Fachmodul Pharmazeutische Biologie I - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest im Labor und erhältst eine pflanzliche Droge, die Du auf ihre Authentizität und Qualität überprüfen sollst. Um eine fundierte Analyse durchzuführen, sind verschiedene Methoden erforderlich. Deine Aufgabe ist es, sowohl makroskopische als auch mikroskopische Eigenschaften der Droge zu untersuchen, chemotaxonomische Marker zu identifizieren und chromatographische sowie spektroskopische Methoden zu nutzen, um die Droge vollständig zu charakterisieren.

a)

Makroskopische und Mikroskopische Untersuchung: Beschreibe ausführlich die makroskopischen Eigenschaften (Form, Farbe, Geruch, Beschaffenheit) und die mikroskopischen Strukturen (Zellwände, Trichome, Stomata) der erhaltenen pflanzlichen Droge. Erkläre dabei, wie diese Beobachtungen zur Identifikation der Pflanze beigetragen haben und welche spezifischen Details darauf hinweisen, dass die Droge authentisch ist.

Lösung:

Makroskopische und Mikroskopische Untersuchung:

Um die Authentizität und Qualität der erhaltenen pflanzlichen Droge zu überprüfen, ist eine detaillierte makroskopische und mikroskopische Untersuchung unerlässlich. Hierbei beschreiben wir die makroskopischen Eigenschaften (Form, Farbe, Geruch, Beschaffenheit) sowie die mikroskopischen Strukturen (Zellwände, Trichome, Stomata) der Droge. Dabei wird erklärt, wie diese Eigenschaften zur Identifikation der Pflanze beitragen und welche spezifischen Details auf ihre Authentizität hinweisen.

• Makroskopische Eigenschaften:
  • Form: Die Droge zeigt eine charakteristische Form, die typisch für die untersuchte Pflanze ist. Beispielsweise können Blätter eine lanzettliche Form haben, während Samen rund oder oval sein können.
  • Farbe: Die natürliche Farbe ist ein wichtiger Hinweis auf die Authentizität. Frisches Pflanzenmaterial hat meist eine grüne bis braune Farbe, je nach Pflanzenteil und Trocknungsgrad.
  • Geruch: Der Geruch der Droge ist spezifisch und kann aromatisch, süßlich, bitter oder auch unangenehm sein. Dieser olfaktorische Eindruck dient oft als erster Hinweis auf die Pflanzenart.
  • Beschaffenheit: Die Textur der Droge, ob sie ledrig, weich oder hart ist, gibt weitere Hinweise auf ihre Identität und Qualität.
• Mikroskopische Strukturen:
  • Zellwände: Unter dem Mikroskop kann die Untersuchung der Zellwände wichtige Erkenntnisse über die Struktur und Zusammensetzung der Pflanze liefern. Dies kann die Dicke der Zellwände, das Vorhandensein bestimmter Zelltypen (z.B. Parenchym-, Sklerenchymzellen) und das Muster der Zellwandverdickung beinhalten.
  • Trichome: Diese haarähnlichen Strukturen auf der Oberfläche der Pflanzenorgane sind oft diagnostisch und können je nach Pflanze unterschiedlich geformt sein (z.B. drüsig, nicht-drüsig, ein- oder mehrzellig).
  • Stomata: Die Untersuchung der Spaltöffnungen (Stomata) kann ebenfalls diagnostische Hinweise liefern. Hierbei wird die Anordnung, Größe und der Typ der Stomata (z.B. anomocytisch, diacytisch) betrachtet.

Die genannten makroskopischen und mikroskopischen Merkmale tragen erheblich zur Identifikation der Pflanze bei. Beispielsweise können die spezifische Form und Farbe der Blätter in Kombination mit der Mikroskopie der Trichome und Zellwände eine eindeutige Bestimmung ermöglichen. Diese spezifischen Details weisen darauf hin, dass die Droge authentisch ist, wenn sie mit den bekannten Standards für die entsprechende Pflanzenart übereinstimmen.

b)

Chemotaxonomische und Chromatographische Analyse: Als nächstes analysierst Du die chemischen Profile und Marker der Droge mit Hilfe von HPLC oder GC. Beschreibe den Prozess detailliert und erkläre, wie diese Methoden zur Trennung und Identifizierung der Inhaltsstoffe beitragen. Führe die Analyseergebnisse aus und diskutier folgendes:

• Was sind die charakteristischen chemischen Marker, die Du identifiziert hast?
• Wie tragen diese Marker zur Bestimmung der Qualität und Authentizität der Droge bei?
• Zeige ein Beispiel aus der Literatur, wo HPLC oder GC zur Identifizierung einer ähnlichen pflanzlichen Droge erfolgreich angewendet wurde.

Erstelle eine graphische Darstellung (Chromatogramm) der Hauptinhaltsstoffe und interpretiere das Ergebnis. Berechne die Retentionszeiten und die Verteilung der Inhaltsstoffe in Prozent.

Lösung:

Chemotaxonomische und Chromatographische Analyse:

Um die chemischen Profile und Marker der pflanzlichen Droge zu analysieren, verwenden wir hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Gaschromatographie (GC). Diese Methoden sind hervorragend geeignet, um die Inhaltsstoffe einer Droge zu trennen und zu identifizieren.

Prozessbeschreibung:

• Probenvorbereitung: Die Droge wird fein zerkleinert und in einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert (z.B. Methanol, Ethanol oder Wasser). Der Extrakt wird anschließend gefiltert und ggf. weiter gereinigt.
• HPLC/GC-Analyse: Der vorbereitete Extrakt wird in das HPLC- bzw. GC-System injiziert.
• Trennung der Inhaltsstoffe:
  • HPLC-Prozess: Eine flüssige mobile Phase (Mix aus Lösungsmitteln) wird unter hohem Druck durch eine mit festem Material gefüllte Säule (stationäre Phase) gepumpt. Verschiedene Substanzen in der Probe wandern unterschiedlich schnell durch die Säule, was zu ihrer Trennung führt.
  • GC-Prozess: Die Probe wird in eine beheizte Injektionskammer injiziert, wo sie verdampft. Ein Trägergas (z.B. Helium) transportiert die verdampften Proben durch eine mit flüssiger stationärer Phase beschichtete Säule.
• Detektion und Identifizierung: Die getrennten Inhaltsstoffe werden mit Detektoren (z.B. UV-Detektor in HPLC, FID-Detektor in GC) erkannt und ihre Signale aufgezeichnet. Dies resultiert in einem Chromatogramm, das die einzelnen Komponenten darstellt.

Analyseergebnisse:

• Charakteristische chemische Marker: Durch die chromatographische Analyse wurden spezifische Marker identifiziert, wie Alkaloide, Flavonoide oder Terpene, die charakteristisch für die untersuchte Pflanze sind.
• Qualität und Authentizität: Diese Marker sind entscheidend für die Bestimmung der Qualität und Authentizität der Droge. Ihre Anwesenheit und Konzentration müssen den bekannten Profilen der Pflanze entsprechen, um eine Verfälschung auszuschließen.
• Literaturbeispiel: Ein Beispiel aus der Literatur zeigt die erfolgreiche Anwendung von HPLC zur Identifizierung von Ginseng. In einer Studie wurde HPLC genutzt, um die spezifischen Ginsenoside in verschiedenen Ginseng-Proben zu identifizieren und zu quantifizieren.

Graphische Darstellung und Interpretation: Das resultierende Chromatogramm zeigt Peaks, die verschiedene Hauptinhaltsstoffe darstellen. Jede Spitze im Chromatogramm steht für eine Substanz, die zu einem bestimmten Zeitpunkt (Retentionszeit) detektiert wurde.

Beispiel für die Berechnung:

• Retentionszeiten: Der erste Hauptpeak bei 5 Minuten Retentionszeit könnte auf ein Flavonoid hindeuten, während andere Peaks später im Chromatogramm andere Substanzen wie Alkaloide und Terpene anzeigen.
• Verteilung der Inhaltsstoffe: Wenn der Hauptpeak 60% der Gesamtfläche ausmacht und der zweite Peak 30%, dann weist die Verteilung der Inhaltsstoffe darauf hin, dass der erste Hauptstoff dominanter ist.

Zusammenfassend tragen chemotaxonomische Marker und chromatographische Methoden erheblich zur Bestimmung der Qualität und Authentizität der Droge bei. Durch den Vergleich mit bekannten Standards kann die Echtheit der Droge verifiziert werden, was für pharmazeutische Anwendungen unerlässlich ist.

Aufgabe 2)

Ein Pharmaunternehmen möchte einen neuen natürlichen Arzneistoff aus der Wurzel einer Heilpflanze extrahieren und analysieren. Der Fokus liegt dabei auf der Bestimmung und Quantifizierung des Hauptwirkstoffs sowie der Untersuchung der Pflanzenmatrix. Du wurdest beauftragt, einen analytischen Plan zu erstellen, der die notwendigen Schritte zur Identifizierung und Quantifizierung des Wirkstoffs umfasst. Neben chemischen Analysen sollen auch mikroskopische und biologische Tests durchgeführt werden.

a)

Erstelle einen detaillierten analytischen Plan zur Bestimmung und Quantifizierung des Hauptwirkstoffs aus der Wurzel der Heilpflanze. Dieser Plan sollte die folgenden Aspekte beinhalten:

• Methode zur Probenvorbereitung - Beschreibung der nötigen Extraktions- und Reinigungsverfahren.
• Wahl geeignetes chromatographische Methode (HPLC, GC oder DC). Begründe deine Wahl und beschreibe den Verfahrensablauf.
• Geeignetes spektroskopisches Verfahren zur Identifizierung des Hauptwirkstoffs. Begründe deine Wahl.
• Quantitative Analyse - Erkläre, wie Du eine Kalibrierkurve erstellst und die Konzentration des Wirkstoffs bestimmst.

Lösung:

Ein analytischer Plan zur Bestimmung und Quantifizierung des Hauptwirkstoffs aus der Wurzel einer Heilpflanze könnte wie folgt aussehen:

• Methode zur Probenvorbereitung:Für die Probenvorbereitung müssen die folgenden Schritte durchgeführt werden:
  • Extraktion: Die Wurzeln der Heilpflanze werden zunächst getrocknet und pulverisiert. Anschließend erfolgt die Extraktion des Hauptwirkstoffs mittels einer geeigneten Lösungsmittelkombination (z.B. Methanol, Ethanol oder Wasser). Dies kann durch Soxhlet-Extraktion oder Ultraschallextraktion geschehen.
  • Filtration: Die extrahierte Lösung wird gefiltert, um unlösliche Partikel zu entfernen.
  • Konzentrierung: Die filtrierte Lösung wird unter Vakuum eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen und den Wirkstoff zu konzentrieren.
  • Reinigung: Die Konzentration des Hauptwirkstoffs kann durch Flüssig-Flüssig-Extraktion oder Festphasenextraktion weiter gereinigt werden, um Verunreinigungen zu entfernen.
• Wahl geeigneter chromatographischer Methode:Für die Trennung und Analyse des Hauptwirkstoffs wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) empfohlen. HPLC bietet hohe Auflösung, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie die Möglichkeit, eine Vielzahl von Verbindungen zu trennen und zu analysieren. Der Verfahrensablauf für HPLC umfasst:
  • Vorbereitung der mobilen Phase (z.B. acetonitril/ Wasser-Gemisch).
  • Injektion der gereinigten Probe in die HPLC-Säule.
  • Trennung der Bestandteile der Probe auf der HPLC-Säule.
  • Detektion des Hauptwirkstoffs mit einem geeigneten Detektor (z.B. DAD, FLD oder MS).
• Geeignetes spektroskopisches Verfahren zur Identifizierung des Hauptwirkstoffs:Die Massenspektrometrie (MS) wird empfohlen. MS eignet sich hervorragend, um die molekulare Struktur des Wirkstoffs zu identifizieren, da sie genaue Informationen über die Molekülmasse und die Struktur liefert.
  • HPLC-MS (Kopplung von HPLC mit Massenspektrometrie) kann verwendet werden, um den Wirkstoff während und nach der Trennung direkt zu identifizieren.
  • Alternativ kann NMR (Kernspinresonanzspektroskopie) ergänzend zur MS eingesetzt werden, um detaillierte strukturelle Informationen zu liefern.
• Quantitative Analyse:Um die Konzentration des Wirkstoffs in der Probe zu bestimmen, kann eine Kalibrierkurve erstellt werden.
  • Bereite Standardlösungen des Hauptwirkstoffs in verschiedenen bekannten Konzentrationen vor.
  • Messe die Peaks dieser Standardlösungen mit dem HPLC-Detektor.
  • Erstelle eine Kalibrierkurve, indem Du die Peakflächen (Integrale) gegen die Konzentrationen der Standards aufträgst.
  • Analysiere die Probe und ermittle die Peakfläche des Hauptwirkstoffs.
  • Bestimme die Konzentration des Wirkstoffs in der Probe durch Vergleich der Peakfläche mit der Kalibrierkurve.

b)

Neben der chemischen Analyse sollen auch mikroskopische und biologische Tests durchgeführt werden. Beschreibe die mikroskopischen Untersuchungen, die dazu beitragen können, die Authentizität der Pflanzenprobe sicherzustellen. Anschließend diskutiere die Durchführung eines in-vitro Bioassays zur Bestätigung der biologischen Aktivität des Hauptwirkstoffs. Wie würdest du die Ergebnisse dieser Tests interpretieren und in welchem Verhältnis stehen sie zur chemischen Analyse?

Lösung:

Mikroskopische Untersuchungen zur Sicherstellung der Authentizität der Pflanzenprobe:

• Gewebeschnittanalyse:
  • Schneide dünne Querschnitte aus der Wurzel der Pflanze und mache daraus mikroskopische Präparate.
  • Färbe diese Präparate mit geeigneten Färbemitteln (z.B. Safranin, Alcianblau) und untersuche sie unter einem Lichtmikroskop.
  • Analysiere die spezifischen Gewebestrukturen wie Gefäßbündel, Parenchym und Epidermis, die charakteristisch für die Heilpflanze sind.
• Pollenanalyse:Unter die Lupe nehmen der Pollenstruktur der Pflanze, da Pollen oft artspezifisch sind:
  • Isoliere Pollen aus der Pflanze und bereite mikroskopische Präparate vor.
  • Vergleiche die morphologischen Eigenschaften der Pollen (Größe, Form, Oberflächenstruktur) mit bekannten Referenzdaten der Heilpflanze.
• Stärke- und Zellinhaltsstoffe:Untersuche das Vorhandensein und die Struktur von Stärkekörnern und anderen Zellinhaltsstoffen:
  • Behandle die Pflanzenschnitte mit Jodlösung, um Stärkekörner sichtbar zu machen.
  • Verwende Polarisationsmikroskopie zur Identifizierung von Kristallen und Inkrustierungen im pflanzlichen Gewebe.

Durchführung eines in-vitro Bioassays zur Bestätigung der biologischen Aktivität des Hauptwirkstoffs:

• Vorbereitung der Zellkulturen:
  • Wähle eine geeignete Zelllinie (z.B. eine Krebszelllinie, falls die antitumorale Aktivität getestet werden soll).
  • Kultiviere die Zellen unter optimalen Bedingungen (z.B. geeignete Temperatur, CO₂-Konzentration, Nährmedien).
• Behandlung der Zellkulturen mit dem Wirkstoff:
  • Bereite verschiedene Konzentrationen des extrahierten Hauptwirkstoffs in geeigneten Lösungsmitteln vor.
  • Behandle die Zellkulturen mit diesen Wirkstofflösungen über einen definierten Zeitraum.
• Messung der biologischen Aktivität:
  • Verwende geeignete bioanalytische Methoden, um die Reaktion der Zellen auf den Wirkstoff zu messen (z.B. MTT-Assay zur Messung der Zellproliferation/ Zytotoxizität).
  • Berechne IC₅₀-Werte (Konzentration des Wirkstoffs, die 50% der Zellpopulation hemmt) oder andere relevante Parameter zur Bewertung der biologischen Aktivität.

Interpretation der Ergebnisse und Verhältnis zur chemischen Analyse:

• Mikroskopische Untersuchungen: Diese Untersuchungen stellen sicher, dass die verwendete Pflanzenprobe authentisch und korrekt identifiziert ist. Dies ist ein entscheidender erster Schritt, bevor chemische und biologische Analysen durchgeführt werden, um die Richtigkeit der Gesamtuntersuchung zu gewährleisten.
• In-vitro Bioassays: Diese Tests liefern Informationen über die biologische Wirkung des Hauptwirkstoffs auf zellulärer Ebene. Sie sind entscheidend, um die pharmakologische Relevanz des Wirkstoffs zu bestätigen. Die erzielten biologischen Daten können entweder die Ergebnisse der chemischen Analyse stützen oder Hinweise auf Wechselwirkungen/ Mechanismen liefern, die durch chemische Analysen nicht erfasst werden.
• Verhältnis zur chemischen Analyse:
  • Die chemische Analyse (z.B. HPLC, MS) quantifiziert die Menge des Hauptwirkstoffs in der Probe und bestätigt dessen Identität.
  • Die mikroskopischen Untersuchungen validieren die Probenzusammensetzung und Herkunft.
  • Die biologischen Tests bestätigen die erwartete biologische Aktivität und stellen sicher, dass der extrahierte Wirkstoff in der Praxis wirksam ist.
  • Kombiniert geben diese Ansätze ein umfassendes Bild der Qualität und Wirksamkeit des neuen Arzneistoffs, was für die Weiterentwicklung und Zulassung des Medikaments entscheidend ist.

Aufgabe 3)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ist eine weit verbreitete Methode zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Komponenten in einer Mischung. Das Trennprinzip basiert auf den unterschiedlichen Wechselwirkungen der Stoffe mit der stationären und mobilen Phase. Bei der HPLC besteht die stationäre Phase typischerweise aus einem festen oder flüssigen Material innerhalb der Trennsäule, während die mobile Phase ein flüssiges Lösungsmittel ist, das durch die Säule fließt. Detektoren wie UV oder Fluoreszenz erfassen die Konzentration der getrennten Substanzen. Die Analyse von Arzneistoffen, Naturstoffen und Metaboliten ist ein häufiges Anwendungsgebiet der HPLC. Wichtige Parameter, die die Trennung beeinflussen, umfassen die Flussrate, die Säulentemperatur und die Zusammensetzung der mobilen Phase (Gradienten-Elution). Die Retentionszeit ist die Zeit, die eine Substanz in der Säule verweilt und hängt von ihren Wechselwirkungen mit der stationären Phase ab.

a)

Erkläre das Prinzip der Gradienten-Elution und wie es die Trennungseffizienz in der HPLC-Anwendung beeinflusst.

Lösung:

Gradienten-Elution in der HPLC

• Prinzip der Gradienten-Elution: Bei der Gradienten-Elution in der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) wird die Zusammensetzung der mobilen Phase während der Trennung kontinuierlich oder schrittweise geändert. Dies steht im Gegensatz zur isokratischen Elution, bei der die Zusammensetzung der mobilen Phase konstant bleibt. Typischerweise beginnt man mit einer mobilen Phase, die schwach eluiert (d.h. mit einer geringen Affinität für die Substanzen), und erhöht allmählich den Anteil des stärkeren Elutionsmittels (d.h. mit einer höheren Affinität für die Substanzen).
• Vorteile der Gradienten-Elution:
  • Schnellere Trennung: Substanzen, die schwach mit der stationären Phase interagieren, werden zu Beginn eluiert, während stark interagierende Substanzen später eluiert werden. Dies führt zu einer effizienteren Trennung in kürzerer Zeit.
  • Verbesserte Trennung von Substanzen mit ähnlichen Eigenschaften: Die kontinuierliche oder schrittweise Änderung der mobilen Phasen-Zusammensetzung ermöglicht eine feinere Anpassung der Trennbedingungen, was besonders bei der Trennung von Substanzen mit ähnlichen chemischen Eigenschaften wichtig ist.
  • Reduzierte Peak-Breitens: Die Erhöhung der Elutionskraft der mobilen Phase führt zu schmaleren Peaks und verbessert somit die Auflösung und Empfindlichkeit der Analyse.

Insgesamt beeinflusst die Gradienten-Elution die Trennungseffizienz positiv, indem sie eine bessere Trennung, kürzere Analysenzeiten und eine höhere Empfindlichkeit ermöglicht.

b)

Wenn Du eine Analyse von Naturstoffen mittels HPLC durchführen möchtest, nenne und beschreibe mindestens drei wesentliche Parameter, die Du optimieren musst, um eine gute Trennung der Komponenten zu erreichen.

Lösung:

Wesentliche Parameter zur Optimierung der HPLC-Analyse von Naturstoffen

• Flussrate: Die Flussrate der mobilen Phase ist ein entscheidender Faktor für die Trennleistung.
  • Niedrige Flussrate: Kann die Trennungseffizienz erhöhen, da die Substanzen mehr Zeit haben, mit der stationären Phase zu interagieren. Dies kann jedoch zu längeren Analysezeiten führen.
  • Hohe Flussrate: Kann die Analysezeit verkürzen, aber möglicherweise nicht die beste Trennung erreichen, da die Substanzen weniger Zeit für die Interaktion mit der stationären Phase haben.
• Säulentemperatur: Die Temperatur der Säule beeinflusst die Wechselwirkungen zwischen der stationären Phase und den zu analysierenden Substanzen.
  • Erhöhte Temperatur: Kann die Viskosität der mobilen Phase reduzieren, was zu einer besseren Trennung führen kann. Höhere Temperaturen können auch die Diffusionskoeffizienten der Analyten erhöhen, was die Trennungseffizienz verbessern kann.
  • Eine optimierte Säulentemperatur hilft dabei, reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
• Zusammensetzung der mobilen Phase (Gradienten-Elution): Die Auswahl und Zusammensetzung der mobilen Phase ist entscheidend für die Trennungseffizienz.
  • Wahl des Lösungsmittels: Die Wahl der mobilen Phase hängt von der Polarität der zu trennenden Substanzen ab. Ein geeignetes Lösungsmittel verbessert die Wechselwirkungen und die Trennung der Substanzen.
  • Gradienten-Elution: Bei komplexen Mischungen kann eine Gradienten-Elution verwendet werden, bei der die Zusammensetzung der mobilen Phase kontinuierlich oder schrittweise geändert wird, um eine bessere Trennung zu erreichen.

Durch die Optimierung dieser Parameter kannst Du eine effiziente und effektive Trennung der Naturstoffe in Deiner HPLC-Analyse erzielen.

c)

Betrachte eine Substanz in einer HPLC-Analyse mit einer mobilen Phase in isokratischer Elution. Die Retentionszeit dieser Substanz beträgt 12 Minuten, während eine nicht-retinierte Substanz nach 3 Minuten eluieren würde. Berechne den Kapazitätsfaktor (k') dieser Substanz.

Lösung:

Berechnung des Kapazitätsfaktors (k')

• Gegeben:
  • Retentionszeit der Substanz (\textit{t}_R) = 12 Minuten
  • Retentionszeit einer nicht-retinierten Substanz (\textit{t}_0) = 3 Minuten
• Formel zur Berechnung des Kapazitätsfaktors: Der Kapazitätsfaktor (k') wird mit der folgenden Formel berechnet: \[ k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}\]
• Einfache Berechnung: Setze die gegebenen Werte in die obige Formel ein: \[ k' = \frac{12 \text{ Minuten} - 3 \text{ Minuten}}{3 \text{ Minuten}} = \frac{9 \text{ Minuten}}{3 \text{ Minuten}} = 3 \]

Der Kapazitätsfaktor (k') dieser Substanz beträgt 3.

d)

Diskutiere die Vor- und Nachteile der Verwendung von UV-Detektoren im Vergleich zu Fluoreszenzdetektoren in der HPLC. In welchen Fällen würdest Du einen Fluoreszenzdetektor bevorzugen?

Lösung:

Vor- und Nachteile von UV-Detektoren und Fluoreszenzdetektoren in der HPLC

• UV-Detektoren:
  • Vorteile:
    • Universelle Anwendbarkeit: Sie können viele verschiedene Arten von Verbindungen detektieren, da viele Substanzen UV-Licht absorbieren.
    • Einfachheit: UV-Detektoren sind relativ einfach zu bedienen und bieten konsistente Ergebnisse.
    • Kosten: Sie sind in der Regel kostengünstiger als Fluoreszenzdetektoren.
  • Nachteile:
    • Geringere Empfindlichkeit: UV-Detektoren haben eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu Fluoreszenzdetektoren, was bedeutet, dass sie höhere Konzentrationen von Substanzen benötigen, um sie zu detektieren.
    • Störsignale: Sie sind anfällig für Hintergrundrauschen und Interferenzen durch andere absorbierende Komponenten in der mobilen Phase oder der Probe.
• Fluoreszenzdetektoren:
  • Vorteile:
    • Höhere Empfindlichkeit: Fluoreszenzdetektoren sind wesentlich empfindlicher als UV-Detektoren und können sehr niedrige Konzentrationen von Substanzen detektieren.
    • Spezifität: Sie bieten eine höhere Spezifität, da nur fluoreszierende Substanzen detektiert werden, was das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert.
  • Nachteile:
    • Begrenzte Anwendbarkeit: Nicht alle Substanzen sind von Natur aus fluoreszierend oder können zur Fluoreszenz angeregt werden, was die Anwendungsmöglichkeiten einschränkt.
    • Kosten: Fluoreszenzdetektoren sind in der Regel teurer als UV-Detektoren.
    • Komplexität: Die Anwendung von Fluoreszenzdetektoren erfordert meistens mehr methodische Feinheiten und Kalibrierungen.

Wann Fluoreszenzdetektoren bevorzugt werden sollten:

• Wenn Du sehr geringe Konzentrationen von Analyten detektieren musst, bei denen die erhöhte Empfindlichkeit des Fluoreszenzdetektors einen signifikanten Vorteil bietet.
• In Fällen, bei denen Du eine höhere Spezifität benötigst, um Störungen durch andere Substanzen zu minimieren und nur die fluoreszierenden Komponenten zu detektieren.
• Wenn die Analyten von Natur aus fluoreszieren oder zur Fluoreszenz angeregt werden können.
• Für Anwendungen in der Umweltüberwachung, klinischen Forschung, oder bei der Analyse von biologischen Proben, wo geringe Mengen detektiert werden müssen.

Aufgabe 4)

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS)Du hast eine biologische Probe, die eine Vielzahl von unbekannten Verbindungen enthält. Zur Analyse dieser Probe verwendest Du die Gaschromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie (GCMS). Das Verfahren beginnt mit der Trennung der Komponenten der Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit, gefolgt von der Identifizierung der getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.

• GC: Trennt die Komponenten einer Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit.
• MS: Identifiziert die getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.
• Anwendung: Analyse von komplexen biologischen Proben, Umweltproben, Drogen, und Metaboliten.
• Molekulargewicht: Berechnung der Masse fragmentierter Ionen.
• Chromatogramm: Darstellung der Trennung der Komponenten.

a)

Während des Analyseprozesses mit GCMS wird eine Substanz in der Probe bei einer Retentionszeit von 10,5 Minuten detektiert und im Massenspektrum zeigt sich ein Hauptpeak bei m/z = 150.

• a) Erkläre, was die Retentionszeit und der m/z Wert über die identifizierte Substanz aussagen.
• b) Berechne die relative Intensität eines Fragment-Ions, wenn das Molekül mit einem m/z Wert von 300 unter gleichen Bedingungen eine Intensität von 1000 Einheiten zeigt.

Lösung:

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS)Du hast eine biologische Probe, die eine Vielzahl von unbekannten Verbindungen enthält. Zur Analyse dieser Probe verwendest Du die Gaschromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie (GCMS). Das Verfahren beginnt mit der Trennung der Komponenten der Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit, gefolgt von der Identifizierung der getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.

• GC: Trennt die Komponenten einer Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit.
• MS: Identifiziert die getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.
• Anwendung: Analyse von komplexen biologischen Proben, Umweltproben, Drogen, und Metaboliten.
• Molekulargewicht: Berechnung der Masse fragmentierter Ionen.
• Chromatogramm: Darstellung der Trennung der Komponenten.

• Retentionszeit: Die Retentionszeit von 10,5 Minuten gibt die Dauer an, die die Substanz benötigt, um durch die GC-Säule transportiert zu werden und detektiert zu werden. Eine kürzere Retentionszeit deutet auf eine höhere Flüchtigkeit der Substanz hin.
• m/z Wert: Der Wert von m/z = 150 im Massenspektrum steht für das Masse-zu-Ladung-Verhältnis des Hauptions, das im Spektrum detektiert wurde. Dies hilft, die Substanz zu identifizieren, indem man sie mit bekannten m/z Werten vergleicht.

• Um die relative Intensität eines Fragment-Ions zu berechnen, wenn das Molekül mit einem m/z Wert von 300 unter gleichen Bedingungen eine Intensität von 1000 Einheiten zeigt, müssen wir dies in Relation setzen. Die relative Intensität hängt von der Anzahl der erzeugten Ionen und ihrer Stabilität ab.
• Angenommen, das Fragment-Ion hat denselben Erzeugungs- und Detektionsprozentsatz wie das Molekül-Ion. Dann können wir die Intensität direkt vergleichen. Die relative Intensität des Fragment-Ions ist proportional zur Intensität des Moleküls.
• Zum Beispiel, wenn das Molekül-Ion eine Intensität von 1000 Einheiten hat, können wir annehmen, dass ein Fragment-Ion unter gleichen Bedingungen in einer ähnlichen Größenordnung liegen sollte, es sei denn, Fragmentation oder Detektionseffekte beeinflussen diesen Wert. Da die genauen Bedingungen nicht spezifiziert sind, nehmen wir an, dass die relativen Bedingungen dieselben sind.
• Berechnung:

 'relative Intensität des Fragment-Ions = (Intensität des Molekül-Ions bei m/z 150) * (Verhältnis m/z 150 zu 300)' relative Intensität = 1000 Einheiten * (150/300) relative Intensität = 500 Einheiten' 

• In diesem Beispiel berechnen wir die relative Intensität als proportionaler Wert. Daher beträgt die relative Intensität des Fragment-Ions, wenn das Molekül-Ion unter gleichen Bedingungen eine Intensität von 1000 Einheiten zeigt: 500 Einheiten.

b)

Bei der Analyse einer Umweltprobe durch GCMS wurden folgende Kontaminanten identifiziert: Benzen (m/z = 78), Toluol (m/z = 92), Ethylbenzol (m/z = 106) und Xylol (m/z = 106).

• a) Beschreibe das Vorgehen, wie die Identifizierung der genannten Substanzen durch das Massenspektrum ermöglicht wird.
• b) Berechne den Gesamtanteil von Xylol und Ethylbenzol in der Probe, wenn das Chromatogramm zeigt, dass 40 % der Substanzen Xylol und 30 % Ethylbenzol sind.

Lösung:

Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GCMS)Du hast eine biologische Probe, die eine Vielzahl von unbekannten Verbindungen enthält. Zur Analyse dieser Probe verwendest Du die Gaschromatographie gekoppelt mit der Massenspektrometrie (GCMS). Das Verfahren beginnt mit der Trennung der Komponenten der Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit, gefolgt von der Identifizierung der getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.

• GC: Trennt die Komponenten einer Probe basierend auf ihrer Flüchtigkeit.
• MS: Identifiziert die getrennten Komponenten durch Fragmentierung und Massendetektion.
• Anwendung: Analyse von komplexen biologischen Proben, Umweltproben, Drogen, und Metaboliten.
• Molekulargewicht: Berechnung der Masse fragmentierter Ionen.
• Chromatogramm: Darstellung der Trennung der Komponenten.

• Die Identifizierung der Substanzen durch das Massenspektrum erfolgt in mehreren Schritten:
• 1. Probenvorbereitung: Die Probe wird aufbereitet und in den Gaschromatographen injiziert.
• 2. GC-Trennung: Die verschiedenen Komponenten der Probe werden durch die GC-Säule basierend auf ihrer Flüchtigkeit getrennt. Jede Komponente verlässt die Säule bei einer spezifischen Retentionszeit.
• 3. Ionisierung: Jede getrennte Komponente wird in die Massenspektrometer-Einheit überführt und ionisiert, oftmals mittels Elektronenstoßionisation, wobei die Moleküle in positiv geladene Ionen zertrümmert werden.
• 4. Massenspektrum-Erzeugung: Die erzeugten Ionen werden nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert und detektiert. Dies ergibt ein Massenspektrum mit Peaks, die die Intensität gegen das m/z-Verhältnis darstellen.
• 5. Identifizierung: Jeder Peak im Massenspektrum kann den bekannten m/z-Werten zugeordnet werden, die charakteristisch für spezifische Moleküle sind. In diesem Fall werden Benzen (m/z = 78), Toluol (m/z = 92), Ethylbenzol (m/z = 106) und Xylol (m/z = 106) identifiziert, da ihre m/z-Werte mit den bekannten Werten übereinstimmen.

• Berechne den Gesamtanteil von Xylol und Ethylbenzol in der Probe.
• Im Chromatogramm zeigt sich, dass 40 % der Substanzen Xylol und 30 % Ethylbenzol sind.
• Berechnung des Gesamtanteils:

• Der Gesamtanteil von Xylol und Ethylbenzol lässt sich einfach durch Addition ihrer Einzelanteile berechnen.

Totaler Anteil = Anteil von Xylol + Anteil von Ethylbenzol = 40 % + 30 % = 70 %

• Der Gesamtanteil von Xylol und Ethylbenzol in der Probe beträgt somit 70 %.