Physikalisch-chemisches Praktikum für Studierende der Biologie - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest im Labor an einer Analyse, bei der Du die Wechselwirkungen zwischen Licht und Materie untersuchst. Dabei verwendest Du sowohl die Absorptionsspektroskopie als auch die Emissionsspektroskopie, um verschiedene Substanzen in einer Probe zu identifizieren und ihre Konzentration zu bestimmen.

• In der Absorptionsspektroskopie misst Du die Lichtabsorption durch eine Probe. Hierbei nutzt Du das Beer-Lambert-Gesetz:
• In der Emissionsspektroskopie misst Du das Licht, das von einer Probe emittiert wird.
• Beide Methoden basieren auf den Übergängen von Elektronen zwischen verschiedenen Energieniveaus.
• Spektrallinien bei spezifischen Wellenlängen korrespondieren mit spezifischen Energieniveaus der Elektronen.
• Du verwendest die Spektroskopie zur Konzentrationsbestimmung, Strukturanalyse und Identifikation von Substanzen.

a)

Du hast eine Lösung, die eine bestimmte Konzentration eines Stoffes enthält. Du misst eine Absorption von 0,8 bei einer Schichtdicke von 1 cm und einem molaren Extinktionskoeffizienten (\textit{ε}) von 200 M^-1cm^-1. Berechne die Konzentration der Lösung mit Hilfe des Beer-Lambert-Gesetzes.

Lösung:

Um die Konzentration der Lösung zu berechnen, nutzen wir das Beer-Lambert-Gesetz. Das Gesetz lautet:

• Beer-Lambert-Gesetz: \[ A = \textit{ε} \times c \times l \] Hierbei ist \( A \) die Absorption, \( \textit{ε} \) der molare Extinktionskoeffizient, \( c \) die Konzentration der Lösung und \( l \) die Schichtdicke.

Gegeben haben wir:

• Absorption (A) = 0,8
• Schichtdicke (l) = 1 cm
• Molaren Extinktionskoeffizienten (ε) = 200 M^-1cm^-1

Nun setzen wir die gegebenen Werte in das Beer-Lambert-Gesetz ein und lösen es nach der Konzentration (c) auf:

• \[ A = \textit{ε} \times c \times l \] \[ 0,8 = 200 \times c \times 1 \]

Um nach \( c \) aufzulösen, teilen wir beide Seiten der Gleichung durch \( 200 \):

• \[ c = \frac{0,8}{200} \]

Das ergibt:

• \[ c = 0,004 \text{ M} \]

Daher beträgt die Konzentration der Lösung 0,004 M (mol/L).

b)

Erkläre den Unterschied zwischen Grob- und Feinstruktur in Emissionsspektren und wie diese zur Identifikation von Substanzen genutzt werden können.

Lösung:

Beim Studium von Emissionsspektren begegnen wir häufig sowohl Grob- als auch Feinstrukturen. Diese beiden Begriffe beziehen sich auf unterschiedliche Ebenen von Details in den Emissionsspektren und können zur Identifikation von Substanzen verwendet werden.

• Grobstruktur: Die Grobstruktur in Emissionsspektren bezieht sich auf die Hauptlinien, die durch die Übergänge von Elektronen zwischen verschiedenen Hauptenergieniveaus verursacht werden. Diese Linien sind normalerweise gut sichtbar und zeigen Übergänge zwischen Hauptniveaus wie der Anregung eines Elektrons von der n-ten Schale zur m-ten Schale in einem Atom.
  • Beispiel: Der Übergang eines Elektrons im Wasserstoffatom vom zweiten zum ersten Energieniveau führt zur Emission eines Photons im sichtbaren Bereich, was als sogenannte Balmer-Serie bekannt ist.
• Feinstruktur: Die Feinstruktur umfasst zusätzliche Linien, die als Aufspaltungen der Grobstruktur-Linien sichtbar werden. Diese feinen Linien entstehen aufgrund feinerer Effekte, wie z.B. der Spin-Bahn-Kopplung, bei der die Wechselwirkung zwischen dem Elektronenspin und dem äußeren Magnetfeld führt zu weiteren Energieaufspaltungen führt.
  • Diese Aufspaltungen sind oft kleiner als die Grobstrukturlinien und können durch Hochauflösungsspektroskopie erfasst werden.
  • Beispiel: Im Fall des Wasserstoffatoms wird der Übergang vom zweiten zum ersten Energieniveau in der Feinstruktur durch mehrere eng beieinander liegende Linien dargestellt, die durch zusätzlich Spin-Bahn-Wechselwirkungen verursacht werden.

Beide Strukturtypen sind wichtig für die Identifikation von Substanzen:

• Grobstruktur: Die Identifikation von Hauptübergängen hilft, die Art der Atome oder Moleküle in der Probe zu bestimmen. Diese Hauptlinien geben Hinweise auf das Vorhandensein bestimmter Elemente und deren grobe elektronische Struktur.
• Feinstruktur: Die Analyse der Feinstruktur kann zusätzliche Informationen über die spezifischen Energiezustände und die interne Struktur der Atome oder Moleküle liefern. Dies trägt zur genaueren Charakterisierung und Unterscheidung von Substanzen bei, die anhand ihrer Grobstruktur möglicherweise nicht eindeutig identifiziert werden können.

Zusammengefasst ermöglichen Grob- und Feinstruktur in Emissionsspektren eine detaillierte Analyse von Substanzen, die sowohl zur groben Identifikation als auch zur feinen Unterscheidung zwischen ähnlichen Atomen oder Molekülen genutzt werden können.

c)

Angenommen, Du hast zwei Substanzen A und B, deren Absorptionsspektren bei 400 nm und 500 nm Spitzen zeigen. Wie kannst Du mithilfe der Absorptionsspektroskopie diese beiden Substanzen in einer Mischung quantifizieren?

Lösung:

Um die Konzentrationen der Substanzen A und B in einer Mischung mithilfe der Absorptionsspektroskopie zu quantifizieren, nutzt Du die Absorptionsspektren bei den spezifischen Wellenlängen, bei denen beide Substanzen Spitzen zeigen (400 nm und 500 nm). Der Prozess besteht aus den folgenden Schritten:

• Schritt 1: Aufnahme der Absorptionsspektren der reinen Substanzen Misst die individuelle Absorptions bei 400 nm und 500 nm für reine Proben von Substanz A und Substanz B. So erhältst Du den molaren Extinktionskoeffizienten (\textit{ε}) für beide Substanzen bei diesen Wellenlängen.
  • \(ε_{A,400}\) - molarer Extinktionskoeffizient für Substanz A bei 400 nm
  • \(ε_{A,500}\) - molarer Extinktionskoeffizient für Substanz A bei 500 nm
  • \(ε_{B,400}\) - molarer Extinktionskoeffizient für Substanz B bei 400 nm
  • \(ε_{B,500}\) - molarer Extinktionskoeffizient für Substanz B bei 500 nm
• Schritt 2: Messung der Absorption der Mischung Misst die Absorption der Mischung bei 400 nm und 500 nm. So erhältst Du die Gesamtabsorptionen bei diesen Wellenlängen:
  • \(A_{400}\) - Absorption der Mischung bei 400 nm
  • \(A_{500}\) - Absorption der Mischung bei 500 nm
• Schritt 3: Anwendung des Beer-Lambert-Gesetzes Setzt die gemessenen Absorptionen in das Beer-Lambert-Gesetz ein, das besagt: \[ A = \textit{ε} \times c \times l \] Um die Konzentrationen der Substanzen A und B zu berechnen, haben wir zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten (die Konzentrationen \(c_A\) und \(c_B\)):
  • \(A_{400} = (ε_{A,400} \times c_A) + (ε_{B,400} \times c_B)\)
  • \(A_{500} = (ε_{A,500} \times c_A) + (ε_{B,500} \times c_B)\)
• Schritt 4: Lösen der Gleichungen Löse die beiden linearen Gleichungen gleichzeitig, um die Konzentrationen von Substanz A (\(c_A\)) und Substanz B (\(c_B\)) zu bestimmen.

Hier ist ein Beispiel zur Veranschaulichung:

• Angenommene molare Extinktionskoeffizienten: \(ε_{A,400} = 15000\) M^-1cm^-1\t \(ε_{A,500} = 5000\) M^-1cm^-1\t \(ε_{B,400} = 3000\) M^-1cm^-1\t \(ε_{B,500} = 10000\) M^-1cm^-1 Gemessene Absorptionen der Mischung: \(A_{400} = 0,8\) \(A_{500} = 0,9\)

• Um die Konzentrationen von A und B zu berechnen, stellen wir zwei Gleichungen auf:\[0,8 = (15000 \times c_A) + (3000 \times c_B)\]\[0,9 = (5000 \times c_A) + (10000 \times c_B)\]

Nach dem Lösen der Gleichungssysteme erhalten wir die Konzentrationen von \(c_A\) und \(c_B\).

In diesen Schritten kannst Du die Konzentrationen der beiden Substanzen in der Mischung bestimmen.

d)

Diskutiere mögliche Fehlerquellen bei der Anwendung der Absorptionsspektroskopie und wie diese minimiert werden können.

Lösung:

Die Absorptionsspektroskopie ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse von Substanzen. Bei der Anwendung dieser Technik gibt es jedoch verschiedene potenzielle Fehlerquellen, die die Genauigkeit und Präzision der Messergebnisse beeinflussen können. Hier sind einige dieser Fehlerquellen und Vorschläge zur Minimierung:

• Fehlerquelle 1: Schwankungen in der Lichtquelle Schwankungen in der Intensität der Lichtquelle können zu ungenauen Absorptionsmessungen führen. Lösungen: 1. Verwende eine stabile Lichtquelle mit konstanter Intensität. 2. Kalibriere das Spektrometer regelmäßig.
• Fehlerquelle 2: Schmutz oder Kratzer auf den Küvetten Verunreinigungen oder Beschädigungen der Küvetten können die Lichtdurchlässigkeit und damit die Absorptionsmessung beeinflussen. Lösungen: 1. Reinige die Küvetten vor jeder Messung gründlich. 2. Überprüfe und ersetze beschädigte Küvetten.
• Fehlerquelle 3: Abweichungen in der Küvettengeometrie Inhomogene oder unterschiedliche Küvettengeometrien können zu variierenden Lichtwegen und damit zu Messungenauigkeiten führen. Lösungen: 1. Verwende Küvetten, die identische optische Pfadlängen und Abmessungen haben. 2. Stelle sicher, dass die Küvette korrekt im Spektrometer platziert ist.
• Fehlerquelle 4: Unzureichende Kalibrierung Eine nicht korrekt kalibrierte Ausrüstung kann systematische Fehler in den Messergebnissen erzeugen. Lösungen: 1. Führe eine regelmäßige Kalibrierung des Spektrometers mit bekannten Standardlösungen durch. 2. Überprüfe die Kalibrierung regelmäßig während des Messprozesses.
• Fehlerquelle 5: Streulicht Streulicht, das nicht durch die Probe geht, kann die Absorptionsmessung verfälschen. Lösungen: 1. Nutze einen monochromatischen Filter oder ein Gitter, um Streulicht zu minimieren. 2. Verwende geeignete Blenden und Abschirmungen, um Streulicht zu verhindern.
• Fehlerquelle 6: Konzentrationsabhängige Effekte Inhochkonzentrierten Lösungen können Wechselwirkungen zwischen Molekülen die Absorptionsmessung beeinflussen. Lösungen: 1. Verdünne die Probe ausreichend, um Wechselwirkungen zu minimieren, und stelle sicher, dass die Absorption im linearen Bereich liegt. 2. Bereite mehrere Verdünnungsstufen vor und überprüfe die Linearität der Absorptionskurve.

Zusammengefasst: Durch das Bewusstsein über potenzielle Fehlerquellen und die Implementierung entsprechender Maßnahmen können Genauigkeit und Präzision bei der Anwendung der Absorptionsspektroskopie erheblich verbessert werden.

Aufgabe 2)

UV/Vis-Spektroskopie zur Bestimmung von Biomolekülen

Die UV/Vis-Spektroskopie ist eine analytische Methode zur Bestimmung der Konzentrationen und Eigenschaften von Biomolekülen durch die Absorption von UV/Vis-Licht. Das grundlegende Gesetz, das hierbei verwendet wird, ist das Lambert-Beer'sche Gesetz:

\[ A = \text{lg} \left( \frac{I_0}{I} \right) = \varepsilon \cdot c \cdot d \]

• A: Absorption
• I_0: Intensität des einfallenden Lichts
• I: Intensität des durchgelassenen Lichts
• \(\varepsilon\): molarer Extinktionskoeffizient
• c: Konzentration
• d: Schichtdicke

Die Methode wird typischerweise zur Bestimmung der Proteinkonzentration bei 280 nm und der Konzentration von Nukleinsäuren bei 260 nm verwendet. Zu den Vorteilen gehören die Schnelligkeit, Nicht-Destruktivität und der geringe Probenverbrauch. Wichtig ist jedoch eine sorgfältige Kalibration, da Störungen durch andere Substanzen auftreten können.

a)

Eine Proteinlösung hat bei einer Wellenlänge von 280 nm eine Absorption von 1,2. Die Küvettenlänge beträgt 1 cm und der molare Extinktionskoeffizient ist 44000 M^-1cm^-1. Berechne die Konzentration der Proteinlösung.

Lösung:

Berechnung der Konzentration der Proteinlösung

Um die Konzentration der Proteinlösung mit der gegebenen Absorption zu berechnen, können wir das Lambert-Beer'sche Gesetz anwenden:

\[ A = \text{lg} \frac{I_0}{I} = \text{ε} \times c \times d \]

Gegeben sind:

• Absorption (\text{A}): 1,2
• Küvettenlänge (\text{d}): 1 cm
• Molarer Extinktionskoeffizient (\text{ε}): 44000 M^-1cm^-1

Schritt-für-Schritt-Lösung

Wir müssen die Formel nach der Konzentration (\text{c}) umstellen:

A = \text{ε} \times c \times d

Umgestellt nach der Konzentration ergibt das:

\[ c = \frac{A}{\text{ε} \times d} \]

Setzen wir die gegebenen Werte ein:

A = 1,2 ε = 44000 \text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1} d = 1 \text{ cm}

\[ c = \frac{1,2}{44000 \times 1} \ = 2,727 \times 10^{-5} \text{ M} \]

Die Konzentration der Proteinlösung beträgt somit 2,727 \times 10^{-5} \text{ M}.

Schlussfolgerung

Die Berechnung der Konzentration einer Proteinlösung mithilfe der UV/Vis-Spektroskopie ist relativ einfach, wenn alle nötigen Werte bekannt sind. Dieses Prinzip kann auf verschiedene Biomoleküle angewendet werden, solange der molare Extinktionskoeffizient und die Wellenlänge bekannt sind.

b)

Wie könnte eine Störung durch andere Substanzen bei der UV/Vis-Spektroskopie die Messung der Proteinkonzentration beeinflussen? Nenne zwei mögliche Störungen und erkläre, wie diese die Absorption verändern könnten.

Lösung:

Störungen bei der UV/Vis-Spektroskopie und deren Einfluss auf die Messung der Proteinkonzentration

Bei der Verwendung von UV/Vis-Spektroskopie zur Bestimmung der Proteinkonzentration können verschiedene Störungen durch andere Substanzen auftreten. Diese Störungen können die Genauigkeit der Messungen beeinflussen, indem sie die Absorption verändern. Im Folgenden werden zwei mögliche Störungen beschrieben:

1. Anwesenheit anderer absorbierender Substanzen

Wenn andere Substanzen in der Probe vorhanden sind, die ebenfalls im UV-Bereich absorbieren, können diese die gemessene Absorption erhöhen. Das führt zu einer Überschätzung der tatsächlichen Proteinkonzentration.

• Beispiel: Nukleinsäuren, die bei 260 nm absorbieren, können auch bei 280 nm ein schwaches Absorptionssignal zeigen.
• Auswirkung: Die gemessene Absorption bei 280 nm wird höher sein, als sie nur durch das Protein verursacht wäre.
• Lösung: Eine sorgfältige Auswahl der Wellenlängen zur Minimierung von Überlappungseffekten und eine Korrektur der Absorptionswerte durch weitere analytische Methoden wie Spektraldekonvolution.

2. Trübung oder Partikel in der Lösung

Trübung oder die Anwesenheit von kleinen Partikeln in der Lösung kann Streulicht verursachen und die Absorption erhöhen, ohne dass tatsächlich mehr Protein vorhanden ist.

• Beispiel: Staubpartikel oder unlösliche Proteinaggregate in der Lösung.
• Auswirkung: Eine ungenaue Absorptionsmessung aufgrund von Streulicht führt zu einer falschen Erhöhung des Absorptionswertes.
• Lösung: Filtern der Probe, Zentrifugation zur Entfernung von Partikeln oder Verwendung von geeigneten Techniken zur Korrektur des Streulichteffekts.

Schlussfolgerung

Es ist wichtig, bei der Verwendung der UV/Vis-Spektroskopie potenzielle Störungen zu berücksichtigen und geeignete Maßnahmen zur Minimierung ihrer Effekte zu ergreifen. Dadurch kann die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Messungen erheblich verbessert werden.

c)

Warum ist eine Kalibration notwendig und wie würde ein typischer Kalibrationsprozess aussehen, um die Genauigkeit der Messungen zu gewährleisten?

Lösung:

Notwendigkeit der Kalibration und der Kalibrationsprozess bei der UV/Vis-Spektroskopie

Eine Kalibration bei der UV/Vis-Spektroskopie ist essentiell, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Messergebnisse zu gewährleisten. Ohne Kalibration können die Messergebnisse durch Instrumentenabweichungen, Schwankungen in der Lichtquelle oder andere Fehlerquellen beeinträchtigt werden.

Warum ist eine Kalibration notwendig?

• Korrektur von Instrumentenabweichungen: Jedes Messinstrument kann kleine systematische Fehler aufweisen, die durch regelmäßige Kalibration korrigiert werden können.
• Berücksichtigung von Schwankungen in der Lichtquelle: Die Intensität und Stabilität der Lichtquelle kann variieren. Eine Kalibration hilft, diese Schwankungen zu berücksichtigen.
• Sicherstellung der Messgenauigkeit: Die Kalibration gewährleistet, dass die Messwerte konsistent und reproduzierbar sind.
• Identifikation und Korrektur von Störungen: Durch die Kalibration können Störungen durch andere Substanzen oder technologische Probleme identifiziert und korrigiert werden.

Typischer Kalibrationsprozess

Ein typischer Kalibrationsprozess umfasst mehrere Schritte:

• Vorbereitung von Standardlösungen: Zu Beginn werden mehrere Lösungen mit bekannten Konzentrationen des zu messenden Biomoleküls (z.B. Protein) in unterschiedlichen Konzentrationen hergestellt.
• Messung der Absorption: Die Absorption dieser Standardlösungen wird bei der gewünschten Wellenlänge (z.B. 280 nm für Proteine) gemessen. Diese Werte werden notiert.
• Erstellung einer Kalibrationskurve: Die gemessenen Absorptionswerte werden gegen die bekannten Konzentrationen aufgetragen, um eine Kalibrationskurve zu erstellen. Diese Kurve zeigt die lineare Beziehung zwischen Absorption und Konzentration basierend auf dem Lambert-Beer'schen Gesetz.
• Bestimmung der Gleichung der Kalibrationskurve: Eine lineare Regression wird durchgeführt, um die Gleichung der Kalibrationskurve zu bestimmen. Diese Gleichung hat die Form \(A = \text{ε} \times c \times d\), wobei die ermittelten Koeffizienten verwendet werden können.
• Regelmäßige Überprüfung und erneute Kalibration: Um sicherzustellen, dass die Messergebnisse weiterhin genau sind, sollten regelmäßige Kalibrationen durchgeführt werden, insbesondere wenn Änderungen an der Ausrüstung oder an den Reagenzien vorgenommen werden.
• Anwendung der Kalibrationskurve auf unbekannte Proben: Die absorbierten Werte von unbekannten Proben können nun mithilfe der Kalibrationskurve auf die Konzentration zurückgeführt werden.

Schlussfolgerung

Durch eine sorgfältige Kalibration können Ungenauigkeiten und Fehler bei der Messung mittels UV/Vis-Spektroskopie minimiert werden. Dies ist entscheidend für konsistente und verlässliche Ergebnisse, insbesondere in der quantitativen Analyse von Biomolekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren.

d)

Erkläre mithilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes, wie die Schichtdicke der Küvette (d) die gemessene Absorption (A) beeinflusst, wenn alle anderen Parameter konstant bleiben. Welchen Einfluss hätte eine verringerte Küvettenlänge auf die Messung?

Lösung:

Einfluss der Schichtdicke der Küvette auf die gemessene Absorption

Das Lambert-Beer'sche Gesetz beschreibt die Beziehung zwischen der Absorption \((A)\) und verschiedenen Parametern wie dem molaren Extinktionskoeffizienten \((\text{ε})\), der Konzentration \((c)\) und der Schichtdicke \((d)\):

\[ A = \text{ε} \cdot c \cdot d \]

Hierbei ist:

• A: Absorption
• I_0: Intensität des einfallenden Lichts
• I: Intensität des durchgelassenen Lichts
• ε: molarer Extinktionskoeffizient
• c: Konzentration
• d: Schichtdicke (Küvettenlänge)

Die Formel zeigt, dass die gemessene Absorption \((A)\) direkt proportional zur Schichtdicke \((d)\) der Küvette ist. Das bedeutet:

• Wenn die Schichtdicke \((d)\) größer wird, nimmt die gemessene Absorption \((A)\) zu.
• Wenn die Schichtdicke \((d)\) kleiner wird, nimmt die gemessene Absorption \((A)\) ab.

Einfluss einer verringerten Küvettenlänge auf die Messung

Angenommen, alle anderen Parameter (ε und c) bleiben konstant und die Schichtdicke \((d)\) der Küvette wird verringert. In diesem Fall würde die gemessene Absorption \((A)\) proportional zur Verringerung der Schichtdicke abnehmen. Konkret bedeutet dies:

• Wenn die Schichtdicke halbiert wird, wird die gemessene Absorption ebenfalls halbiert.
• Eine verringerte Küvettenlänge führt zu einer geringeren Empfindlichkeit, da weniger Licht von der Probe absorbiert wird. Dies könnte zu weniger präzisen und genauereren Ergebnissen führen, besonders bei niedrigen Konzentrationen.

Dies lässt sich mathematisch wie folgt ausdrücken:

\[ A \propto d \]

Es ist wichtig, die Küvettenlänge konstant und standardisiert zu halten, um vergleichbare und reproduzierbare Messergebnisse zu gewährleisten. Veränderungen der Schichtdicke müssen durch entsprechende Kalibrierungen und Anpassungen in der Berechnung berücksichtigt werden.

Aufgabe 3)

In diesem Experiment sollst Du die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) nutzen, um die Komponenten eines komplexen biologischen Gemisches zu trennen und zu identifizieren. Du verwendest eine flüssige mobile Phase und eine stationäre Phase, die aus einem festen Material besteht. Das Trennprinzip beruht auf den Wechselwirkungen zwischen den Molekülen der Probe, der mobilen Phase und der stationären Phase. Du verwendest einen Detektor, der auf UV-Vis-Spektroskopie basiert, um die eluierten Komponenten zu identifizieren. In diesem Zusammenhang musst Du auch wichtige Parameter wie Flussrate, Säulenlänge und Partikelgröße der stationären Phase berücksichtigen.

a)

Erkläre, warum die Wahl der mobilen Phase und ihrer Zusammensetzung von entscheidender Bedeutung für die Trennung der Komponenten in einem Gemisch ist. Beschreibe, wie sich die Polarität der mobilen Phase auf die Trennleistung auswirken kann.

Lösung:

Wichtigkeit der Wahl der mobilen Phase und deren Zusammensetzung:

• Die Auswahl der mobilen Phase in der HPLC ist entscheidend, da sie die Wechselwirkungen zwischen den Molekülen der Probe und der stationären Phase direkt beeinflusst.
• Die Trennleistung hängt stark von der Polarität und der chemischen Struktur der mobilen Phase ab.

Einfluss der Polarität der mobilen Phase auf die Trennleistung:

• In der HPLC gibt es zwei Haupttypen von mobilen Phasen: polare und unpolare.
• Eine polare mobile Phase kann Wasser, Methanol oder Acetonitril sein, während eine unpolare mobile Phase oft aus Hexan oder Chloroform besteht.
• Wenn die mobile Phase polar ist, werden polare Moleküle der Probe stärker eluieren, da sie stärkere Wechselwirkungen mit der polaren Phase haben. Unpolare Moleküle werden dagegen länger an der weniger polaren stationären Phase haften.
• Umgekehrt, wenn die mobile Phase unpolar ist, werden unpolare Moleküle schneller eluieren, während polare Moleküle länger in der stationären Phase verbleiben.
• Durch die Anpassung der Polarität der mobilen Phase kann die Selektivität der Trennung der einzelnen Komponenten im Gemisch verbessert werden.
• Ein Beispiel ist die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC), bei der eine unpolare stationäre Phase (z.B. C18-Säule) und eine polare mobile Phase (Wasser/Acetonitril-Gemisch) verwendet werden. Diese Methode ermöglicht die effiziente Trennung aufgrund der differenten Wechselwirkungen zwischen den Molekülen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase.

c)

Du beobachtest ein Signal im UV-Vis-Spektrum bei 280 nm für eine der eluierten Komponenten. Erkläre, warum diese Wellenlänge typisch für die Detektion von Proteinen ist, und beschreibe, welche strukturellen Merkmale der Proteine zu dieser Absorption führen.

Lösung:

Warum Wellenlänge von 280 nm typisch für die Detektion von Proteinen ist:

• Die Wellenlänge von 280 nm ist typisch für die Detektion von Proteinen, weil spezifische Aminosäuren in Proteinen bei dieser Wellenlänge stark absorbieren.
• Insbesondere die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin sowie in geringerem Maße Phenylalanin haben Absorptionsmaxima im UV-Bereich bei so etwa 280 nm.

Strukturelle Merkmale der Proteine, die zu dieser Absorption führen:

• Tryptophan: Enthält einen Indolring, der eine starke Absorption im UV-Bereich verursacht. Tryptophan hat ein Absorptionsmaximum bei etwa 280 nm.
• Tyrosin: Besitzt einen Phenolring, der ebenfalls UV-Licht absorbiert, jedoch schwächer als Tryptophan. Sein Absorptionsmaximum liegt ebenfalls nahe 280 nm.
• Phenylalanin: Enthält einen Benzolring, der bei für Proteine relevanten Konzentrationen weniger stark absorbiert, aber trotzdem zu einer gewissen Absorption bei 280 nm beiträgt.

Diese spezifischen aromatischen Aminosäuren sind in vielen Proteinen in ausreichenden Mengen vorhanden, was die Wellenlänge von 280 nm zu einem nützlichen Standard für die Detektion und Quantifizierung von Proteinen im UV-Vis-Spektralbereich macht.

Aufgabe 4)

Während eines Praktikums führst Du eine SDS-PAGE zur Trennung von Proteinen durch. In der Versuchsanleitung steht, dass Du eine Proteinprobe zuerst mit einem Ladepuffer behandeln musst, bevor Du sie auf das Gel aufträgst. Danach wird die Elektrophorese in einem Polyacrylamidgel durchgeführt und die Proteine werden durch Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht.

a)

Beschreibe den Zweck von SDS in der SDS-PAGE. Erläutere, wie SDS die Struktur und die Eigenschaften der Proteine beeinflusst.

Lösung:

Im Folgenden wird der Zweck von SDS in der SDS-PAGE beschrieben und erläutert, wie SDS die Struktur und Eigenschaften der Proteine beeinflusst:

• Zweck von SDS: Das Hauptziel von SDS (Natriumdodecylsulfat) in der SDS-PAGE besteht darin, Proteine zu denaturieren und ihnen eine einheitliche negative Ladung zu verleihen. Durch diese Eigenschaften ermöglicht SDS eine Trennung der Proteine anhand ihrer Größe und nicht aufgrund von Form oder Ladung.
• Wie SDS die Struktur der Proteine beeinflusst:
  • SDS ist ein starkes Detergens und bindet an Proteine im Verhältnis von etwa einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäurereste. Diese Bindung führt zur Denaturierung der Proteine, d. h. sie verlieren ihre native Faltung und entfalten sich in eine lineare Struktur.
  • Durch die denaturierende Wirkung von SDS werden alle nicht-kovalenten Bindungen wie Wasserstoffbrücken, Disulfidbrücken, und hydrophobe Wechselwirkungen aufgebrochen. Dies führt dazu, dass die Proteine ihre dreidimensionale Form verlieren und eine verlängerte, polypeptidartige Struktur annehmen.
• Wie SDS die Eigenschaften der Proteine beeinflusst:
  • Indem SDS an die Proteine bindet, verleiht es ihnen eine einheitliche negative Ladung, proportional zur Länge des Polypeptids. Dies geschieht, weil die SDS-Moleküle selbst negativ geladen sind und sich auf der Oberfläche der Proteine anlagern.
  • Aufgrund der einheitlichen negativen Ladung, die durch SDS vermittelt wird, bewegen sich die Proteine während der Elektrophorese im elektrischen Feld in Richtung der Anode. Ein wesentliches Ergebnis dieser Behandlung ist, dass die Proteine unabhängig von ihrer ursprünglichen Ladung oder Form gewissermaßen 'neutralisiert' werden und die Trennung in der SDS-PAGE ausschließlich auf ihrer Molekülgröße basiert.

Zusammengefasst dient SDS also dazu, die Proteine zu denaturieren und ihnen eine einheitliche negative Ladung zu verleihen, wodurch eine Trennung nach Molekülgröße in der Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermöglicht wird.

b)

Erkläre die Rolle des Ladepuffers und warum ein Reduktionsmittel (wie DTT oder β-Mercaptoethanol) in diesem Puffer enthalten ist.

Lösung:

Im Folgenden wird die Rolle des Ladepuffers bei der SDS-PAGE und die Bedeutung der enthaltenen Reduktionsmittel (wie DTT oder β-Mercaptoethanol) erläutert:

• Rolle des Ladepuffers: Der Ladepuffer (auch Probenpuffer genannt) hat mehrere wichtige Funktionen in der SDS-PAGE:
• Der Puffer sorgt dafür, dass die Proteine stabil und in einem definierten Zustand vorliegen, bevor sie auf das Gel aufgetragen werden.
• Er enthält SDS, das die Denaturierung der Proteine bewirkt und ihnen eine einheitliche negative Ladung verleiht, wodurch die Trennung nach Molekülgröße während der Elektrophorese ermöglicht wird.
• Der Ladepuffer enthält auch Glycerin oder ein anderes Dichteerhöhungsmittel, das dafür sorgt, dass die Proben leichter in die Geltaschen geladen werden können, da es die Dichte der Lösung erhöht und das Absinken der Probe in die Gel-Taschen fördert.
• Außerdem enthält er häufig ein Farbstoff-Tracking-Mittel (wie Bromphenolblau), das es ermöglicht, den Fortschritt der Elektrophorese visuell zu verfolgen, da der Farbstofffront die Bewegung der Proteine durch das Gel anzeigt.
• Bedeutung des Reduktionsmittels (wie DTT oder β-Mercaptoethanol):
  • Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol sind im Ladepuffer enthalten, um disulfidverbrückte Proteine zu reduzieren. Disulfidbrücken sind kovalente Bindungen zwischen Cysteinresten innerhalb oder zwischen Polypeptidketten.
  • Durch die Reduktion dieser Disulfidbrücken werden die kovalenten Bindungen, die die Tertiär- und Quartärstrukturen der Proteine stabilisieren, gespalten. Dies führt zur weiteren Denaturierung der Proteine, sodass sie vollständig entrollte und lineare Strukturen annehmen.
  • Diese vollständige Denaturierung ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Proteine ausschließlich anhand ihrer Primärstruktur (Molekülgröße) und nicht aufgrund von höheren Ordnungsstrukturen oder intermolekularen Wechselwirkungen getrennt werden.

Zusammengefasst sorgt der Ladepuffer dafür, dass die Proteine stabil und für die Elektrophorese vorbereitet sind, während die Reduktionsmittel disulfidverbrückte Strukturen aufbrechen und eine vollständige Denaturierung der Proteine sicherstellen, was eine Trennung nach Molekülgröße ermöglicht.

c)

Während der Elektrophorese wandern kleinere Proteine schneller durch das Gel als größere Proteine. Entwickle eine Hypothese, warum dies der Fall ist, und diskutiere, welche physikalischen Prinzipien diese Beobachtung erklären.

Lösung:

Um zu erklären, warum kleinere Proteine während der Elektrophorese schneller durch das Gel wandern als größere Proteine, kann die folgende Hypothese entwickelt werden:

Hypothese: Kleinere Proteine wandern schneller durch das Polyacrylamidgel, weil sie weniger Widerstand erfahren, wenn sie durch die Matrix des Gels migrieren. Dies lässt sich durch mehrere physikalische Prinzipien erklären, insbesondere durch den Einfluss der Molekülgröße und -form auf die Bewegung durch ein poröses Medium.

• Physikalische Prinzipien:
  • Porengröße des Gels: Das Polyacrylamidgel hat eine netzartige Struktur mit Poren. Diese Poren wirken wie ein Sieb, das kleinere Moleküle leichter durchlässt als größere Moleküle. Kleinere Proteine können sich durch die Poren hindurchzwängen, während größere Proteine mehr Schwierigkeiten haben, durch diese hindurchzukommen.
  • Elektrophoretische Mobilität: Die SDS-PAGE basiert auf der Wanderung von Proteinen in einem elektrischen Feld. Da SDS den Proteinen eine gleichmäßige negative Ladung verleiht, hängt die Mobilität der Proteine während der Elektrophorese hauptsächlich von ihrer Größe ab. Kleinere Proteine bewegen sich schneller, weil sie weniger Widerstand in der Gelmatrix erfahren.
  • Reibungskraft: Die Reibungskraft, die auf ein Molekül wirkt, ist proportional zu seiner Größe. Größere Proteine haben eine größere Oberfläche, die mit der Gelmatrix wechselwirkt, was eine stärkere Reibung zur Folge hat und ihre Beweglichkeit hemmt. Kleinere Proteine erfahren weniger Reibung und können sich daher schneller bewegen.
  • Screening-Effekt: Die Polyacrylamidmatrix kann auch als ein dreidimensionales Sieb betrachtet werden, das die Bewegung von Molekülen in einer Weise behindert, die von ihrer Größe abhängt. Kleinere Proteine haben eine geringere hydrodynamische Größe, was bedeutet, dass sie weniger durch die Barrieren im Gel behindert werden.

Zusammengefasst lässt sich erklären, dass kleinere Proteine schneller durch das Gel wandern, weil sie aufgrund ihrer kleineren Größe weniger Widerstand in der porösen Gelmatrix erfahren und somit eine höhere elektrophoretische Mobilität besitzen. Diese Prinzipien führen dazu, dass in der SDS-PAGE eine effektive Trennung der Proteine basierend auf ihrer Molekülgröße möglich ist.

d)

Nach der Elektrophorese wird das Gel in eine Coomassie-Brillantblau-Lösung gegeben, um die Proteine sichtbar zu machen. Berechne die Konzentration von Protein in einer Probe, wenn 5 µL der Probe geladen werden und die Konzentration des Standards 1 mg/mL beträgt. Du beobachtest eine Bande auf dem Gel, die derselben Intensität wie die des Standardproteins entspricht.

Lösung:

Um die Konzentration von Protein in der Probe zu berechnen, nehmen wir an, dass die Proteinkonzentration des Standards und der Probe gleich ist, da die beobachtete Bande die gleiche Intensität aufweist wie die des Standardproteins.

Folgende Annahmen und Informationen stehen zur Verfügung:

• Das Ladevolumen der Probe beträgt 5 µL.
• Die Konzentration des Standardproteins beträgt 1 mg/mL.
• Die Intensität der beobachteten Bande der Probe entspricht der des Standardproteins.

Berechnung:

Da die Intensität der Bande der Probe der des Standards entspricht, können wir davon ausgehen, dass die Menge an Protein, die auf das Gel aufgetragen wurde, gleich ist. Dies bedeutet, dass die Konzentration der Probe gleich der Konzentration des Standards ist.

Die Konzentration des Standards beträgt:

1 mg/mL

Daher beträgt die Proteinkonzentration in der geladenen Probe ebenfalls:

1 mg/mL

Zusammengefasst, wenn die Bande der Probe die gleiche Intensität wie die des Standards hat, beträgt die Konzentration des Proteins in der Probe 1 mg/mL.