Modern Methods in Mass Spectrometry - Exam

Aufgabe 1)

Elektronenstoßionisation (EI) und ihre Anwendungen

EI (Elektronenstoßionisation) nutzt energiereiche Elektronen, um Moleküle zu ionisieren. Diese Methode erzeugt hauptsächlich positive Ionen durch die Entfernung eines Elektrons.

• Elektronenenergie: 70 eV üblich
• Ionisierungsprozess: M + e^- → M^+ + 2e^-
• Erzeugung von Fragmentionen, nützlich für Strukturanalyse
• Anwendung: weit verbreitet in GC-MS
• Geeignet für kleine, stabile Moleküle
• Limitierung: nicht geeignet für thermisch instabile oder große Biomoleküle

a)

Teilaufgabe 1:

Nehmen wir an, ein Molekül M hat eine Molekülmasse von 100 amu (atomic mass units). Während des Elektronenstoßionisation mit einer Elektronenenergie von 70 eV wird ein Elektron von M entfernt. Bestimme die Energie des resultierenden Ions M^+ in elektronvolt (eV) und beschreibe den energetischen Zustand von M^+ im Vergleich zu M. Gehe dabei davon aus, dass die Ionisierungsenergie des Moleküls M 10 eV beträgt.

Lösung:

Teilaufgabe 1:

Nehmen wir an, ein Molekül M hat eine Molekülmasse von 100 amu (atomic mass units). Während der Elektronenstoßionisation mit einer Elektronenenergie von 70 eV wird ein Elektron von M entfernt. Bestimme die Energie des resultierenden Ions M+ in Elektronenvolt (eV) und beschreibe den energetischen Zustand von M+ im Vergleich zu M. Gehe dabei davon aus, dass die Ionisierungsenergie des Moleküls M 10 eV beträgt.

Um dies zu lösen, gehen wir Schritt für Schritt vor:

• Schritt 1: Bestimme die Ionisierungsenergie. Gegeben ist, dass die Ionisierungsenergie des Moleküls M 10 eV beträgt. Dies bedeutet, dass es 10 eV Energie benötigt, um ein Elektron vom Molekül M zu entfernen und ein Ion M+ zu erzeugen.
• Schritt 2: Berechne die Energie des verbleibenden Elektrons. Wenn ein 70 eV Elektron auf das Molekül M trifft und 10 eV verbraucht werden, um das Elektron zu entfernen (Ionisierungsenergie), verbleiben 60 eV Energie.
• Schritt 3: Bestimme die Energie des resultierenden Ions M+. Da die Energie von 70 eV verwendet wurde, um die Bindung zu brechen und ein weiteres Elektron freizusetzen, ist die Energie von M+ in einem ionisierten Zustand höher als die ursprüngliche neutralen Energie. Die zusätzliche Energie, die das resultierende Ion M+ trägt, beträgt daher 60 eV.

Daher ist die Energie des resultierenden Ions M+:

70 eV - 10 eV = 60 eV

Der energetische Zustand des Ions M+ im Vergleich zu M:

• Das Ion M+ hat im Vergleich zum neutralen Molekül M eine um 10 eV höhere Energie.
• Das M+-Ion befindet sich in einem angeregten energetischen Zustand im Vergleich zu M, weil es einen Teil der Energie von den Elektronenstoßionisation zurückhält.

Zusammengefasst:

• Molecule M (neutral) hat eine bestimmte Energie.
• Während der Ionisation wird 10 eV Energie aufgebracht, um das Elektron abzuspalten.
• Das resultierende M+ Ion hat nun 60 eV Energie, was höher ist als die ursprüngliche Energie von M um 10 eV ionisierung.

b)

Teilaufgabe 2:

Erkläre anhand eines konkreten Beispiels (z. B. Butan), wie die Fragmentation während der EI zur Strukturanalyse genutzt werden kann. Zeichne das Hauptmolekül und mindestens zwei typische Fragmentionen, die durch EI entstehen würden. Beschreibe, wie die resultierenden masse-to-charge (m/z) Werte zur Interpretation des Spektrums beitragen.

Lösung:

Teilaufgabe 2:

Erkläre anhand eines konkreten Beispiels (z. B. Butan), wie die Fragmentation während der EI zur Strukturanalyse genutzt werden kann. Zeichne das Hauptmolekül und mindestens zwei typische Fragmentionen, die durch EI entstehen würden. Beschreibe, wie die resultierenden masse-to-charge (m/z) Werte zur Interpretation des Spektrums beitragen.

Schauen wir uns das Molekül Butan (C₄H₁₀) als Beispiel an:

Butan-Molekül:

 H   H   H   H |   |   |   | H-C-C-C-C-H |   |   |   |  H   H   H   H 

Während der Elektronenstoßionisation (EI) wird durch energiereiche Elektronen ein Elektron von einer Butan-Molekül entfernt, was zur Bildung von positiven Ionen führt. Dies kann auch zu Fragmentation führen. Die resultierenden Fragmente haben unterschiedliche masse-to-charge Verhältnisse (m/z), die im Massenspektrum erscheinen.

Typische Fragmentionen von Butan sind:

• Fragmention 1: Propyl-Ion (C₃H₇⁺)

   H   H   H |   |   | H-C-C-C |   |   |  H   H   H 

• Fragmention 2: Ethyl-Ion (C₂H₅⁺)

   H   H |   | H-C-C |   |  H   H 

Hier sind die berechneten m/z Werte:

• Butan (C₄H₁₀⁺): Molekülion, m/z = 58
• Propyl-Ion (C₃H₇⁺): m/z = 43
• Ethyl-Ion (C₂H₅⁺): m/z = 29

Interpretation des Spektrums:

• Das Peak bei m/z = 58 repräsentiert das gesamte Butan-Molekülion.
• Das Peak bei m/z = 43 deutet auf das Propyl-Ion hin, was darauf hinweist, dass das Molekül in drei Kohlenstoffatome (Propylgruppe) plus ein separates Kohlenstoffatom fragmentiert ist.
• Das Peak bei m/z = 29 deutet auf das Ethyl-Ion hin, was darauf hinweist, dass das Molekül in zwei Kohlenstoffatome (Ethylgruppe) und zwei separate Kohlenstoffatome fragmentiert ist.

Durch die Analyse solcher Fragmente und ihrer m/z Werte kann die Struktur des ursprünglichen Moleküls rekonstruiert werden. Dies macht die Elektronenstoßionisation besonders nützlich für die Strukturanalyse von kleinen und stabilen Molekülen.

Aufgabe 2)

Du arbeitest in einem Forschungslabor und untersuchst die Eigenschaften eines neuartigen Proteins, das mittels Flugzeitmassenspektrometrie (TOF-MS) analysiert werden soll. Dabei soll die Minutenmenge an Protein bestimmt und die Charakterisierung eine hohe Auflösung sicherstellen. Das TOF-MS-Experiment wird unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 15 kV und einer Detektionsstrecke von 1,5 m durchgeführt. Die Proteine besitzen eine Ladung von 2 Elementarladungen.

a)

Berechne die Flugzeit \(t\) eines Proteins mit einer Masse von 50 kDa (Kilodalton). Gehe davon aus, dass die Ladung des Proteins 2 Elementarladungen beträgt und die Beschleunigungsspannung 15 kV ist. Nutze die unten angegebene Formel und zeige alle Berechnungsschritte.

• Laufzeit: \[ t = d \sqrt{\frac{m}{2Uq}} \]

Lösung:

Um die Flugzeit (\textit{t}) eines Proteins mit einer Masse von 50 kDa (Kilodalton) zu berechnen, werden wir die gegebene Formel verwenden. Hier sind die Schritte zur Berechnung:

• Gegebene Formel: \( t = d \sqrt{\frac{m}{2Uq}} \)
• Beschleunigungsspannung \( U = 15 \ kV = 15,000 \ Volt \)
• Detektionsstrecke \( d = 1.5 \ m \)
• Ladung des Proteins \( q = 2 \ Elementarladungen = 2 \times 1.602 \times 10^{-19} \ Coulomb = 3.204 \times 10^{-19} \ C \)
• Masse des Proteins \( m = 50 \ kDa = 50,000 \ Dalton = 50,000 \times 1.66054 \times 10^{-27} \ kg = 8.3027 \times 10^{-23} \ kg \)

1. Setze die Werte in die Formel ein: \( t = 1.5 \sqrt{\frac{8.3027 \times 10^{-23}}{2 \times 15,000 \times 3.204 \times 10^{-19}}} \)
2. Berechne die Werte im Nenner: \( 2Uq = 2 \times 15,000 \times 3.204 \times 10^{-19} \ Coulomb = 9.612 \times 10^{-15} \ Joule \)
3. Berechne das Argument der Quadratwurzel: \( \frac{8.3027 \times 10^{-23}}{9.612 \times 10^{-15}} = 8.637 \times 10^{-9} \ kg \times \frac{1}{Joule} \)
4. Ziehe die Quadratwurzel: \( \sqrt{8.637 \times 10^{-9}} = 9.29 \times 10^{-5} \ s \)
5. Multipliziere mit der Detektionsstrecke: \( t = 1.5 \times 9.29 \times 10^{-5} = 1.394 \times 10^{-4} \ s \)

Die Flugzeit eines Proteins mit einer Masse von 50 kDa beträgt somit \( t \approx 1.394 \times 10^{-4} \ Sekunden \).

b)

Erkläre, warum eine lange Flugstrecke im TOF-MS zu einer höheren Auflösung des Massenspektrums führt. Welche praktischen Herausforderungen können bei der Erhöhung der Flugstrecke auftreten?

Lösung:

Warum führt eine lange Flugstrecke im TOF-MS zu einer höheren Auflösung des Massenspektrums?

• Im TOF-MS (Flugzeitmassenspektrometrie) werden Ionen anhand ihrer Flugzeit gemessen. Die Flugzeit eines Ions ist proportional zur Wurzel seiner Masse-zu-Ladung-Relation (m/z).
• Eine längere Flugstrecke führt dazu, dass die Ionen eine längere Zeit benötigen, um den Detektor zu erreichen. Dies bedeutet, dass selbst kleine Unterschiede in der m/z-Relation zu größeren Unterschieden in der Flugzeit führen.
• Diese größeren Flugzeitunterschiede bedeuten, dass das TOF-MS-Gerät die Ionen mit höherer Genauigkeit voneinander trennen kann, was zu einer höheren Auflösung des Massenspektrums führt.
• Durch die höhere Auflösung können verschiedene Ionenarten, die sehr ähnliche m/z-Werte haben, besser differenziert und identifiziert werden.

Praktische Herausforderungen bei der Erhöhung der Flugstrecke:

• Platzbedarf: Eine längere Flugstrecke erfordert mehr physikalischen Platz im Labor. Dies kann die Größe und das Design des TOF-MS-Geräts einschränken.
• Vacuum: Ein längerer Flugweg bedeutet, dass ein größerer Bereich im Instrument evakuiert werden muss, um Kollisionen der Ionen mit Luftmolekülen zu verhindern. Dies erfordert stärkere oder zusätzliche Vakuumpumpen und eine bessere Abdichtung.
• Drift: Eine längere Flugstrecke kann dazu führen, dass Ionen mehr Zeit haben, um seitlich abzuweichen (Drift) aufgrund von Restgasen oder elektrischen/magnetischen Feldern. Dies kann die Fokussierung und die Detektion der Ionen erschweren.
• Kosten: Der Bau und die Wartung eines TOF-MS-Geräts mit einer längeren Flugstrecke können teurer sein. Es müssen hochwertige Materialien und Technologien verwendet werden, um die Leistung und Zuverlässigkeit zu gewährleisten.
• Signalabfall: In einem längeren TOF-MS-System können die Ionen über längere Zeiträume verteilt werden, was die Signalstärke reduzieren kann. Es muss darauf geachtet werden, die Empfindlichkeit des Detektors zu maximieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine längere Flugstrecke im TOF-MS zu einer höheren Auflösung des Massenspektrums führt, aber auch verschiedene praktische Herausforderungen mit sich bringt, die berücksichtigt und gelöst werden müssen.

Aufgabe 3)

Orbitrap-Analysatoren: Hochauflösende Massenspektrometer basierend auf der Ionenfalle und Orbitalelektrostatischen Prinzipien.

• Funktionsweise: Ionen werden in einer Orbitrap gefangen und bewegen sich auf einer spiralförmigen Bahn.
• Detektion: Frequenz der Ionenbewegung wird zur Massenspektrenanalyse verwendet.
• Formel: Frequenz der Ionenbewegung ist gegeben durch \(f \propto \sqrt{m/z}\).
• Auflösung: Sehr hohe Massenauflösung (> 100.000).
• Anwendung: Proteomik, Metabolomik, Umweltanalytik.

a)

Erkläre das Funktionsprinzip eines Orbitrap-Analysators und die zugrundeliegenden physikalischen Prinzipien. Beschreibe insbesondere die Art der Bahn, auf der sich die Ionen bewegen, und die Methode zur Detektion der Massenspektren.

Lösung:

Funktionsprinzip eines Orbitrap-Analysators

Orbitrap-Analysatoren sind hochauflösende Massenspektrometer, die auf der Kombination von Ionenfallen und elektrostatischen Prinzipien beruhen. Im Folgenden werden das Funktionsprinzip und die zugrundeliegenden physikalischen Prinzipien detailliert erklärt.

Funktionsweise

• Fangen der Ionen: In einem Orbitrap-Analysator werden die Ionen in einer elektrostatischen Falle, der sogenannten Orbitrap, eingefangen. Diese Falle erzeugt ein elektrostatisches Feld, das die Ionen auf spezifischen Bahnen hält.
• Spiralförmige Bahn: Die Ionen bewegen sich entlang einer spiralförmigen Bahn, die durch die elektrostatischen Kräfte im Inneren der Orbitrap vorgegeben wird.
• Bewegung der Ionen: Die Frequenz der Ionenbewegung innerhalb der Orbitrap ist ein entscheidendes Merkmal für die Massenspektrometrie. Diese Frequenz ist proportional zur Quadratwurzel des Verhältnisses von Masse zu Ladung (\frac{{m}}{{z}}) der Ionen. Dies wird durch die folgende Formel beschrieben:

Formel: Die Frequenz der Ionenbewegung ist gegeben durch:

\[f \,\text {propto} \, \sqrt{\frac{m}{z}}\]

Detektion und Massenspektrenanalyse

• Detektionsmethode: Die Frequenz der Ionenbewegung wird zur Detektion und Analyse der Massenspektren genutzt. Detektoren messen die Frequenz, mit der die Ionen sich entlang ihrer Bahn bewegen, und konvertieren diese Frequenzinformationen in Massenspektren.
• Massenauflösung: Orbitrap-Analysatoren bieten eine sehr hohe Massenauflösung. Werte von über 100.000 sind typisch, was bedeutet, dass sehr genaue Messungen der Masse-zu-Ladung-Verhältnisse möglich sind.

Anwendung

• Orbitrap-Analysatoren finden Anwendung in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen, darunter:
• Proteomik: Untersuchung von Proteinen und deren Modifikationen.
• Metabolomik: Analyse von Metaboliten und deren Veränderungen unter verschiedenen Bedingungen.
• Umweltanalytik: Detektion und Quantifizierung von Schadstoffen in Umweltproben.

b)

Leite die Formel zur Frequenz der Ionenbewegung ( f \propto \sqrt{m/z}\) her und erkläre die Bedeutung der Variablen 'm' und 'z' in diesem Zusammenhang. Zeige, wie diese Beziehung eine sehr hohe Massenauflösung ermöglicht.

Lösung:

Herleitung der Frequenz der Ionenbewegung

Die Orbitrap-Analysatoren nutzen elektrostatische Prinzipien, um Ionen auf spiralförmigen Bahnen zu bewegen. Die Frequenz der Ionenbewegung in einer solchen Bahn und die daraus resultierende Massenauflösung können mithilfe physikalischer Prinzipien beschrieben werden.

Grundlegende Prinzipien

• Elektrostatisches Feld: Die Ionen werden in einem speziellen elektrischen Feld in der Orbitrap gefangen gehalten.
• Ionenbewegung: Die Ionen bewegen sich auf einer stabilen, spiralförmigen Bahn innerhalb dieser elektrostatischen Falle.
• Frequenzabhängigkeit: Die Frequenz der Ionenbewegung ist proportional zur Quadratwurzel des Verhältnisses von Masse zu Ladung (\(\frac{m}{z}\)).

Bedeutung der Variablen

• 'm': Steht für die Masse des Ions, üblicherweise in Dalton (Da) oder atomaren Masseneinheiten (u) gemessen.
• 'z': Repräsentiert die Ladung des Ions, die gleich der Anzahl der überschüssigen positiven oder negativen Elementarladungen ist.

Herleitung der Frequenzformel

Die Bewegung der Ionen im elektrostatischen Feld kann näherungsweise als Bewegung eines harmonischen Oszillators beschrieben werden. Wir beginnen mit der Analyse der Kräfte, die auf das Ion wirken:

• Das Potenzial in der Orbitrap kann als eine quadratische Funktion der Ionenposition beschrieben werden, was zu einer harmonischen Bewegung der Ionen führt. Die potentielle Energie \(U\) kann also geschrieben werden als:

\[U = \frac{1}{2} k r^2\]

• Hier ist \(k\) eine Konstante, die von der spezifischen Geometrie und dem elektrischen Feld der Orbitrap abhängt, und \(r\) ist der Abstand des Ions vom Mittelpunkt der Orbitrap.
• Die Schwingungsfrequenz \(\omega\) eines harmonischen Oszillators ist gegeben durch:

\[\omega = \sqrt{\frac{k}{m}}\]

• Da die Federkonstante \(k\) in diesem Fall proportional zur Ladung \(z\) des Ions ist (\(k = kz\)), erhalten wir:

\[\omega = \sqrt{\frac{kz}{m}}\]

• Da die Frequenz \(f\) mit \(\omega\) durch die Beziehung \(\omega = 2\pi f\) verknüpft ist, erhalten wir nach Umformung:

\[f \, \propto \, \sqrt{\frac{z}{m}}\]

• Verdeutlichen wir nun den Zusammenhang, indem wir dies umkehren:

\[f \, \propto \, \sqrt{\frac{m}{z}}\]

Bedeutung für die Massenauflösung

• Da die Frequenz \(f\) direkt mit dem Massen-zu-Ladungs-Verhältnis \(\frac{m}{z}\) verknüpft ist, erlauben genaue Frequenzmessungen eine präzise Bestimmung dieses Verhältnisses.
• Die hohe Massenauflösung der Orbitrap-Analysatoren (oft über 100.000) ermöglicht es, sehr kleine Unterschiede in \(\frac{m}{z}\) zu detektieren. Dies schafft die Voraussetzung, um komplexe molekulare Strukturen, wie Proteine oder Metaboliten, exakt zu analysieren.
• Die hohe Auflösung und Genauigkeit bei der Bestimmung von \(\frac{m}{z}\) machen Orbitrap-Analysatoren zu einem wertvollen Tool in der Proteomik, Metabolomik und Umweltanalytik.

c)

Diskutiere die spezifischen Anwendungsmöglichkeiten von Orbitrap-Analysatoren in der Proteomik. Gehe dabei auf die Vorteile der hohen Auflösung und Genauigkeit ein, und erläutere, wie diese Instrumente zur Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen und Peptiden beitragen können.

Lösung:

Anwendungsmöglichkeiten von Orbitrap-Analysatoren in der Proteomik

Die Proteomik befasst sich mit der Untersuchung der gesamten Proteinlandschaft eines Organismus, Gewebes oder einer Zelle unter bestimmten Bedingungen. Orbitrap-Analysatoren haben sich als äußerst nützliche Werkzeuge in der Proteomik erwiesen, hauptsächlich aufgrund ihrer hohen Auflösung und Genauigkeit.

Vorteile der hohen Auflösung und Genauigkeit

• Hohe Massenauflösung: Orbitrap-Analysatoren bieten eine Massenauflösung von über 100.000. Dies ermöglicht die Unterscheidung von Proteinen und Peptiden mit sehr ähnlichen Massen, die in anderen Massenspektrometern nicht unterscheidbar wären.
• Genauigkeit: Die hohe Massengenauigkeit reduziert die Unsicherheiten bei der Bestimmung der Molekularmasse von Proteinen und Peptiden. Dies erhöht die Zuverlässigkeit der Identifizierung und Quantifizierung.
• Empfindlichkeit: Orbitrap-Analysatoren sind auch in der Lage, sehr geringe Konzentrationen von Proteinen und Peptiden zu detektieren, was besonders nützlich für die Analyse von Proben mit niedriger Proteinkonzentration ist.

Identifizierung von Proteinen und Peptiden

• Peptidmassenfingerprinting: Ein häufig verwendeter Ansatz in der Proteomik ist das Peptidmassenfingerprinting, bei dem Proteine enzymatisch verdaut und die resultierenden Peptide anhand ihrer Masse identifiziert werden. Die hohe Auflösung der Orbitrap-Analysatoren ermöglicht eine präzise Bestimmung der Masse der Peptide und erleichtert so deren Identifizierung.
• Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS): Orbitrap-Analysatoren können auch in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie verwendet werden. Hierbei werden die Ionen weiter fragmentiert und die Masse der Fragmente bestimmt. Die hochauflösende Messung der Tochterionenmuster hilft bei der Sequenzierung von Peptiden und der Identifizierung von posttranslationalen Modifikationen.

Quantifizierung von Proteinen und Peptiden

• Label-freie Quantifizierung: Orbitrap-Analysatoren ermöglichen die absolut quantifizierte Messung von Proteinen und Peptiden ohne den Einsatz von Markierungsreagenzien. Die hohe Präzision und Auflösung führt zu genauen Quantifizierungsergebnissen.
• Isotopenmarkierung: Verfahren wie SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) nutzen Orbitrap-Analysatoren zur quantitativen Analyse. Die Fähigkeit der Orbitrap-Analysatoren, leichte Massenunterschiede aufgrund der Isotopenmarkierung zu erkennen, verbessert die Quantifizierungsergebnisse.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Orbitrap-Analysatoren durch ihre hohe Auflösung und Genauigkeit wesentliche Werkzeuge in der Proteomik sind. Sie ermöglichen die präzise Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen und Peptiden, was für die Erforschung biologischer Prozesse und Krankheitsmechanismen von großer Bedeutung ist.

Aufgabe 4)

Im Rahmen der modernen Methoden der Massenspektrometrie wirst Du damit beauftragt, ein Massenspektrum eines unbekannten Analyten zu analysieren. Die Schritte beinhalten die Peakdetektion, Basisliniekorrektur, Peak-Integration und die Berücksichtigung des natürlichen Vorkommens von Isotopen. Dabei sollen zufällige Fluktuationen unterdrückt und mathematische Modelle zur Spitzenerkennung angewendet werden. Für die Bearbeitung kannst Du dabei auf Software-Tools wie Xcalibur oder Skyline zurückgreifen.

a)

Teilaufgabe 1:

Beschreibe detailliert, welche Schritte Du zur Detektion und Identifikation der Peaks in einem Massenspektrum durchführst. Erläutere die Methoden zur Subtraktion der Basislinie und zur Rauschunterdrückung. Wie beeinflussen diese Schritte die Genauigkeit der Peakanalyse?

Lösung:

Teilaufgabe 1:

Die Detektion und Identifikation der Peaks in einem Massenspektrum erfordert eine Reihe von systematischen Schritten, um eine präzise Analyse zu gewährleisten. Hier sind die detaillierten Schritte und Methoden:

• Importieren der Daten: Zuerst müssen die Rohdaten des Massenspektrums in die Software (beispielsweise Xcalibur oder Skyline) importiert werden.
• Vorverarbeitung der Daten: Dazu gehören das Glätten des Spektrums, um zufällige Fluktuationen oder Rauschen zu unterdrücken. Häufig verwendete Methoden zur Rauschunterdrückung sind z.B. die Savitzky-Golay-Glättung oder Moving-Average-Filter.
• Basisliniekorrektur: Die Basislinie des Spektrums muss korrigiert werden, um sicherzustellen, dass nur die relevanten Peaks analysiert werden. Methoden zur Basisliniekorrektur umfassen Polynomial Fit, Convex Hull und den Rolling Ball Algorithmus. Diese Adjustierungen helfen dabei, die Hintergrund-Signalintensität zu minimieren.
• Peakdetektion: Der nächste Schritt ist die Erkennung der Peaks im Spektrum. Algorithmen wie der Watershed-Algorithmus, Centroid-Findung oder Fourier-Transformation werden verwendet, um die Position und Intensität der Peaks zu bestimmen.
• Integration der Peaks: Einmal detektierte Peaks werden integriert, um die Fläche unter den Peaks zu berechnen. Dies ist entscheidend für die Quantifizierung der Analyte. Techniken wie die Trapezregel oder numerische Integration werden verwendet.
• Identifikation der Peaks: Abschließend müssen die gefundenen Peaks identifiziert werden. Dies erfolgt durch Vergleich der gemessenen Massen (m/z-Verhältnisse) mit Referenzdatenbanken und durch Berücksichtigung der Isotopenverteilung des Analyten.

Einfluss der Schritte auf die Genauigkeit der Peakanalyse:

• Rauschunterdrückung: Durch die Glättung und Filterung des Spektrums wird das Rauschen reduziert, was die Genauigkeit bei der Erkennung tatsächlicher Peaks verbessert. Zu starke Glättung könnte jedoch kleine Peaks übersehen lassen.
• Basisliniekorrektur: Eine korrekte Basisliniekorrektur ist entscheidend, da sie verhindert, dass Hintergrundrauschen als Peak erkannt wird. Falsche Basisliniekorrektur kann zu fehlerhaften Integrationen und somit zu falschen Ergebnissen führen.
• Detektion und Integration: Gute Algorithmen für die Peakdetektion und -integration sind entscheidend, um eine präzise Quantifizierung zu gewährleisten. Fehler in diesen Schritten können zu ungenauen Messergebnissen führen.
• Identifikation der Peaks: Eine genaue Identifikation der Peaks durch Referenz-Datenbanken gewährleistet, dass die Zuordnung der Peaks korrekt ist. Fehlerhafte Identifikation führt zu falschen Analytenzuweisungen.

Durch die sorgfältige Durchführung jedes dieser Schritte lässt sich die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Peakanalyse in Massenspektren signifikant verbessern.

b)

Teilaufgabe 2:

Erkläre, wie Du die Fläche unter den Peaks zur Quantifizierung der Analyten berechnest. Gehe dabei auf die Wichtigkeit der korrekten Basisliniekorrektur ein und beschreibe, inwiefern das natürliche Vorkommen von Isotopen Deine Analyse beeinflusst.

Lösung:

Teilaufgabe 2:

Die Berechnung der Fläche unter den Peaks ist ein entscheidender Schritt zur Quantifizierung der Analyten in einem Massenspektrum. Dafür sind mehrere Schritte notwendig, die präzise ausgeführt werden müssen. Hier ist der detaillierte Prozess:

• Basisliniekorrektur: Bevor die Fläche unter den Peaks berechnet werden kann, ist eine korrekte Basisliniekorrektur unerlässlich. Die Basislinie repräsentiert den Hintergrundsignalwert, der aus verschiedenen Quellen wie chemischem Rauschen oder elektronischen Störungen resultieren kann. Eine unsachgemäße Basislinie würde zu einer falschen Integration führen. Methoden wie Polynomial Fit, Convex Hull oder der Rolling Ball Algorithmus können verwendet werden, um die Basislinie korrekt zu bestimmen.
• Peakdetektion: Nachdem die Basislinie korrigiert wurde, werden die Peaks im Spektrum erkannt. Dies geschieht durch Algorithmen wie den Watershed-Algorithmus oder die Centroid-Findung.
• Integration der Peaks: Die Fläche unter jedem Peak wird mithilfe numerischer Integrationsverfahren berechnet. Methoden wie die Trapezregel oder die Simpson-Regel sind hier üblich. Der integrierte Bereich entspricht der Menge des Analyten.

Einfluss des natürlichen Vorkommens von Isotopen:

• Analyse von Isotopenmustern:
• Jede chemische Substanz kann in der Natur in verschiedenen Isotopenformen vorliegen (z.B. Kohlenstoff als ¹²C und ¹³C). Diese natürlichen Isotope müssen bei der Analyse berücksichtigt werden, da sie zusätzliche Peaks im Massenspektrum erzeugen können.
• Berücksichtigt man die Isotopenverteilung nicht, könnte es zu Missinterpretationen der Peaks und somit zu falschen Quantifizierungen kommen. Ein Beispiel wäre, dass der Peak eines schwereren Isotops als der Hauptanalyte missinterpretiert wird.
• Um dies zu verhindern, wird die Isotopenverteilung des vermuteten Analyten berechnet und mit dem gemessenen Spektrum verglichen. Tools wie Skyline bieten integrierte Funktionen zur Isotopenanalyse, die genutzt werden können, um die natürlichen Isotopenverteilungen korrekt zu berücksichtigen.

Wichtigkeit der korrekten Basisliniekorrektur:

• Einfache und präzise Messung:
• Eine ordnungsgemäße Basisliniekorrektur ist entscheidend, um exakte Integrationen zu erhalten. Ohne sie würden die Flächenberechnungen durch Hintergrundrauschen verfälscht und die Messungen ungenau werden.
• Verlässliche Quantifizierung:
• Nur durch die Korrektur der Basislinie kann eine genaue Quantifizierung des Analyten sichergestellt werden, da so garantiert wird, dass ausschließlich das Signal des Analyten und nicht das Hintergrundrauschen integriert wird.

Durch die präzise Durchführung dieser Schritte lassen sich genaue und verlässliche Ergebnisse bei der Quantifizierung von Analyten in einem Massenspektrum erreichen.

c)

Teilaufgabe 3:

Ein Massenspektrum zeigt Peaks bei m/z-Werten von 100, 101, und 102, mit relativen Intensitäten von 100%, 20%, und 1%. Berechne die zu erwartenden Massenspektren diese Werte für das Analyten-Isotopenmuster und identifiziere den möglichen Ursprung der Peaks. Erkläre, wie mathematische Modelle (z.B. Gaussian, Lorentzian) zur Spitzenerkennung in diesem Fall angewendet werden können.

Lösung:

Teilaufgabe 3:

Um die möglichen Ursprünge der Peaks im Massenspektrum bei m/z-Werten von 100, 101 und 102 mit relativen Intensitäten von 100%, 20% und 1% zu identifizieren, müssen wir das Isotopenmuster des Analyten betrachten.

• Analyse der m/z-Werte und relativen Intensitäten:
• Die Peaks bei m/z-Werten von 100, 101, und 102 deuten auf ein Isotopenmuster hin, das typischerweise natürliche Isotopenvariationen widerspiegelt.
• Der Peak bei m/z 100 repräsentiert das Molekül ohne schwere Isotope (Hauptisotop).
• Der Peak bei m/z 101 könnte durch das Molekül mit einem zusätzlichen Neutron verursacht werden, häufig durch ¹³C.
• Der Peak bei m/z 102 könnte durch das Molekül mit zwei zusätzlichen Neutronen verursacht werden, was auf das Vorhandensein von zwei ¹³C-Atomen hinweist.
• Berechnung des Analyten-Isotopenmusters:
• Die natürliche Häufigkeit des Kohlenstoffisotops ¹²C beträgt etwa 98.9%, während ¹³C etwa 1.1% beträgt.
• Für ein Molekül mit n Kohlenstoffatomen beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass ein Molekül ein ¹³C-Atom enthält, etwa n * 1.1%.
• Beispielsweise für ein Molekül mit 5 Kohlenstoffatomen:
• Peak bei m/z 100: Basismolekül, relative Intensität 100%
• Peak bei m/z 101: Molekül mit einem ¹³C-Atom, relative Intensität etwa 5 * 1.1% = 5.5%
• Peak bei m/z 102: Molekül mit zwei ¹³C-Atomen, relative Intensität etwa (5 choose 2) * (1.1%)^2 ≈ 0.03%.
• Da die beobachteten Intensitäten von 20% und 1% etwas höher sind, könnte es ein Hinweis auf ein Molekül mit einer höheren Anzahl an Kohlenstoffatomen sein.
• Anwendung mathematischer Modelle zur Spitzenerkennung:
• Gaussian-Modelle: Diese Modelle sind nützlich für die Modellierung symmetrischer Peaks im Massenspektrum. Die gauss'sche Funktion lautet:

 f(x) = a \exp\left( -\frac{(x - b)^2}{2c^2} \right) 

• a ist die Höhe des Peaks,
• b ist der Mittelwert (Position des m/z-Werts),
• c ist die Standardabweichung (Breite des Peaks).
• Gaussian-Modelle sind nützlich, um symmetrische Peaks zu beschreiben und zu modellieren.

 f(x) = \frac{a}{\pi c} \left( \frac{1}{1 + \left( \frac{x - b}{c} \right)^2} \right) 

• a ist die Höhe des Peaks,
• b ist der Mittelwert (Position des m/z-Werts),
• c ist die Halbwertsbreite des Peaks.

Zusammengefasst: Die Peaks bei m/z-Werten 100, 101 und 102 deuten auf Isotopenmuster hin, vermutlich von Kohlenstoffisotopen. Mathematische Modelle wie Gaussian und Lorentzian helfen bei der präzisen Erkennung und Modellierung der Peakformen, was die Analyse und Quantifizierung der Analyten im Massenspektrum verbessert.