglichkeiten für unspezifische Bindungen, was zu klareren Ergebnissen führen kann.
• Nachteile:
• Geringere Signalverstärkung: Da nur ein markierter Antikörper an das Zielprotein bindet, ist das Signal schwächer im Vergleich zur indirekten Methode. Dies kann die Detektion niedrig exprimierter Proteine erschweren.
• Weniger Flexibilität bei der Wahl der Marker: Jeder Primärantikörper muss individuell markiert werden, was den experimentellen Aufwand und die Kosten erhöht.

c)

• Angenommen, Du hast ein Experiment mit indirekter Immunfluoreszenz durchgeführt und dabei ein sehr schwaches Fluoreszenzsignal erhalten. Was könnten mögliche Ursachen für dieses Ergebnis sein und welche Schritte würdest Du unternehmen, um die Signalstärke zu verbessern?

Lösung:

• Mögliche Ursachen für ein schwaches Fluoreszenzsignal bei indirekter Immunfluoreszenz:

• Geringe Primärantikörperkonzentration: Die Konzentration des Primärantikörpers könnte zu niedrig gewesen sein, um das Zielprotein ausreichend zu binden.
• Unzureichende Inkubationszeit: Die Inkubationszeit für den Primär- oder Sekundärantikörper könnte zu kurz gewesen sein, um eine ausreichende Bindung zu ermöglichen.
• Schlechter Zustand der Antikörper: Die Antikörper könnten abgelaufen oder durch unsachgemäße Lagerung degradiert sein.
• Zu geringe Konzentration des Sekundärantikörpers: Eine zu niedrige Konzentration des markierten Sekundärantikörpers könnte zu einem schwachen Signal führen.
• Übermäßiges Waschen: Zu viele oder zu lange Waschschritte könnten die gebundenen Antikörper abspülen.
• Schwache Fluorochrom-Intensität: Das verwendete Fluorochrom könnte eine geringe Helligkeit aufweisen.
• Photobleaching: Das Fluorochrom könnte während der Probenvorbereitung oder Bildaufnahme photobleached (ausgebleicht) sein.
• Technische Probleme mit dem Mikroskop: Die Einstellungen oder der Zustand des Fluoreszenzmikroskops könnten suboptimal sein.

• Schritte zur Verbesserung der Signalstärke:

• Optimierung der Primärantikörperkonzentration: Führe Titrationsstudien durch, um die optimale Konzentration des Primärantikörpers zu bestimmen.
• Verlängerung der Inkubationszeit: Erhöhe die Inkubationszeiten für die Primär- und Sekundärantikörper, um eine bessere Bindung zu ermöglichen.
• Überprüfung der Antikörperqualität: Verwende frische, funktionsfähige Antikörper und überprüfe das Haltbarkeitsdatum.
• Erhöhung der Sekundärantikörperkonzentration: Führe eine Titration des Sekundärantikörpers durch, um die optimale Konzentration zu ermitteln.
• Reduktion der Waschzyklen: Reduziere die Anzahl und Dauer der Waschzyklen, um zu vermeiden, dass gebundene Antikörper abgelöst werden.
• Verwendung eines intensiveren Fluorochroms: Wähle ein alternatives Fluorochrom mit höherer Fluoreszenzintensität oder einer längeren Lebensdauer.
• Vermeidung von Photobleaching: Arbeite zügig und unter minimaler Beleuchtung, um das Ausbleichen des Fluorochroms zu reduzieren.
• Überprüfung des Mikroskops: Stelle sicher, dass das Mikroskop korrekt eingestellt und gewartet ist, insbesondere die Lampenintensität und die Filter.

d)

• Stelle den vollständigen Ablauf eines immunhistochemischen Färbeexperiments dar, das den Farbstoff DAB verwendet. Beginne bei der Fixierung des Gewebes und gehe auf die Schritte der Antikörperinkubation und Färbung ein. Beschreibe außerdem, wie das Ergebnis visuell interpretiert werden kann.

Lösung:

• Vollständiger Ablauf eines immunhistochemischen Färbeexperiments mit DAB:

• 1. Fixierung des Gewebes:
• Fixiere das Gewebe in Formalin oder einem anderen geeigneten Fixativ, um die Proteine zu stabilisieren und die Zellstruktur zu erhalten.
• Wasche das Gewebe gründlich, um überschüssiges Fixativ zu entfernen.
• 2. Einbettung und Schneiden:
• Bette das fixierte Gewebe in Paraffin ein, um es für das Schneiden zu stabilisieren.
• Schneide dünne Gewebeschnitte (z. B. 4-5 µm) mit einem Mikrotom und bringe sie auf Objektträgern auf.
• 3. Rehydrierung:
• Deparaffiniere die Gewebeschnitte durch Inkubation in aufeinanderfolgenden Xylolbädern.
• Rehydriere die Schnitte durch eine absteigende Alkoholreihe (z. B. 100%, 95%, 70% Ethanol) bis hin zu Wasser.
• 4. Antigen-Retrieval:
• Erhitze die Gewebeschnitte in einer Pufferlösung (z. B. Citrate-Puffer) in der Mikrowelle oder einem Wasserbad, um die Maskierung der Epitope durch Fixierung zu lösen.
• Lasse die Schnitte auf Raumtemperatur abkühlen und wasche sie mit PBS (phosphatgepufferte Salzlösung).
• 5. Blockierung:
• Inkubiere die Gewebeschnitte in einer Blockierungslösung (z. B. normale Serumlösung oder BSA), um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
• Wasche die Schnitte kurz mit PBS.
• 6. Primärantikörper-Inkubation:
• Inkubiere die Gewebeschnitte mit dem Primärantikörper, der spezifisch an das Zielprotein bindet. Dies erfolgt normalerweise über Nacht bei 4 °C.
• Wasche die Schnitte gründlich mit PBS, um nicht gebundene Primärantikörper zu entfernen.
• 7. Sekundärantikörper-Inkubation:
• Inkubiere die Schnitte mit einem Enzym-konjugierten Sekundärantikörper (z. B. mit Horseradish Peroxidase, HRP), der an den Primärantikörper bindet.
• Wasche die Schnitte erneut gründlich mit PBS.
• 8. Enzymatische Reaktion mit DAB:
• Inkubiere die Gewebeschnitte mit der DAB-Lösung (3,3'-Diaminobenzidin). DAB wird durch das Enzym (HRP) zu einem braunen Farbstoff umgewandelt, der das Zielprotein sichtbar macht.
• Entwicklungsdauer sorgfältig beobachten, um eine Überfärbung zu vermeiden, und die Reaktion durch Waschen mit Wasser stoppen.
• 9. Gegenfärbung (optional):
• Färbe die Gewebeschnitte leicht mit Hämatoxylin, um die Zellkerne blau darzustellen.
• Wasche die Schnitte erneut mit Wasser.
• 10. Dehydrierung und Eindeckung:
• Dehydriere die Schnitte durch eine aufsteigende Alkoholreihe (z. B. 70%, 95%, 100% Ethanol) und anschließend Xylol.
• Decke die Schnitte mit einem geeigneten Deckmittel ein.

• Visuelle Interpretation:

• Betrachte die gefärbten Gewebeschnitte unter einem Lichtmikroskop. Die Bereiche, in denen das Zielprotein vorhanden ist, erscheinen braun aufgrund der DAB-Färbung.
• Die Gegenfärbung mit Hämatoxylin zeigt die Zellkerne blau, was eine klare Unterscheidung zwischen den gefärbten Bereichen (Zielprotein) und den restlichen Gewebestrukturen ermöglicht.
• Die Intensität der braunen Färbung gibt Hinweise auf die Menge des vorhandenen Zielproteins.

Aufgabe 3)

Du arbeitest in einem Pflanzenphysiologie-Labor und wirst gebeten, die biolistische Methode zur Transformation von Pflanzenzellen zu nutzen. Du verwendest Goldpartikel, die mit einer Plasmid-DNA beschichtet sind, um eine schwer transformierbare Pflanzenart gentechnisch zu modifizieren. Das Ziel ist es, eine stabile Genexpression in dieser Pflanze zu etablieren.

a)

Erkläre den Prozess der Vorbereitung von DNA-beschichteten Goldpartikeln. Welche Schritte sind notwendig und welche Materialien werden benötigt?

Lösung:

Vorbereitung von DNA-beschichteten Goldpartikeln:

• Materialien:
  • Goldpartikel (0,6-1,6 µm Durchmesser)
  • Plasmid-DNA
  • CaCl2 (Calciumchlorid)
  • Spermidin
  • Ethanol (70% und 100%)
  • Ultrareines Wasser
  • Mikrozentrifugenröhrchen
  • Vortexmischer
  • Zentrifuge
• Prozess:
  1. Goldpartikel vorbereiten:
     • Suspension der Goldpartikel in ultrareinem Wasser herstellen.
     • Goldpartikel durch kurzes Vortexen homogenisieren.
     • Die Goldpartikel durch Zentrifugation (ca. 5 Minuten bei 10.000 g) pelletieren.
     • Das Überstand entfernen und die Goldpartikel mit 70% Ethanol waschen. Schritt zwei- bis dreimal wiederholen.
     • Abschließend die Goldpartikel zweimal mit ultrareinem Wasser waschen.
  2. DNA-Beschichtung:
     • Goldpartikel in einem Mikrozentrifugenröhrchen resuspendieren.
     • Eine definierte Menge plasmidische DNA zur Goldpartikelsuspension hinzufügen.
     • CaCl2-Lösung und Spermidin-Lösung der Mischung hinzufügen und kurz vortexen, um die Komponenten zu homogenisieren.
     • Die Suspension ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die DNA-Beschichtung der Goldpartikel zu ermöglichen.
     • Die Goldpartikel durch Zentrifugation pelletieren.
     • Ungebundene DNA und Chemikalien durch vorsichtiges Waschen des Pellets mit 100% Ethanol entfernen.
     • Gold-DNA-Partikel in einem kleinen Volumen 100% Ethanol resuspendieren.

b)

Berechne die Geschwindigkeit, mit der die Goldpartikel auf die Zielzellen geschossen werden müssen, um eine effektive Transformation zu gewährleisten. Angenommen, die Goldpartikel müssen eine Geschwindigkeit von 400 m/s erreichen. Nutze die kinetische Energieformel \[ E = \frac{1}{2}mv^2 \] um die Energie zu berechnen, die auf die Partikel übertragen werden muss, wenn die Masse eines einzelnen Partikels 20 µg beträgt.

Lösung:

Um die Energie zu berechnen, die den Goldpartikeln übertragen werden muss, verwenden wir die kinetische Energieformel:

• Formel: \[E = \frac{1}{2}mv^2\]
• Gegebene Werte:
  • Geschwindigkeit (v): 400 m/s
  • Masse (m): 20 µg = 20 \times 10^{-6} g = 20 \times 10^{-9} kg
• Berechnung der Energie (E): Durch Einsetzen der Werte in die Formel erhalten wir: \[E = \frac{1}{2} \times 20 \times 10^{-9} \text{ kg} \times (400 \text{ m/s})^2\]
• Punktweise Berechnung:
  • Schritt 1: Berechne \[v^2\] \[(400 \text{ m/s})^2 = 160000 \text{ m}^2/\text{s}^2\]
  • Schritt 2: Berechne \[m \times v^2\] \[20 \times 10^{-9} \text{ kg} \times 160000 \text{ m}^2/\text{s}^2 = 3,2 \times 10^{-3} \text{ kg} \text{ m}^2/\text{s}^2 (Joule)\]
  • Schritt 3: Halbieren des Wertes \[\frac{3,2 \times 10^{-3}}{2} = 1,6 \times 10^{-3} \text{ Joule}\]
  • Ergebnis: Die Energie, die auf die Partikel übertragen werden muss, um eine Geschwindigkeit von 400 m/s zu erreichen, beträgt \[1,6 \times 10^{-3} \text{ Joule}\].

c)

Diskutiere die Herausforderungen und Limitationen der biolistischen Methode für die Transformation von Pflanzenzellen. Welche Alternativen gibt es und in welchen Szenarien sind diese möglicherweise bevorzugt?

Lösung:

Herausforderungen und Limitationen der biolistischen Methode:

• Physische Schäden: Goldpartikel können die Pflanzenzellen physisch schädigen, was zu einer geringen Überlebensrate führen kann.
• Geringe Transformationseffizienz: Nicht alle Zellen, die mit Goldpartikeln beschossen werden, nehmen die DNA erfolgreich auf und integrieren sie stabil in ihr Genom.
• Kostspielig: Die Verwendung von Goldpartikeln und die speziellen Geräte zur Durchführung der biolistischen Methode können teuer sein.
• Komplexe Protokolle: Die Vorbereitung der DNA-beschichteten Partikel und die Durchführung des Beschusses erfordert sorgfältige Optimierung und Präzision.

Alternativen zur biolistischen Methode:

• Agrobacterium-vermittelte Transformation:
  • Vorteile: Höhere Effizienz bei der Transformation, geringere physische Schäden an den Zellen, kostengünstiger und einfacher in der Handhabung.
  • Nachteile: Nicht alle Pflanzenarten oder Zelltypen sind für diese Methode geeignet. Generell wirkt diese Methode besser bei dikotylen Pflanzen und weniger gut bei monokotylen Pflanzen.
• Protoplastentransformation:
  • Vorteile: Hohe Effizienz bei der Aufnahme von DNA in isolierte Protoplasten.
  • Nachteile: Isolierung und Regeneration von Protoplasten kann technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig sein.
• CRISPR/Cas9-Methoden:
  • Vorteile: Präzise und zielgerichtete Modifikation des Genoms, hoher Spezifizität und Anpassungsfähigkeit.
  • Nachteile: Komplexe Design- und Optimierungsanforderungen, ethische Bedenken und regulatorische Hürden können eine Rolle spielen.

Bevorzugte Szenarien für Alternativen:

• Agrobacterium-vermittelte Transformation: Ideal für Transformationen bei dikotylen Pflanzen oder bei Experimenten, die eine hohe Transformationseffizienz und geringere Zellschäden erfordern.
• Protoplastentransformation: Geeignet für Forschungen auf zellulärer Ebene oder bei Pflanzenarten, bei denen die Regeneration von Protoplasten gut etabliert ist.
• CRISPR/Cas9-Methoden: Besonders vorteilhaft für spezifische, gezielte Genom-Modifikationen und für fortgeschrittene genetische Studien.

d)

Beschreibe den Prozess der Selektion und Überprüfung der transformierten Pflanzenzellen. Welche Methoden können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Fremd-DNA erfolgreich in das pflanzliche Genom integriert wurde und stabile Genexpression erfolgt?

Lösung:

Prozess der Selektion und Überprüfung der transformierten Pflanzenzellen:

• 1. Selektion der transformierten Zellen: Die Selektion erfolgt oft durch ein Selektionsmedium, das ein Antibiotikum oder Herbizid enthält, gegen das die transformierten Zellen resistent sein sollten. Zu den Schritten gehören:
  • Antibiotikum/Herbizid-Resistenz: Plasmide enthalten oft Resistenzgene (z.B. Kanamycin- oder Hygromycin-Resistenz). Nur transformierte Zellen überleben auf dem Selektionsmedium.
  • Selektion auf Medium: Kultiviere die Zellen auf einem selektiven Nährmedium und isoliere die überlebenden Zellkolonien.
• 2. Bestätigung der Integration der Fremd-DNA:
  • Polymerase-Kettenreaktion (PCR):
    • Isoliere die DNA aus den transformierten Pflanzenzellen.
    • Verwende spezifische Primer, die an das Insert- und Flanking-Regionen binden.
    • Führe PCR durch und überprüfe die Amplifikationsprodukte durch Gel-Elektrophorese.
  • Southern Blot:
    • Isoliere die genomische DNA der Pflanzen.
    • Schneide die DNA mit Restriktionsenzymen.
    • Trenne die DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese und transferiere sie auf eine Membran.
    • Hybridisiere die Membran mit einer markierten Sonde, die spezifisch für die Fremd-DNA ist.
    • Nachweis der Bandenmuster zeigt die Integration der Fremd-DNA an.
• 3. Überprüfung der Genexpression:
  • Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR):
    • Isoliere mRNA aus den transformierten Pflanzenzellen.
    • Reverse Transkription zur Herstellung von cDNA.
    • Führe spezifische PCR für das Gen durch und überprüfe die Amplifikation.
  • Quantitative PCR (qPCR):
    • Nutze fluoreszenzbasierte qPCR, um die Menge der mRNA des eingeführten Gens zu quantifizieren.
  • GFP-Reporter-Gene:
    • Füge ein GFP (Green Fluorescent Protein) an das Genkonstrukt an.
    • Überprüfe die transformierten Pflanzen unter einem Fluoreszenzmikroskop auf GFP-Expression.
  • Western Blot:
    • Isoliere Proteine aus den transformierten Pflanzenzellen.
    • Trenne die Proteine durch SDS-PAGE.
    • Übertrage die Proteine auf eine Membran.
    • Nutze spezifische Antikörper, um das Protein des eingeführten Gens zu detektieren.

Aufgabe 4)

Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Laserscanning-Mikroskopie

Fluoreszenzmikroskopie ist eine Technik zur Visualisierung von Strukturen in Zellen mittels Fluoreszenzfarbstoffen und UV-Licht. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) ist eine Erweiterung der Fluoreszenzmikroskopie, die durch punktuelles Beleuchten und Detektieren optische Schnitte ermöglicht.

• Fluoreszenzmikroskopie nutzt Fluorophore zur Markierung spezifischer Moleküle.
• Es wird UV-Licht verwendet, um Fluorophore zu erregen.
• Emission von Licht mit längeren Wellenlängen (niedriger Energie) wird detektiert.
• CLSM verbessert die Auflösung und den Kontrast, indem sie Störsignale außerhalb des Fokus eliminiert.
• CLSM erzeugt optische Schnitte durch punktuelles Scannen der Probe mit einem Laser und Detektion durch eine Pinhole-Öffnung.
• Ermöglicht 3D-Rekonstruktionen durch Aufnahme mehrerer Schichten.

a)

Erkläre den funktionellen Unterschied zwischen der Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM). Gehe dabei auf die Beleuchtungs- und Detektionsmethoden ein und beschreibe, wie CLSM die Auflösung und den Kontrast im Vergleich zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie verbessert.

Lösung:

Funktioneller Unterschied zwischen der Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM)

1. Fluoreszenzmikroskopie

• Beleuchtungsmethode: Fluoreszenzmikroskopie nutzt UV-Licht, um Fluorophore zu erregen. Diese Fluorophore sind spezifische Moleküle, die an Zielstrukturen in Zellen gebunden sind.
• Detektionsmethode: Die emittierte Fluoreszenz, die eine längere Wellenlänge (und somit eine niedrige Energie) als das anregende Licht hat, wird detektiert. Hierbei wird oft ein Filter verwendet, um das anregende Licht von der emittierten Fluoreszenz zu trennen.
• Vorteile: Ermöglicht die Visualisierung spezifischer Moleküle innerhalb der Zelle.
• Nachteile: Begrenzte Auflösung und Kontrast, da Fluoreszenzsignale von außerhalb des Fokus (unscharfen Ebenen) nicht eliminiert werden.

2. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM)

• Beleuchtungsmethode: CLSM verwendet einen fokussierten Laserstrahl, der punktuell die Probe beleuchtet. Dies geschieht durch schrittweises Scannen der Probe, typischerweise in einem Rastermuster.
• Detektionsmethode: Das emittierte Fluoreszenzsignal wird durch eine Pinhole-Öffnung detektiert. Dies eliminiert unscharfe Signale von außerhalb des Fokus, wodurch nur das Licht von der fokussierten Ebene erfasst wird.
• Vorteile: Erhöhte Auflösung und Kontrast durch Eliminierung von Streulicht und Verbesserung der Fokussierung. Dies ermöglicht auch die Aufnahme optischer Schnitte, die für die 3D-Rekonstruktion der Proben verwendet werden können.
• Nachteile: Aufwendigere und teurere Technik im Vergleich zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie.

Zusammenfassend verbessert CLSM die Auflösung und den Kontrast im Vergleich zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie durch die punktuelle Beleuchtung und die Detektion durch eine Pinhole-Öffnung. Dies ermöglicht die Aufnahme präziser optischer Schnitte und die Erstellung von 3D-Rekonstruktionen.

b)

Diskutiere die Vorteile der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) für die Erstellung von 3D-Rekonstruktionen. Welche Eigenschaften der CLSM ermöglichen diese Funktion und wie wird die optimale Bildqualität erreicht?

Lösung:

Vorteile der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) für die Erstellung von 3D-Rekonstruktionen

Die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) bietet mehrere signifikante Vorteile bei der Erstellung von 3D-Rekonstruktionen biochemischer Proben. Im Folgenden werden die Hauptvorteile und die Eigenschaften der CLSM, die diese Funktion ermöglichen, diskutiert:

• Erzeugung optischer Schnitte: Eine der herausragenden Eigenschaften der CLSM ist die Fähigkeit, optische Schnitte zu erzeugen. Dies geschieht durch punktuelles Scannen der Probe mit einem Laser und die Detektion des emittierten Lichts durch eine Pinhole-Öffnung. Dies ermöglicht die Abbildung einzelner, fokussierter Schichten der Probe.
• Eliminierung von Störsignalen: Die Pinhole-Öffnung im Detektor blockiert die Fluoreszenzemissionen von außerhalb des Fokus. Dadurch werden unscharfe Signale eliminiert, was zu einer erheblich verbesserten Bildqualität und Klarheit führt. Dies ist besonders wichtig für die Erstellung präziser 3D-Rekonstruktionen.
• Höhere Bildauflösung und Kontrast: Durch die punktuelle Beleuchtung und die schrittweise Erfassung von Daten punktenweise innerhalb der Probe kann die CLSM eine höhere Bildauflösung und besseren Kontrast als die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie erreichen. Dies ist essentiell für detailreiche 3D-Darstellungen.
• Akkurate Tiefeninformationen: Da die CLSM Schicht für Schicht detaillierte Informationen erfasst, können genaue Tiefeninformationen gewonnen werden. Diese sind notwendig für die Erstellung exakter 3D-Modelle der Probe.
• Vielseitige Anwendungsmöglichkeiten: Die CLSM kann auf eine Vielzahl von Proben angewendet werden, einschließlich lebender Zellen, Gewebeschnitten und anderen biologischen Proben. Dies ermöglicht Forschern, dreidimensionale Strukturen in einer Vielzahl von biologischen Kontexten zu untersuchen.

Optimierung der Bildqualität: Um die optimale Bildqualität in der CLSM zu erreichen, sollten folgende Faktoren berücksichtigt werden:

• Laserleistung und -einstellung: Die Wahl der richtigen Laserleistung und die genaue Fokussierung sind entscheidend für die Klarheit und Präzision der einzelnen Schichten.
• Pinhole-Größe: Die Größe der Pinhole-Öffnung beeinflusst die Bildqualität. Eine kleinere Pinhole-Größe erhöht die Bildauflösung, kann jedoch die Signalstärke verringern.
• Kalibrierung und Abstimmung: Regelmäßige Kalibrierung und präzise Abstimmung des Mikroskops sind unerlässlich, um die beste Bildqualität zu gewährleisten.
• Software-Analyse: Die Verwendung von fortschrittlicher Software zur Bildaufnahme und Analyse kann dazu beitragen, die schichtweise erfassten Daten optimal für 3D-Rekonstruktionen zu nutzen.

Zusammenfassend ermöglicht die konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) durch ihre Fähigkeit zur Erzeugung präziser optischer Schnitte, zur Eliminierung von Störsignalen und zur Erzielung hoher Auflösung und Kontrast die Erstellung detaillierter und exakter 3D-Rekonstruktionen. Durch die richtige Einstellung und Kalibrierung des Systems sowie die Nutzung von Software-Analyse kann die optimale Bildqualität erreicht werden.

d)

Vergleiche die Möglichkeit, Hintergrundsignale bei der Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) zu eliminieren. Welcher Mechanismus der CLSM trägt am meisten zur Reduktion unerwünschter Hintergrundsignale bei?

Lösung:

Vergleich der Möglichkeit, Hintergrundsignale bei der Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) zu eliminieren

Der Umgang mit Hintergrundsignalen ist ein entscheidender Aspekt beim Erreichen einer hohen Bildqualität in der Mikroskopie. Im Folgenden wird der Vergleich zwischen der klassischen Fluoreszenzmikroskopie und der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) hinsichtlich der Reduktion von Hintergrundsignalen dargestellt:

Fluoreszenzmikroskopie

• Beleuchtungsmethode: Die gesamte Probe wird gleichmäßig mit UV-Licht beleuchtet, um die Fluorophore zu erregen.
• Hintergrundsignale: Da die Mikroskopie bei der Fluoreszenzmikroskopie nicht fokussiert ist, treten oft unscharfe Signale von außerhalb des Fokus der beobachteten Ebene auf. Diese Streulicht-Signale tragen zu unerwünschten Hintergrundsignalen bei.
• Reduktion: Filtertechniken können verwendet werden, um das anregende Licht vom emittierten Licht zu trennen, jedoch wird dadurch nicht das gesamte Hintergrundrauschen eliminiert.

Konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM)

• Beleuchtungsmethode: Ein fokussierter Laserstrahl wird punktuell durch die Probe gescannt, was die Präzision der Beleuchtung deutlich erhöht.
• Hintergrundsignale: Die Hintergrundsignale werden erheblich reduziert, weil nur Licht von der Fokalebene durch das Pinhole detektiert wird, während Streulicht und Signale von außerhalb der Fokalebene blockiert werden.
• Reduktion: Der Mechanismus der Pinhole-Öffnung trägt am meisten zur Reduktion unerwünschter Hintergrundsignale bei. Er selektiert nur das Licht, das von der fokussierten Ebene kommt, und eliminiert das Licht, das aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Fokus-Ebene stammt.

Zusammenfassend: Die CLSM bietet eine signifikant bessere Elimination von Hintergrundsignalen im Vergleich zur klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Der entscheidende Mechanismus der CLSM, der zur Reduktion unerwünschter Hintergrundsignale beiträgt, ist die Pinhole-Öffnung, die das Streulicht und die Signale von außerhalb des Fokus blockiert. Dies führt zu einer höheren Auflösung und einem besseren Kontrast im endgültigen Bild.