Humangenetik - Exam

Aufgabe 1)

Das menschliche Genom besteht aus verschiedenen strukturellen Komponenten, die spezifische Funktionen und Eigenschaften besitzen. Einige dieser strukturellen Bestandteile des Genoms umfassen:

• Introns: nicht-kodierende Sequenzen innerhalb von Genen
• Exons: kodierende Sequenzen, die Proteine produzieren
• Promotoren: Regionen vor Genen zur Transkriptionskontrolle
• Enhancer: DNA-Abschnitte, die Transkriptionsrate erhöhen
• Repetitive Elemente: wiederholte DNA-Sequenzen (z.B. Satelliten-DNA, Minisatelliten)
• Telomere: Enden der Chromosomen, Schutz vor Abbau
• Zentromere: zentrale Bereiche für Chromosomentransport
• Non-coding RNA (ncRNA): RNA-Moleküle ohne Proteinproduktion, z.B. tRNA, rRNA

a)

Erkläre detailliert die Rolle der Introns in eukaryotischen Zellen. Warum sind diese nicht-kodierenden Sequenzen trotz ihrer scheinbaren Inaktivität wichtig für die genomische Stabilität und Genregulation?

Lösung:

In eukaryotischen Zellen spielen Introns, die nicht-kodierenden Sequenzen innerhalb von Genen, eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen, obwohl sie keine Proteine kodieren. Hier sind einige Gründe, warum Introns für die genomische Stabilität und Genregulation wichtig sind:

• Alternatives Spleißen: Introns ermöglichen das alternative Spleißen, bei dem unterschiedliche Kombinationen von Exons miteinander verbunden werden können. Dies führt zur Produktion verschiedener Proteinvarianten aus einem einzelnen Gen, was die Vielfalt und Komplexität der Proteome erhöht.
• Genregulation: Introns enthalten oft regulatorische Elemente, die die Expression von Genen kontrollieren. Diese Elemente können die Effizienz der Transkription, die Stabilität der mRNA und die Translation beeinflussen.
• Evolutionäre Vorteile: Introns können genetische Variation und evolutionäre Anpassungen fördern. Durch das Einfügen und Entfernen von Introns können neue Gene und Funktionen entstehen.
• Genomische Stabilität: Introns können die Struktur des Chromatins beeinflussen und so zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität beitragen. Sie können auch als Pufferzonen dienen, die Mutationen und chromosomale Brüche abfangen.
• RNA-Transport und -Prozessierung: Die Anwesenheit von Introns kann den Export der mRNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma und deren nachfolgende Prozessierung beeinflussen. Bestimmte Introns können Signalsequenzen enthalten, die für den richtigen Transport und die korrekte Modifikation der mRNA erforderlich sind.

Obwohl Introns scheinbar keine direkte Rolle in der Kodierung von Proteinen spielen, tragen sie somit erheblich zur Komplexität, Anpassungsfähigkeit und Stabilität des eukaryotischen Genoms bei.

b)

Beschreibe den Prozess der Transkriptionskontrolle durch Promotoren und Enhancer. Wie interagieren diese beiden Komponenten miteinander, um die Genexpression zu regulieren?

Lösung:

Die Transkriptionskontrolle durch Promotoren und Enhancer ist ein komplexer Prozess, der die Genexpression in eukaryotischen Zellen reguliert. Hier eine detaillierte Beschreibung dieser beiden Komponenten und ihrer Interaktion:

• Promotoren: Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die sich in der Regel direkt vor einem Gen befindet. Er enthält spezifische Erkennungsstellen für die RNA-Polymerase und andere Transkriptionsfaktoren. Zu den wichtigen Elementen innerhalb eines Promotors gehören:
• TATA-Box: Eine häufige DNA-Sequenz, die etwa 25 bis 30 Basenpaare stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts liegt und als Bindungsstelle für die TATA-Bindeproteine dient. Diese binden die RNA-Polymerase und initiieren die Transkription.
• Transkriptions-Startpunkt: Der Ort, an dem die RNA-Polymerase mit der Synthese der mRNA beginnt.
• Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren: Mehrere spezifische Sequenzmotive im Promotor, die von Transkriptionsfaktoren erkannt werden, welche die Bindung der RNA-Polymerase und den Start der Transkription regulieren.
• Enhancer: Enhancer sind DNA-Abschnitte, die weit entfernt von dem Gen, das sie regulieren, vor, hinter oder sogar innerhalb eines Gens liegen können. Sie erhöhen die Transkriptionsrate eines Gens signifikant. Zu den wichtigen Aspekten eines Enhancers gehören:
• Distanziert und flexibel: Enhancer können weit entfernt von dem zu regulierenden Gen liegen und ihre Position relativ zum Gen kann stark variieren.
• Bindungsstellen für Aktivator-Proteine: Sie enthalten spezifische Sequenzen, an die Aktivatorproteine binden. Diese Proteine bilden zusammen mit den Enhancer-Sequenzen Transkriptions-Komplexe, welche die Effizienz und Rate der Transkription erhöhen.
• Interaktion zwischen Promotoren und Enhancern: Die Koordination zwischen Promotoren und Enhancern ist essenziell für die präzise Regulation der Genexpression. Diese Interaktion erfolgt auf folgenden Wegen:
• Chromatin-Looping: Die DNA kann sich in Schleifen biegen, sodass der Enhancer physisch näher zum Promotor gebracht wird, was die Interaktion zwischen den gebundenen Transkriptionsfaktoren und Aktivatorproteinen erleichtert.
• Mediator-Komplex: Ein großer Proteinkomplex, genannt Mediator, vermittelt die Kommunikation zwischen Enhancer-gebundenen Aktivatoren und den Transkriptionsfaktoren am Promotor. Er bildet eine Brücke und hilft, die RNA-Polymerase an den Startpunkt zu rekrutieren und zu aktivieren.
• Kooperative Bindung: Enhancer und Promotoren können durch gemeinsame Transkriptionsfaktoren oder Koaktivatoren verbunden sein. Diese Faktoren wirken kooperativ, um die Transkriptionsaktivität zu erhöhen und sicherzustellen, dass das Gen zur richtigen Zeit und im richtigen Zelltyp exprimiert wird.

Zusammen ermöglichen Promotoren den grundlegenden Start der Transkription, während Enhancer die Effizienz und Spezifität der Genexpression erhöhen, oft in Abhängigkeit von zellulären Signalen und den Bedürfnissen der Zelle.

c)

Eine genetische Untersuchung ergab, dass ein bestimmtes Chromosom mehrere Minisatelliten-Sequenzen enthält. Wie können diese repetitiven Elemente genutzt werden, um Individuen in der forensischen Wissenschaft zu identifizieren? Erläutere den methodischen Ansatz und die wissenschaftlichen Prinzipien.

Lösung:

Minisatelliten-Sequenzen, auch als Variable Number Tandem Repeats (VNTRs) bekannt, sind kurze, sich wiederholende DNA-Sequenzen, die mehrfach hintereinander in spezifischen Regionen des Genoms auftreten. Aufgrund ihrer hohen Variabilität von Individuum zu Individuum eignen sie sich hervorragend zur Identifikation von Personen in der forensischen Wissenschaft. Hier ist ein detaillierter Überblick über den methodischen Ansatz und die wissenschaftlichen Prinzipien:

• Grundkonzept: Die Anzahl der Wiederholungen in Minisatelliten-Sequenzen variiert stark zwischen verschiedenen Individuen. Diese Unterschiede können genutzt werden, um ein genetisches Profil zu erstellen, das für jede Person einzigartig ist.
• Entnahme von DNA-Proben: In der forensischen Wissenschaft wird DNA aus biologischen Proben wie Blut, Speichel, Haaren oder Hautzellen entnommen. Diese Proben können von einem Tatort oder von Verdächtigen stammen.
• DNA-Extraktion: Die DNA wird aus den Proben isoliert und gereinigt, um sicherzustellen, dass nur die Nukleinsäuren und keine Verunreinigungen vorhanden sind, die die Analyse beeinflussen könnten.
• Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Spezifische Minisatelliten-Sequenzen werden mittels PCR amplifiziert. Dazu werden Primer verwendet, die an den DNA-Regionen binden, die die Minisatelliten flankieren. Die PCR erzeugt mehrere Kopien der Zielsequenzen, sodass genug Material für weitere Analysen vorhanden ist.
• Gel-Elektrophorese: Die amplifizierten DNA-Fragmente werden durch Gel-Elektrophorese getrennt. Dabei wandern die DNA-Fragmente durch ein Gel, unterstützt von einem elektrischen Feld. Da verschiedene Personen unterschiedlich lange Minisatelliten-Sequenzen haben, treten die Fragmente in unterschiedlicher Position im Gel auf.
• Visualisierung und Analyse: Die Position und Anzahl der DNA-Banden im Gel werden visualisiert und analysiert. Die Muster der Banden sind einzigartig für jedes Individuum, ähnlich wie ein genetischer Fingerabdruck.
• Vergleich mit Referenzproben: Das genetische Profil der gesammelten Proben wird mit dem Profil von Verdächtigen oder mit bekannten DNA-Mustern in Datenbanken verglichen. Stimmen die Muster überein, kann dies eine Identifizierung ermöglichen.
• Wissenschaftliche Prinzipien: Die Verwendung von Minisatelliten-Sequenzen in der Forensik basiert auf den Prinzipien der genetischen Variabilität und der Vererbung. Jeder Mensch erbt Minisatelliten von beiden Elternteilen, was ein einzigartiges Muster ergibt. Diese Muster bleiben stabil und können daher zuverlässig zur Identifikation verwendet werden.

Zusammengefasst nutzen forensische Wissenschaftler Minisatelliten-Sequenzen durch DNA-Extraktion, PCR-Amplifikation und Gel-Elektrophorese, um genetische Profile zu erstellen und individuelle Unterschiede in der DNA zu quantifizieren. Diese Methoden ermöglichen die präzise Identifikation von Personen basierend auf ihren genetischen Merkmalen.

d)

Telomere haben eine Schlüsselfunktion am Ende von Chromosomen. Leite mathematisch her, wie die Verkürzung der Telomerlänge pro Zellteilung zum zellulären Altern beiträgt. Nutze die Formel: \(L_{n} = L_{0} - n \times \frac{dL}{dt}\), wobei \(L_{n}\) die Telomerlänge nach \(n\) Teilungen ist, \(L_{0}\) die anfängliche Telomerlänge, und \(\frac{dL}{dt}\) ist die Telomerlängenverkürzung pro Teilung.

Lösung:

Das Konzept der Telomerlänge und ihre Verkürzung spielt eine zentrale Rolle beim zellulären Altern. Die Telomere sitzen an den Enden der Chromosomen und schützen diese vor Schäden und Abbau. Mit jeder Zellteilung verkürzen sich die Telomere ein wenig, bis eine kritische Länge erreicht ist, die das weitere Zellwachstum und die Teilung hemmt. Diese fortschreitende Verkürzung führt letztlich zum zellulären Altern. Schauen wir uns die mathematische Herleitung genauer an:

Wir beginnen mit der gegebenen Formel:

L_{n} = L_{0} - n \times \frac{dL}{dt}

Hierbei entspricht:

• L_{n} der Telomerlänge nach n Teilungen,
• L_{0} der anfänglichen Telomerlänge,
• n der Anzahl der Zellteilungen und
• \frac{dL}{dt} der Verkürzung der Telomerlänge pro Teilung.

Wir möchten nun verstehen, wie die Verkürzung der Telomerlänge mit jeder Zellteilung zum zellulären Altern führt. Nehmen wir die anfängliche Telomerlänge (L_{0}) als bekannt an und betrachten die Verkürzung der Telomere bei jeder Teilung:

Ein Schritt für Schritt Prozess:

1. Anfängliche Telomerlänge (L_{0}):

Dies ist die Länge der Telomere in neu gebildeten Zellen, bevor jegliche Teilungen stattfinden.

2. Telomerlängen-Verkürzung pro Teilung (dL/dt):

Diese Konstante gibt an, um wie viele Basenpaare die Telomere bei jeder Zellteilung kürzer werden.

3. Anzahl der Zellteilungen (n): Pro Zellteilung verkürzen sich die Telomere um dL/dt.

4. Berechnung der Telomerlänge nach n Teilungen (L_{n}):

L_{n} = L_{0} - n \times \frac{dL}{dt}

Praktisches Beispiel:

Angenommen, wir haben eine anfängliche Telomerlänge von L_{0} = 10.000 Basenpaaren (bp) und eine Verkürzung pro Zellteilung \frac{dL}{dt} = 100 bp. Nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen (sagen wir n = 50), können wir die Telomerlänge nach diesen Teilungen berechnen.

• Anfangslänge: L_{0} = 10.000 bp
• Verkürzung pro Teilung: \frac{dL}{dt} = 100 bp
• Anzahl der Teilungen: n = 50

Berechnung:

L_{n} = 10.000 bp - 50 \times 100 bp = 10.000 bp - 5.000 bp = 5.000 bp

Nach 50 Zellteilungen beträgt die Telomerlänge also noch 5.000 Basenpaare.

Die kritische Telomerlänge, bei der die Zelle aufhört, sich zu teilen (seneszent wird), liegt typischerweise bei etwa 4.000 bis 5.000 Basenpaaren. Das bedeutet, dass die Zelle nach etwa 50 Zellteilungen die kritische Grenze erreicht und das zelluläre Altern beginnt.

Zusammengefasst: Diese mathematische Herleitung zeigt, wie die fortschreitende Verkürzung der Telomere mit jeder Zellteilung letztlich zum zellulären Altern beiträgt.

Aufgabe 2)

Eine Patientin stellt sich in Deiner Praxis vor, bei deren ungeborenem Kind eine Trisomie 21 diagnostiziert wurde. Analysiere die Art der Chromosomenaberration und erkläre den Unterschied zu strukturellen Aberrationen.

a)

Beschreibe den genetischen Mechanismus, der zur Entstehung der Trisomie 21 führt. Welche Fehler in der Zellteilung sind dafür verantwortlich?

Lösung:

Genetischer Mechanismus der Trisomie 21

Trisomie 21, auch bekannt als Down-Syndrom, entsteht durch das Vorhandensein eines zusätzlichen Chromosoms 21. Das bedeutet, dass anstelle der normalen zwei Kopien von Chromosom 21, drei solcher Kopien in den Zellen vorhanden sind. Dies führt zu einem Chromosomensatz von insgesamt 47 Chromosomen statt der üblichen 46.

Der genetische Mechanismus, der zur Entstehung der Trisomie 21 führt, ist in der Regel eine Fehlverteilung der Chromosomen während der Zellteilung, ein Prozess bekannt als Non-Disjunktion. Diese Non-Disjunktion kann entweder während der Meiose oder der Mitose auftreten:

• Meiose I: Wenn die Homologen Chromosomenpaare in der ersten Teilung der Meiose nicht richtig getrennt werden, können beide Chromosomen des Paares in die gleiche Tochterzelle wandern. Dies führt zu einer Gamete (Eizelle oder Spermium) mit zwei Kopien des Chromosoms 21.
• Meiose II: Wenn die Schwesterchromatiden des Chromosoms 21 in der zweiten Teilung der Meiose nicht richtig getrennt werden, kann dies auch eine Gamete mit zwei Kopien des Chromosoms 21 zur Folge haben.
• Mitose: Selten kann Non-Disjunktion auch während der frühen Zellteilung nach der Befruchtung auftreten, was zu einem Mosaik-Down-Syndrom führen kann, bei dem einige Zellen des Körpers die normale Chromosomenzahl von 46 und andere Zellen eine Trisomie 21 haben.

Diese Fehler in der Zellteilung führen zur Bildung einer Zygote mit drei Kopien des Chromosoms 21, die sich dann während der Entwicklung des Embryos weiter teilt und das zusätzliche Chromosom in allen Zellen des Körpers trägt.

b)

Erkläre, wie Du Trisomie 21 diagnostizieren würdest. Welche Methoden würdest Du anwenden und warum? Gehe auf drei spezifische Techniken ein und erläutere ihre Vor- und Nachteile.

Lösung:

Diagnose von Trisomie 21

Trisomie 21 kann auf verschiedene Weise diagnostiziert werden, und es gibt mehrere Techniken, die in der pränatalen Diagnostik verwendet werden. Im Folgenden werden drei spezifische Methoden erläutert:

• Nackentransparenzmessung (NT-Messung)
  • Beschreibung: Diese Ultraschalluntersuchung wird in der Regel zwischen der 11. und 14. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Sie misst die Dicke der Flüssigkeitsansammlung im Nacken des Fötus.
  • Vorteile: Diese Methode ist nicht-invasiv und birgt kein Risiko für Mutter oder Kind.
  • Nachteile: Die NT-Messung allein kann nur ein erhöhtes Risiko für Trisomie 21 anzeigen, liefert aber keine definitive Diagnose. Sie sollte zusammen mit Bluttests und Hintergrundinformationen der Mutter berücksichtigt werden.
• Amniozentese (Fruchtwasseruntersuchung)
  • Beschreibung: Diese invasive Methode wird normalerweise zwischen der 15. und 20. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Dabei wird eine kleine Menge Fruchtwasser aus der Gebärmutter entnommen, das Zellen des Fötus enthält. Diese Zellen werden dann auf Chromosomenanomalien untersucht.
  • Vorteile: Die Amniozentese liefert eine definitive Diagnose von Trisomie 21 mit einer sehr hohen Genauigkeit.
  • Nachteile: Das Verfahren birgt ein kleines Risiko von Komplikationen, einschließlich Fehlgeburt (ca. 0,1-0,3%).
• Chorionzottenbiopsie (CVS)
  • Beschreibung: Diese invasive Methode wird in der Regel zwischen der 10. und 13. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Dabei wird eine Probe der Chorionzotten (Plazentagewebe) entnommen und auf Chromosomenanomalien untersucht.
  • Vorteile: CVS kann früher als die Amniozentese durchgeführt werden und bietet eine definitive Diagnose von Trisomie 21.
  • Nachteile: Wie die Amniozentese birgt das Verfahren ein Risiko von Komplikationen, einschließlich Fehlgeburt (ca. 0,5-1%).
• Nicht-invasiver pränataler Test (NIPT)
  • Beschreibung: Dieser Bluttest wird ab der 10. Schwangerschaftswoche durchgeführt. Er analysiert zellfreie fetale DNA, die im Blut der Mutter zirkuliert, auf Chromosomenanomalien.
  • Vorteile: NIPT ist nicht-invasiv und birgt kein Risiko für Mutter oder Kind. Es hat eine hohe Sensitivität und Spezifität für die Erkennung von Trisomie 21.
  • Nachteile: Obwohl NIPT sehr genau ist, handelt es sich um einen Screening-Test und keine definitive Diagnose. Ein positives Ergebnis sollte durch invasive Diagnosetests wie Amniozentese oder CVS bestätigt werden.

c)

Vergleiche und kontrastiere numerische Chromosomenaberrationen wie Trisomie 21 mit strukturellen Chromosomenaberrationen. Nenne jeweils zwei Beispiele für strukturelle Aberrationen und deren genetische und phänotypische Auswirkungen.

Lösung:

Vergleich zwischen Numerischen und Strukturellen Chromosomenaberrationen

Die Chromosomenaberrationen lassen sich in zwei Hauptkategorien unterteilen: numerische und strukturelle Aberrationen. Trisomie 21 ist ein Beispiel für eine numerische Chromosomenaberration. Um den Unterschied zu verstehen, werden wir beide Arten von Aberrationen genauer betrachten und Beispiele für strukturelle Aberrationen anführen.

Numerische Chromosomenaberrationen

Numerische Aberrationen entstehen durch eine abnormale Anzahl von Chromosomen. Bei Trisomie 21 gibt es eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21, was zu einem Chromosomensatz von 47 statt der normalen 46 führt. Diese Art der Aberration führt zu einem Übermaß an genetischem Material und kann multiple Entwicklungsstörungen und phänotypische Anomalien verursachen.

• Beispiele für numerische Aberrationen:
  • Trisomie 18 (Edwards-Syndrom): Eine zusätzliche Kopie von Chromosom 18 führt zu schweren körperlichen und geistigen Entwicklungsstörungen und einer verkürzten Lebenserwartung.
  • Monosomie X (Turner-Syndrom): Bei Frauen fehlt ein X-Chromosom, was zu fehlender oder unvollständiger Entwicklung sekundärer Geschlechtsmerkmale und anderen gesundheitlichen Problemen führt.

Strukturelle Chromosomenaberrationen

Strukturelle Aberrationen betreffen die physische Struktur eines Chromosoms. Diese Aberrationen entstehen durch Brüche und falsch verbundene Chromosomensegmente. Dies kann zu Verlust oder Verdopplung von Genen führen, was wiederum sowohl genetische als auch phänotypische Konsequenzen hat.

• Beispiele für strukturelle Aberrationen:
  • Deletionssyndrom: Teile eines Chromosoms gehen verloren. Beispiel: Wolf-Hirschhorn-Syndrom wird durch eine Deletion am kurzen Arm von Chromosom 4 verursacht (4p-). Genetische Auswirkungen: Verlust von Genen, die für normale Entwicklung und Funktion notwendig sind. Phänotypische Auswirkungen: Schwere geistige und körperliche Entwicklungsstörungen, typische Gesichtszüge.
  • Translokation: Ein Segment eines Chromosoms wird auf ein anderes Nicht-Homologes Chromosom übertragen. Beispiel: Philadelphia-Chromosom, eine reziproke Translokation zwischen Chromosom 9 und 22 (t(9;22)(q34;q11)). Genetische Auswirkungen: Bildung der BCR-ABL-Fusionsgene, was zur chronischen myeloischen Leukämie (CML) führt. Phänotypische Auswirkungen: Erhöhte weiße Blutkörperchen und erweiterte Milz sowie weitere Symptome im Zusammenhang mit CML.

Unterschiede und Gemeinsamkeiten

• Unterschiede:
  • Numerische Aberrationen betreffen die Anzahl der Chromosomen, während strukturelle Aberrationen die physische Struktur der Chromosomen betreffen.
  • Numerische Aberrationen führen oft zu generalisierten Entwicklungsstörungen, während strukturelle Aberrationen oft spezifischere genetische und phänotypische Auswirkungen haben können.
• Gemeinsamkeiten:
  • Beide Arten von Aberrationen können durch Fehler in der Zellteilung entstehen.
  • Beide können erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit und die Entwicklung des Individuums haben.

Aufgabe 3)

FISH (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)Methode zur Visualisierung spezifischer DNA-Sequenzen auf Chromosomen mittels fluoreszierender Sonden.

• Sonden binden spezifisch an komplementäre DNA-Sequenzen.
• Chromosomenpräparation notwendig.
• Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.
• Anwendung: Diagnostik genetischer Anomalien (z.B. Deletionen, Duplikationen).
• Ermöglicht Identifikation und Lokalisierung spezifischer Gene.
• Wird in der pränatalen Diagnostik und Tumorzytogenetik verwendet.

a)

Beschreibe den prinzipiellen Ablauf der FISH-Methode vom Beginn der Chromosomenpräparation bis zur Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Lösung:

Prinzipieller Ablauf der FISH-Methode:

• 1. Chromosomenpräparation:Die Zellen werden kultiviert und auf einem Objektträger fixiert, sodass die Chromosomen sichtbar werden. Die Zellmembranen werden lysiert, um auf die Chromosomen zugreifen zu können.
• 2. Denaturierung:Die DNA-Doppelstränge werden durch Erhitzen oder chemische Behandlung denaturiert, sodass die DNA-Einzelstränge zugänglich werden.
• 3. Hybridisierung:Fluoreszenzmarkierte Sonden, die spezifisch an komplementäre DNA-Sequenzen binden, werden auf die denaturierten Chromosomen aufgetragen. Diese Sonden binden an ihre Zielsequenzen auf den Chromosomen.
• 4. Waschschritte:Nicht spezifisch gebundene Sonden werden durch eine Serie von Waschschritten entfernt, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren und die Spezifität der Signale zu erhöhen.
• 5. Färbung:Die Chromosomen und Zellkerne werden gegebenenfalls zusätzlich mit einer DNA-Färbung (z.B. DAPI) gefärbt, um die Chromosomenstruktur deutlicher sichtbar zu machen.
• 6. Visualisierung:Die präparierten Objektträger werden unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die fluoreszierenden Sonden ermöglichen die Identifizierung und Lokalisierung spezifischer DNA-Sequenzen auf den Chromosomen. Das Ergebnis wird oft als farbige Punkte oder Bänder auf den Chromosomen sichtbar.

b)

Diskutiere, wie die FISH-Methode bei der Diagnose einer Mikrodeletion auf Chromosom 15 angewendet werden kann. Gehe sowohl auf die theoretischen als auch praktischen Schritte ein.

Lösung:

Diskussion zur Anwendung der FISH-Methode bei der Diagnose einer Mikrodeletion auf Chromosom 15Die FISH-Methode kann effektiv zur Diagnose einer Mikrodeletion auf Chromosom 15 genutzt werden, indem sie die spezifische Bindung fluoreszierender Sonden an DNA-Sequenzen ermöglicht, die für die betroffene Region spezifisch sind. Hierbei folgen wir einer Reihe von theoretischen und praktischen Schritten:

• Theoretische Schritte:1. Identifikation der Zielregion: Bestimme die spezifische Region auf Chromosom 15, die untersucht werden soll (z.B. Prader-Willi-Syndrom oder Angelman-Syndrom, die mit Deletionen auf Chromosom 15q11-13 assoziiert sind).2. Entwicklung spezifischer Sonden: Entwickle oder beschaffe spezifische Fluoreszenzsonden, die an Sequenzen in der betroffenen Region auf Chromosom 15 binden können.
• Praktische Schritte:1. Chromosomenpräparation: Führe eine Chromosomenpräparation durch, um Metaphase-Chromosomen aus den zu untersuchenden Zellen (z.B. aus Karyotypisierungsproben) zu gewinnen.2. Denaturierung: Denaturiere die DNA auf den Chromosomen, um die Doppelstränge in Einzelstränge zu trennen.3. Hybridisierung: Füge die spezifischen fluoreszierenden Sonden hinzu, die an die denaturierten DNA-Sequenzen in der Zielregion binden.4. Waschschritte: Entferne überschüssige und unspezifisch gebundene Sonden mittels gezielter Waschschritte.5. Färbung und Visualisierung: Färbe ggf. die Chromosomen und beobachte sie unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die fluoreszierenden Signale zeigen die Bindung der Sonden an die Zielregionen. Mit diesen Schritten können spezifische Abweichungen wie Mikrodeletion auf Chromosom 15 visualisiert werden. Ein Fehlen des fluoreszierenden Signals im Vergleich zu einer Kontrollprobe würde auf eine solche Mikrodeletion hindeuten.

c)

Erkläre, wie spezifische Sonden für eine FISH-Untersuchung hergestellt werden. Welche Rolle spielen komplementäre DNA-Sequenzen in diesem Prozess?

Lösung:

Herstellung spezifischer Sonden für eine FISH-Untersuchung:Spezifische Sonden sind essenziell für die FISH-Methode, da sie ermöglichen, bestimmte DNA-Sequenzen auf den Chromosomen zu identifizieren und zu visualisieren. Hier sind die Schritte zur Herstellung solcher Sonden und die Rolle der komplementären DNA-Sequenzen:

• 1. Auswahl der Zielsequenz:Bestimme die spezifische DNA-Sequenz oder Region, die Du visualisieren möchtest. Diese Sequenz sollte einzigartig sein und sich eindeutig auf dem Chromosom finden lassen.
• 2. Synthese oder Isolation der Sonden:Die Sonden können auf verschiedene Weisen hergestellt werden:
  • Synthetische Oligonukleotide: Kurze DNA-Stücke, die chemisch synthetisiert werden und genau komplementär zu der Zielsequenz sind.
  • Genomische Klone: Größere DNA-Fragmente, die mittels Klonierungstechniken aus genomischer DNA isoliert werden.
  • PCR-Amplifikation: Bestimmte DNA-Regionen werden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt.
• 3. Markierung der Sonden:Die hergestellten DNA-Sonden werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, damit sie unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden können. Dies kann durch direkte Markierung (z.B. Einbau eines Fluoreszenzfarbstoffs während der Synthese) oder durch indirekte Markierung (z.B. biotinylierte Sonden, die später fluoreszenzmarkierte Streptavidin-Bindungen eingehen) erfolgen.
• 4. Hybridisierung:Die markierten Sonden werden zu den denaturierten Chromosomenproben gegeben. Hier binden die Sonden spezifisch an ihre komplementären DNA-Sequenzen. Das bedeutet, dass die Sonden sich gezielt an die DNA-Regionen anheften, die genau die gegenläufige, komplementäre Basenpaarung aufweisen.

Die komplementären DNA-Sequenzen spielen in diesem Prozess eine zentrale Rolle, da die Sonden nur dann fest an die Zielregion binden, wenn ihre Sequenzen durch Wasserstoffbrückenbildungen vollständig mit den Ziel-Sequenzen übereinstimmen. Diese spezifische Wechselwirkung sorgt dafür, dass nur die gewünschten DNA-Regionen markiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar werden.

d)

Eine Patientin kommt zur pränatalen Diagnostik, und es besteht der Verdacht auf das Vorliegen einer Duplikation auf Chromosom 21. Erläutere, wie die FISH-Methode verwendet werden kann, um diese Verdachtsdiagnose zu bestätigen oder zu widerlegen. Wie könnte die Visualisierung während der Untersuchung aussehen?

Lösung:

Verwendung der FISH-Methode zur Diagnose einer Duplikation auf Chromosom 21 in der pränatalen DiagnostikDie FISH-Methode kann effektiv genutzt werden, um eine Verdachtsdiagnose auf eine Duplikation auf Chromosom 21 zu bestätigen oder zu widerlegen. Hier sind die Schritte, die in diesem Diagnoseprozess folgen:

• 1. Probenentnahme:Für die pränatale Diagnostik wird in der Regel Fruchtwasser (durch Amniozentese) oder Plazentagewebe (durch Chorionzottenbiopsie) entnommen, um fetale Zellen zu erhalten.
• 2. Chromosomenpräparation:Die fetalen Zellen werden kultiviert und auf einem Objektträger fixiert, sodass die Metaphase-Chromosomen sichtbar werden.
• 3. Sondenvorbereitung:Spezifische Fluoreszenzsonden, die an bekannte Sequenzen auf Chromosom 21 binden, werden hergestellt und markiert. Diese Sonden müssen genau für die Region auf Chromosom 21 komplementär sein, die verdächtigt wird, dupliziert zu sein.
• 4. Denaturierung:Die DNA-Doppelstränge auf den Chromosomenproben werden denaturiert (z.B. durch Erhitzen), um die DNA-Einzelstränge zugänglich zu machen.
• 5. Hybridisierung:Die fluoreszenzmarkierten Sonden werden auf die denaturierten Chromosomenproben aufgetragen und hybridisieren spezifisch mit den komplementären DNA-Sequenzen.
• 6. Waschschritte:Überschüssige und unspezifisch gebundene Sonden werden durch mehrere Waschschritte entfernt.
• 7. Visualisierung:Die präparierten Objektträger werden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Die fluoreszierenden Sonden ermöglichen die Visualisierung der spezifischen DNA-Sequenzen auf Chromosom 21.
  • Im Falle einer Duplikation:Die Visualisierung zeigt zusätzliche fluoreszierende Signale auf Chromosom 21. Zum Beispiel, wenn die Zielsequenz normalerweise ein Signal zeigt, würde eine Duplikation in dieser Region zwei Signale oder mehr in derselben Region des Chromosoms anzeigen.
  • Im Falle keiner Duplikation:Die Visualisierung zeigt die erwartete Anzahl der fluoreszierenden Signale, übereinstimmend mit der normalen Chromosomenstruktur (z.B. ein Signal pro chromosomale Region pro Chromosom).

Diese Methode ermöglicht es den Genetikern, eine Verdachtsdiagnose auf eine Duplikation auf Chromosom 21 schnell und präzise zu bestätigen oder zu widerlegen, indem sie die Anzahl und Position der fluoreszierenden Signale auf den Chromosomen analysieren.

Aufgabe 4)

Next-Generation Sequencing (NGS)Hochdurchsatzsequenzierungstechnologie zur schnellen Bestimmung der Nukleotidsequenz eines ganzen Genoms oder spezifischer DNA-Abschnitte.

• Ermöglicht paralleles Sequenzieren von Millionen DNA-Strängen
• Genauigkeit und Geschwindigkeit im Vergleich zu Sanger-Sequenzierung massiv verbessert
• Anwendung in Diagnostik, Forschung und personalisierter Medizin
• Protokolle umfassen Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung selbst und Datenanalyse
• Ergebnisse in Form von Rohdaten (z.B. FASTQ-Dateien) -> bioinformatische Auswertung

a)

Beschreibe ausführlich, wie die Protokolle für Next-Generation Sequencing (NGS) aufgebaut sind und welche Schritte sie umfassen. Verdeutliche besonders die Schritte der Bibliotheksvorbereitung, der Sequenzierung selbst und der Datenanalyse.

Lösung:

Protokolle für Next-Generation Sequencing (NGS)Die Protokolle für NGS sind komplex und umfassen mehrere wichtige Schritte, die sicherstellen, dass die Sequenzierung präzise und effektiv durchgeführt wird. Diese Schritte lassen sich in drei Hauptphasen unterteilen: Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung selbst und Datenanalyse.

• Bibliotheksvorbereitung:

• 1. DNA-Extraktion: DNA wird aus den Zellen des interessierenden Organismus extrahiert.
• 2. Fragmentierung: Die extrahierte DNA wird enzymatisch oder mechanisch in kleinere Fragmente zerlegt.
• 3. Größeauswahl: Die Fragmente werden je nach gewünschter Größe selektiert.
• 4. Adapter-Ligation: Kurze DNA-Sequenzen, sogenannte Adapter, werden an die Enden der DNA-Fragmente angefügt. Diese Adapter sind notwendig für die spätere Amplifikation und Sequenzierung.
• 5. Amplifikation (optional): Einige Protokolle verlangen eine PCR-Amplifikation, um die DNA-Menge zu erhöhen.

• Sequenzierung:

• 1. Cluster-Generierung: Die DNA-Fragmente mit Adaptern werden auf einen Sequenzier-Chip aufgebracht, wo sie an die Oberfläche binden und durch Bridge-Amplifikation zu DNA-Cluster vervielfältigt werden.
• 2. Sequenzierung durch Synthese (SBS): Bei dieser Technik wird ein einzelnes Nukleotid nach dem anderen zur wachsenden DNA-Kette hinzugefügt, und die eingebaute Base wird in Echtzeit durch Fluoreszenz oder andere Detektionsmethoden abgelesen.
• 3. Datenerfassung: Die während der Sequenzierung gewonnenen Signale werden erfasst und in Rohdaten umgewandelt.

• Datenanalyse:

• 1. Qualitätskontrolle: Die Rohdaten werden auf ihre Qualität hin überprüft, um sicherzustellen, dass die Sequenzierungsfehler minimal sind.
• 2. Trimming: Schlechte Sequenzabschnitte und Adapter-Sequenzen werden entfernt.
• 3. Alignment: Die bearbeiteten Sequenzen werden gegen eine Referenzgenom oder eine Genbank ausgerichtet.
• 4. Variantenerkennung: Mutationen, Polymorphismen und andere genetische Variationen werden identifiziert.
• 5. Interpretation der Ergebnisse: Die analysierten Daten werden in Bezug auf ihre biologischen oder klinischen Implikationen interpretiert.

Diese Schritte sind essentiell, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit des gesamten NGS-Prozesses zu gewährleisten. Jeder Schritt erfordert präzise Handhabung und sorgfältige Validierung, um die bestmöglichen Ergebnisse zu erzielen.