Advanced Lectures in Molecular Medicine 1 - Exam

Aufgabe 1)

Molekulare Pathologie von KrebsVerständnis von molekularen Veränderungen in Krebszellen; Analyse genetischer und epigenetischer Modifikationen bei Krebsentstehung und -progression

• Mutation und Onkogene: z.B. KRAS, BRAF
• Tumorsuppressorgene: p53, RB1
• Epigenetische Veränderungen: Methylierung, Histonmodifikation
• Zellzyklusregulation
• Signaltransduktion: PI3K/AKT, MAPK
• Micro-Umwelt der Tumorzellen (z.B. Hypoxie, Entzündung)
• Therapiezielstrukturen und Biomarker

a)

Diskutiere die Rolle von KRAS und BRAF Mutationen bei der Entstehung von Krebs. Erkläre, wie diese Mutationen zu Veränderungen in der Signaltransduktion führen können, speziell im Kontext des MAPK-Signalwegs.

Lösung:

Rolle von KRAS und BRAF Mutationen bei der Entstehung von Krebs

• KRAS Mutation: KRAS (Kirsten Rat Sarcoma Virus) ist ein Gen, das ein Protein kodiert, welches als molekularer Schalter für den MAPK-Signalweg fungiert. Mutationen im KRAS-Gen führen häufig zu einer konstitutiven Aktivierung des KRAS-Proteins. Das bedeutet, dass das Protein immer aktiv ist und dadurch ständig Signale für Zellwachstum und -teilung gesendet werden, selbst in Abwesenheit von Wachstumssignalen. Dies kann zu unkontrolliertem Zellwachstum und letztendlich zur Krebsentstehung führen.
• BRAF Mutation: BRAF ist ein nachgeschaltetes Kinase-Gen im selben Signalweg. Mutationen in BRAF, wie z.B. die häufige V600E-Mutation, führen zu einer konstitutiven Aktivierung des BRAF-Proteins. Auch dies resultiert in einer endlosen Signalweiterleitung innerhalb des MAPK-Signalwegs, was das Wachstum und Überleben von Tumorzellen fördert. Besonders bekannt ist die BRAF-V600E-Mutation im Zusammenhang mit Melanomen, aber auch bei anderen Krebsarten tritt sie auf.

Veränderungen in der Signaltransduktion

• MAPK-Signalweg: Der MAPK (Mitogen-aktivierten Proteinkinase)-Signalweg ist ein zentraler Mechanismus zur Übertragung von Signalen von Zelloberflächenrezeptoren in den Zellkern. Dieser Weg umfasst folgende Hauptkomponenten: RAS, RAF, MEK und ERK. Jede Komponente aktiviert die nächste in der Kaskade durch Phosphorylierung. Dies führt zu den gewünschten zellulären Antworten, wie Zellteilung und Differenzierung.
• Auswirkungen der KRAS und BRAF Mutationen: Bei Mutationen in KRAS oder BRAF wird dieser Signalweg dauerhaft aktiviert, was zu einer ständigen Zellproliferation und verminderten Zelldifferenzierung führen kann. Folglich entstehen Tumorzellen, die unabhängig von externen Wachstumsfaktoren oder inhibitorischen Signalen wachsen und überleben können. Dies macht den MAPK-Signalweg zu einem wichtigen therapeutischen Ziel in der Onkologie, und viele Krebsmedikamente zielen darauf ab, Komponenten dieses Weges zu hemmen.

b)

Erkläre den Mechanismus, durch den der Tumorsuppressor p53 die Zellzyklusregulation und Apoptose kontrolliert. Beschreibe, welche Auswirkungen eine Mutationen des p53-Gens auf die Krebsprogression haben kann.

Lösung:

Mechanismen des Tumorsuppressors p53 zur Zellzyklusregulation und Apoptosekontrolle

• Zellzyklusregulation durch p53: Wenn DNA-Schäden auftreten, wird p53 aktiviert und akkumuliert im Zellkern. Es fungiert als Transkriptionsfaktor und fördert die Expression von Genen, die den Zellzyklus kontrollieren. Ein wichtiges Zielgen von p53 ist das p21-Gen, welches den CDK-Inhibitor p21 kodiert. p21 bindet an und hemmt Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs), die notwendig für den Übergang von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus sind. Dadurch stoppt die Zelle im G1-Phase, um Zeit für DNA-Reparatur zu gewinnen. Wenn die DNA-Reparatur erfolgreich ist, kann die Zelle den Zellzyklus fortsetzen. Andernfalls wird die Apoptose eingeleitet.
• Apoptoseinduktion durch p53: Wenn die DNA-Schäden irreparabel sind, kann p53 die Apoptose, einen programmierter Zelltod, induzieren. Dies verhindert die Vermehrung von Zellen mit potenziell krebserregenden Mutationen. p53 aktiviert Proapoptose-Gene wie BAX und PUMA und unterdrückt Antiapoptose-Gene wie Bcl-2. Dies führt zur Freisetzung von Cytochrom c aus den Mitochondrien, welches den Caspase-Aktivierungsweg einleitet und damit die Apoptose vollzieht.

Auswirkungen einer Mutation des p53-Gens auf die Krebsprogression

• Funktionsverlust-Mutationen: Mutationen im p53-Gen sind in mehr als 50% aller menschlichen Krebserkrankungen zu finden. Solche Mutationen führen häufig zu einem Funktionsverlust oder einer dominanten negativen Wirkung des p53-Proteins. Dies bedeutet, dass die Zellen nicht mehr effektiv auf DNA-Schäden reagieren können und weder den Zellzyklus anhalten noch die Apoptose einleiten. Dies ermöglicht die Anhäufung zusätzlicher genetischer Anomalien und fördert die Tumorentstehung und -progression.
• Stärkung des Überlebens angegriffener Zellen: In Abwesenheit von funktionellem p53 können Zellen mit DNA-Schädigungen überleben, statt sich kontrolliert abzubauen. Dies trägt zur Tumorentwicklung bei und erschwert die Wirksamkeit von Krebsbehandlungen, da die Apoptose von beschädigten Zellen nicht ausreichend aktiviert wird.

c)

Beschreibe die Unterschiede und Gemeinsamkeiten der genetischen und epigenetischen Modifikationen bei der Krebsentstehung. Gib Beispiele für epigenetische Veränderungen und erkläre, wie sie zur Tumorentwicklung beitragen können.

Lösung:

Unterschiede und Gemeinsamkeiten der genetischen und epigenetischen Modifikationen bei der Krebsentstehung

Unterschiede:

• Genetische Modifikationen: Genetische Veränderungen beziehen sich auf Veränderungen in der DNA-Sequenz selbst. Dies sind permanente Mutationen, die von Generation zu Generation weitergegeben werden können und die Proteinstruktur und -funktion direkt beeinflussen. Beispiele sind Punktmutationen, Deletionen, Insertionen und Chromosomenumlagerungen. Beispiele: Mutationen in Onkogenen wie KRAS und BRAF oder Tumorsuppressorgenen wie p53 und RB1.
• Epigenetische Modifikationen: Epigenetische Veränderungen hingegen beeinflussen die Genexpression, ohne die DNA-Sequenz zu verändern. Diese Modifikationen sind reversibel und umfassen Mechanismen wie DNA-Methylierung und Histonmodifikationen. Solche Veränderungen können durch Umwelteinflüsse, Lebensstil oder altersbedingte Faktoren beeinflusst werden. Beispiele: DNA-Methylierung und Histon-Acetylierung.

Gemeinsamkeiten:

• Beide Arten von Modifikationen können die Genexpression und somit die Funktion von Zellen stark beeinflussen.
• Sowohl genetische als auch epigenetische Veränderungen können zur Aktivierung von Onkogenen und/oder zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen führen.
• Beide Mechanismen tragen zur Zelltransformation, unkontrollierten Zellproliferation und Tumorentwicklung bei.

Beispiele für epigenetische Veränderungen und ihr Beitrag zur Tumorentwicklung

• DNA-Methylierung: DNA-Methylierung ist eine chemische Modifikation, bei der eine Methylgruppe (-CH3) an ein Cytosin-Nukleotid in einem CpG-Dinukleotid angehängt wird. Hypermethylierung in den Promotorregionen von Tumorsuppressorgenen kann deren Expression verringern oder komplett ausschalten, was zur Tumorentstehung beiträgt. Beispiel: Hypermethylierung des Promotors des p16INK4a-Gens, was zur Inaktivierung des Gens führt und die Zellzyklusregulation stört.
• Histonmodifikationen: Histonmodifikationen wie Acetylierung, Methylierung und Phosphorylierung verändern die Struktur des Chromatins und damit die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren. Eine verringerte Histon-Acetylierung (durch erhöhte Aktivität von Histon-Deacetylasen) kann zur Kompression des Chromatins und zur Reduktion der Genexpression führen. Beispiel: Deacetylierung der Histone bei Tumorsuppressorgenen kann deren Expression herunterregulieren und zur Tumorentwicklung beitragen.
• MicroRNAs (miRNAs): MiRNAs sind kleine nicht-kodierende RNA-Moleküle, die die Genexpression posttranskriptionell regulieren. Ihre Dysregulation kann die Expression von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen beeinflussen. Beispiel: Überexpression von miR-21 kann zur Unterdrückung von Tumorsuppressorgenen wie PTEN und programmiertem Zelltod beitragen, was zu Tumorwachstum führt.

Aufgabe 2)

Techniken der Genomsequenzierung und Genexpressionsanalyse

Techniken zur Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Genoms und zur Messung der mRNA-Expression verschiedener Gene umfassen:

• DNA-Sequenzierungsmethoden: Sanger-Sequenzierung, Next Generation Sequencing (NGS)
• Sanger-Sequenzierung: Kettenabbruchmethode, Basenbestimmung durch Fluoreszenz oder Radioaktivität
• Nächste Generation Sequenzierung: Illumina (Sequenzieren durch Synthese), Pacific Biosciences (Single Molecule Real Time), Oxford Nanopore (Nanoporen-basierte Sequenzierung)
• Genexpressionsanalyse: qRT-PCR, Microarrays, RNA-Seq
• qRT-PCR: quantitative Real-Time PCR, Messung der cDNA-Synthese in Echtzeit
• Microarrays: Hybridisierung von cDNA oder cRNA auf Arrays mit komplementären DNA-Sonden
• RNA-Seq: Hochdurchsatzsequenzierung, um gesamtes Transkriptom zu analysieren
• Datenanalyse: Bioinformatik-Tools und Software zur Sequenz-Alignment, Variantendetektion, Expressionsprofilierung

a)

Vergleiche die Sanger-Sequenzierung mit den Techniken der nächsten Generation (NGS). Diskutiere die Vor- und Nachteile, die Anwendungsgebiete und die zugrunde liegende Methodik. Füge die entsprechenden Mechanismen der Basenbestimmung hinzu und erwähne, wie die Ergebnisse typischerweise dargestellt werden.

Lösung:

Vergleich der Sanger-Sequenzierung mit Techniken der nächsten Generation (NGS)

• Sanger-Sequenzierung:

• Methodik: Bei der Sanger-Sequenzierung wird die Kettenabbruchmethode verwendet. Dazu werden in vier separate Reaktionsansätze, die jeweils eine DNA-Polymerase, normale Nukleotide (dNTPs) und fluoreszenz- oder radioaktiv markierte Abbruchnukleotide (ddNTPs) enthalten, ein Template-Strang und ein Primer hinzugefügt. Die Polymerase synthetisiert die DNA bis zum Einbau eines ddNTP, wodurch die Synthese stoppt. Die entstehenden Fragmente werden in einem Gel oder durch Kapillarelektrophorese aufgetrennt und die Basen werden anhand der Markierung abgelesen.
• Vorteile:
  • Hohe Genauigkeit (geringe Fehlerrate)
  • Gut etabliert mit umfassend validierten Protokollen
  • Geeignet für die Sequenzierung kleinerer DNA-Stücke
• Nachteile:
  • Geringe Durchsatzkapazität
  • Höhere Kosten und längere Dauer pro Basenpaar verglichen mit NGS
  • Begrenzt auf kürzere Leseweiten (ca. 1000 Basenpaare)
• Anwendungsgebiete: Kleine Genomprojekte, Diagnostik von bekannten Mutationen, Verifizierung von Sequenzen
• Darstellung der Ergebnisse: Elektronische oder Papier-Chromatogramme, in denen die Fluoreszenzsignalspitzen für jede der vier Basen dargestellt sind.

• Nächste Generation Sequenzierung (NGS):

• Methodik: Es gibt verschiedene NGS-Plattformen, darunter:
• Illumina (Sequenzieren durch Synthese): DNA wird fragmentiert und an Adaptersequenzen ligiert. Diese Fragmente werden auf einen Flow-Cell geladen und durch wiederholte Syntheserunden sequenziert, wobei jeder neu eingebaute Nukleotid fluoresziert und von einer Kamera detektiert wird.
• Pacific Biosciences (Single Molecule Real Time, SMRT): Einzelne DNA-Moleküle werden in Nanowells fixiert und in Echtzeit durch die Polymerase sequenziert, während fluoreszierende Nukleotide eingebaut und sofort detektiert werden.
• Oxford Nanopore (Nanoporen-basierte Sequenzierung): DNA wird durch nanopore Proteinporen im Membran gezogen, wobei verschiedene Nukleotide spezifische Störungen im elektrischen Strom verursachen, die aufgezeichnet und analysiert werden.
• Vorteile:
  • Hochdurchsatz (Millionen bis Milliarden von Basenpaaren pro Lauf)
  • Geringere Kosten und Zeit pro Basenpaar
  • Eignung für großangelegte Projekte wie die Genom-, Exom- und Transkriptomsequenzierung
• Nachteile:
  • Höhere Fehlerquoten im Vergleich zur Sanger-Sequenzierung (können aber durch wiederholte Sequenzierung und bioinformatische Korrekturen minimiert werden)
  • Erfordert umfassende Bioinformatik-Ressourcen zur Datenanalyse
  • Anfälliger für spezifische technische Artefakte und Biases je nach verwendeter Plattform
• Anwendungsgebiete: Genomenweite Assoziationsstudien, De-novo-Sequenzierung von nicht-modellorganismen, RNA-Seq für Transkriptomanalysen, Metagenomik
• Darstellung der Ergebnisse: FastQ-Dateien, BAM-Dateien (Alignment), VCF-Dateien (Varianten) und verschiedene Visualisierungssoftware, die Sequenzreads, Coverage-Muster und genetische Varianten darstellen.

Die Wahl zwischen Sanger-Sequenzierung und NGS hängt stark vom spezifischen Anwendungsfall, dem benötigten Durchsatz und den verfügbaren Ressourcen ab.

b)

Beschreibe das Verfahren der qRT-PCR, einschließlich der Schritte zur cDNA-Synthese und der quantitativen Analyse. Ergänze die Erklärung durch ein mathematisches Beispiel für die Berechnung der relativen Genexpression mittels der \(\text{ΔΔCt}\)-Methode:

Gegeben seien die Ct-Werte eines Zielgens und eines Referenzgens in einer Behandlungs- und Kontrollgruppe. Zielgen (Behandlung): 18 Zyklen, Zielgen (Kontrolle): 20 Zyklen, Referenzgen (Behandlung): 15 Zyklen, Referenzgen (Kontrolle): 16 Zyklen.

Lösung:

Verfahren der qRT-PCR

• cDNA-Synthese: Die quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) beginnt mit der Umwandlung von mRNA in komplementäre DNA (cDNA). Dies erfolgt durch Reverse Transkriptase:
• Isolierung der mRNA aus der Proben
• Beigabe von Oligo(dT)-Primern oder spezifischen Primern, die an die mRNA binden
• Reverse Transkriptase synthetisiert cDNA anhand der mRNA als Template

• Quantitative Analyse: Die qRT-PCR nutzt fluoreszierende Reporter, um die Menge der amplifizierten cDNA in Echtzeit zu messen, während die PCR abläuft. Jeder PCR-Zyklus verdoppelt theoretisch die Menge der Ziel-DNA:
• Denaturierung: Die doppelsträngige DNA wird durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt.
• Annealing: Spezifische Primer binden an die Zielsequenzen bei einer niedrigeren Temperatur.
• Elongation: Eine Taq-Polymerase erweitert die gebundenen Primer und synthetisiert neue DNA-Stränge.
• Fluoreszenz-Messung: Ein fluoreszierender Farbstoff oder eine Sonde emittiert ein Signal, das proportional zur Menge der amplifizierten DNA ist.

Mathematisches Beispiel für die Berechnung der relativen Genexpression mittels der \(\text{ΔΔCt}\)-Methode:

• Berechnung der ΔCt-Werte:
• ΔCt (Behandlung) = Ct(Zielgen, Behandlung) - Ct(Referenzgen, Behandlung)
• ΔCt (Behandlung) = 18 - 15 = 3
• ΔCt (Kontrolle) = Ct(Zielgen, Kontrolle) - Ct(Referenzgen, Kontrolle)
• ΔCt (Kontrolle) = 20 - 16 = 4
• Berechnung der ΔΔCt:
• ΔΔCt = ΔCt (Behandlung) - ΔCt (Kontrolle)
• ΔΔCt = 3 - 4 = -1
• Berechnung der relativen Genexpression:
• Relative Genexpression = 2^{-ΔΔCt}
• Relative Genexpression = 2^{-(-1)} = 2^1 = 2

Die relative Genexpression zeigt, dass das Zielgen in der Behandlungsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe um das Zweifache hochreguliert ist.

c)

Erkläre, wie Microarrays zur Genexpressionsanalyse verwendet werden. Gehe dabei auf den Vorgang der Hybridisierung, das Layout des Microarrays und die Interpretation der Ergebnisse ein. Besprich zudem die Vorteile und Herausforderungen, die mit der Nutzung von Microarrays verbunden sind.

Lösung:

Verwendung von Microarrays zur Genexpressionsanalyse

• Vorgang der Hybridisierung:
• Die mRNA wird aus den Proben extrahiert.
• Mithilfe von Reverse Transkription wird die mRNA in cDNA umgewandelt, häufig mit einem fluoreszierenden Marker versehen.
• Die markierte cDNA wird auf den Microarray aufgetragen, welcher Tausende von DNA-Sonden enthält, die spezifisch für verschiedene Gene sind.
• Die cDNA hybridisiert mit den komplementären DNA-Sonden auf dem Array.
• Layout des Microarrays:
• Ein Microarray besteht aus einer festen Matrix von DNA-Sonden auf einem Glas- oder Siliziumchip.
• Jede Position oder ‚Spot‘ auf dem Microarray enthält viele Kopien derselben DNA-Sonde, die komplementär zu einer spezifischen mRNA-Sequenz ist.
• Es gibt verschiedene Typen von Microarrays, darunter cDNA- und Oligonukleotid-Microarrays.
• Interpretation der Ergebnisse:
• Nach der Hybridisierung wird der Microarray gewaschen, um ungebundene cDNA zu entfernen.
• Ein Scanner detektiert die fluoreszierenden Signale an jeder Position auf dem Array.
• Die Stärke des fluoreszierenden Signals an jedem Spot ist proportional zur Menge der mRNA in der Probe, die mit der entsprechenden Sonde hybridisiert hat.
• Daten werden normalisiert und analysiert, um die Genexpressionsprofile der Proben zu vergleichen. Diese Ergebnisse sind oft in Heatmaps oder anderen visuellen Darstellungen zu sehen.
• Vorteile von Microarrays:
• Ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der Expression Tausender Gene.
• Schnell und relativ kostengünstig im Vergleich zu anderen Methoden für großflächige Genexpressionsstudien.
• Gut etabliert mit vielen verfügbaren kommerziellen Kits und Standardprotokollen.
• Herausforderungen von Microarrays:
• Begrenzte Empfindlichkeit im Vergleich zu RNA-Seq.
• Geringere dynamische Reichweite für die Detektion von niedrig und hoch exprimierten Genen.
• Abhängigkeit von bekannten Sequenzen; neuartige oder unbekannte Transkripte können nicht detektiert werden.
• Erfordert umfangreiche Datenanalyse und Bioinformatik-Ressourcen für die Interpretation der Ergebnisse.

Microarrays sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Genexpressionsanalyse, bieten jedoch eine geringere Auflösung und Erkennung neuer Gene im Vergleich zu neueren Technologien wie RNA-Seq.

d)

Diskutiere die Anwendung der RNA-Seq-Technologie zur Analyse des gesamten Transkriptoms. Vergleiche diese Methode mit Microarrays, insbesondere hinsichtlich der Genauigkeit, des Umfangs der Daten und der Notwendigkeit für bioinformatische Analyse. Verwende ein Beispiel für einen Pipeline-Workflow, um die typische Datenanalyse von RNA-Seq-Daten zu beschreiben.

Lösung:

Anwendung der RNA-Seq-Technologie zur Analyse des gesamten Transkriptoms

• RNA-Seq-Technologie:

• Prozess:
• Extraktion der mRNA aus den Proben.
• Umwandlung der mRNA in cDNA mittels Reverse Transkriptase.
• Fragmentierung der cDNA und Anfügen von Adaptersequenzen.
• Sequenzierung der cDNA-Fragmente mithilfe von NGS-Plattformen wie Illumina, Pacific Biosciences oder Oxford Nanopore.
• Generierung von Millionen bis Milliarden von kurzen Sequenzreads, die das gesamte Transkriptom repräsentieren.
• Vorteile von RNA-Seq im Vergleich zu Microarrays:
• Genauigkeit: RNA-Seq bietet eine höhere Sensitivität und genauere Quantifizierung der Genexpression, insbesondere für Gene mit niedriger und sehr hoher Expression.
• Umfang der Daten: RNA-Seq kann neue Transkripte, Spleißvarianten, nicht-kodierende RNAs und weitere bisher unbekannte Sequenzen identifizieren, während Microarrays auf bekannte Sequenzen beschränkt sind.
• Dynamische Reichweite: RNA-Seq hat eine breitere dynamische Reichweite und kann sowohl seltene als auch häufige Transkripte präzise quantifizieren.
• Flexibilität: RNA-Seq ist nicht auf einen festen Satz von Sonden angewiesen, was eine größere Anpassungsfähigkeit an das Studium verschiedener Organismen und Bedingungen ermöglicht.
• Herausforderungen und Notwendigkeit für bioinformatische Analyse:
• RNA-Seq generiert große Mengen an Daten, die komplexe und ressourcenintensive bioinformatische Analysen erfordern.
• Verarbeitungsschritte umfassen Qualitätskontrolle, Sequenz-Alignment, Normalisierung der Read-Zahlen und Detektion von differentiell exprimierten Genen.
• Erfordert spezialisierte Software, wie FastQC für Qualitätskontrolle, STAR oder HISAT2 für Alignments, und DESeq2 oder EdgeR für statistische Analysen.
• Pipeline-Workflow für RNA-Seq-Datenanalyse:
• Schritt 1: Qualitätskontrolle der Rohsequenzdaten mittels FastQC.
• Schritt 2: Trimmen und Entfernen von Adaptersequenzen mit Tools wie Trimmomatic oder Cutadapt.
• Schritt 3: Alignment der Reads mit dem Referenzgenom oder -transkriptom mittels STAR oder HISAT2.
• Schritt 4: Zählung der Reads, die auf jedes Gen oder Transkript ausgerichtet sind, unter Verwendung von Tools wie HTSeq oder featureCounts.
• Schritt 5: Normalisierung der Reads und Bestimmung der differentiellen Genexpression mit DESeq2, EdgeR oder limma.
• Schritt 6: Visualisierung der Ergebnisse, z.B. durch Heatmaps, MA-Plots, oder PCA-Analysen.

Insgesamt bietet RNA-Seq eine hochpräzise und umfassende Methode zur Transcriptom-Analyse, die über die Kapazitäten von Microarrays hinausgeht, aber auch höhere Anforderungen an die Datenverarbeitung und bioinformatische Expertise stellt.

Aufgabe 3)

Mechanismen der Signalübertragung sind zentrale Prozesse, durch die Zellen Signale weiterleiten und auf äußere Reize reagieren. Dazu gehören z. B. der MAPK- und der PI3K/Akt-Signalweg.

• MAPK-Signalweg: Aktivierung durch Rezeptor-Tyrosinkinase; Kaskade von Proteinkinasen (RAF, MEK, ERK); reguliert Zellproliferation, Differenzierung und Überleben.
• PI3K/Akt-Signalweg: Aktivierung durch PI3-Kinase; Umwandlung von PIP2 zu PIP3; Rekrutierung und Aktivierung von Akt; reguliert Zellwachstum, Überleben und Stoffwechsel.
• Schlüsselkomponenten: Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, Adapterproteine.
• Dysregulation dieser Signalwege kann zu Krankheiten wie Krebs führen.

a)

Erkläre die Rolle der RAF-Kinase im MAPK-Signalweg. Wie führt ihre Aktivierung zur Phosphorylierung und Aktivierung von ERK? In welcher Weise könnten Mutationen in der RAF-Kinase zu pathologischen Zuständen führen?

Lösung:

Um die Rolle der RAF-Kinase im MAPK-Signalweg zu erklären, lassen sich die folgenden Schritte und Details betrachten:

• Aktivierung der RAF-Kinase: Die RAF-Kinase ist ein entscheidendes Enzym im MAPK-Signalweg. Sie wird nach der Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase durch den Bindung eines externen Signals (z.B. Wachstumsfaktoren) rekrutiert und aktiviert.
• Signalweiterleitung: Nach ihrer Aktivierung phosphoryliert die RAF-Kinase die MEK-Kinase, eine nachfolgende Kinase in der Kaskade.
• Phosphorylierung und Aktivierung von ERK: MEK, einmal aktiviert, phosphoryliert und aktiviert im nächsten Schritt die ERK-Kinase (Extrazellulär-signal-regulierte Kinase). ERK bewegt sich dann in den Zellkern, wo sie verschiedene Transkriptionsfaktoren und andere Proteine phosphoryliert und dadurch die Genexpression sowie Zellprozesse wie Proliferation, Differenzierung und Überleben reguliert.
• Pathologische Mutationen: Mutationen in der RAF-Kinase können zu ihrer konstitutiven Aktivierung führen, wodurch der Signalweg dauerhaft aktiv bleibt. Dies kann zu unkontrollierter Zellteilung und anderen pathologischen Zuständen wie Krebs führen. Eine bekannte Mutation ist B-RAF V600E, die oft in Melanomen gefunden wird und zu einer erhöhten Kinase-Aktivität führt.

c)

Vergleiche und kontrastiere die physiologischen Funktionen des MAPK- und PI3K/Akt-Signalwegs. Diskutiere, wie deren Dysregulation zu Krebs führen kann und nenne mindestens zwei therapeutische Ansätze zur Behandlung solcher Krankheiten, die auf die Signalwege abzielen.

Lösung:

Vergleich und Kontrast der physiologischen Funktionen des MAPK- und PI3K/Akt-Signalwegs:

• MAPK-Signalweg:Der MAPK (Mitogen-aktivierter Proteinkinase)-Signalweg wird durch Rezeptor-Tyrosinkinasen aktiviert und umfasst eine Kaskade von Proteinkinasen, einschließlich RAF, MEK und ERK. Die Hauptfunktionen des MAPK-Signalwegs sind die Regulierung von Zellproliferation, Differenzierung und Überleben. Er spielt eine Schlüsselrolle in der Zellantwort auf Wachstumsfaktoren und andere extrazelluläre Signale.
• PI3K/Akt-Signalweg:Der PI3K/Akt-Signalweg wird ebenfalls durch Rezeptor-Tyrosinkinasen aktiviert. Die PI3-Kinase phosphoryliert Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat (PIP2) zu Phosphatidylinositol-(3,4,5)-trisphosphat (PIP3), was zur Rekrutierung und Aktivierung von Akt führt. Dieser Signalweg reguliert Zellwachstum, Überleben und Stoffwechsel. Er ist beteiligt an der Zellantwort auf Wachstumsfaktoren und Anti-Apoptose-Signale.

Dysregulation und Krebs:Eine Dysregulation beider Signalwege kann zu unkontrolliertem Zellwachstum und Krebs führen. Dies geschieht durch:

• MAPK-Signalweg:Mutationen in Komponenten wie RAS oder BRAF können zu einer konstitutiven Aktivierung des Signalwegs führen, was zu unkontrollierter Zellproliferation und Tumorwachstum beiträgt.
• PI3K/Akt-Signalweg:Mutationen oder Inaktivierungen von PTEN, einer Phosphatase, die PIP3 zu PIP2 dephosphoryliert, führen zu einer erhöhten PIP3-Konzentration und damit zur Überaktivierung von Akt. Das Ergebnis ist eine verstärkte Zellproliferation und -überleben, was zur Krebsentstehung beiträgt.

Therapeutische Ansätze:

Zur Behandlung von Krebs, der durch Dysregulation dieser Signalwege verursacht wird, gibt es mehrere therapeutische Ansätze:

• MAPK-Signalweg Inhibitoren:BRAF-Inhibitoren: Z.B. Vemurafenib, das speziell auf mutierte BRAF (z.B. BRAF V600E) abzielt und in der Behandlung von Melanomen eingesetzt wird.MEK-Inhibitoren: Z.B. Trametinib, das die MEK1/2-Kinasen blockiert und ebenfalls bei melanomaner Therapie verwendet wird.
• PI3K/Akt-Signalweg Inhibitoren:PI3K-Inhibitoren: Z.B. Idelalisib, das bei der Behandlung bestimmter Leukämien und Lymphome eingesetzt wird.Akt-Inhibitoren: Z.B. Ipatasertib, das auf die Hemmung von Akt abzielt und in klinischen Studien zur Behandlung verschiedener Krebsarten geprüft wird.

Aufgabe 4)

Regulation der Genexpression im menschlichen KörperDie Regulation der Genexpression ist für die ordnungsgemäße Funktion jeder Zelle im menschlichen Körper unerlässlich. Zellen verwenden eine Vielzahl von Mechanismen, um sicherzustellen, dass Gene zur richtigen Zeit und im richtigen Maß exprimiert werden. Zu diesen Mechanismen gehören Transkription, Translation, DNA-Elemente wie Promotoren und Enhancer, sowie verschiedene Arten von RNA und epigenetischen Modifikationen. Eine Störung dieser Mechanismen kann zu Krankheiten wie Krebs oder genetischen Störungen führen.

a)

1. Analyse der Genregulation durch Transkriptionsfaktoren und EpigenetikEin Gen wird in einer bestimmten Zelllinie nicht exprimiert. Sie vermuten, dass dies auf eine epigenetische Modifikation oder das Fehlen eines notwendigen Transkriptionsfaktors zurückzuführen ist.

• a) Beschreibe den experimentellen Ansatz zur Bestimmung, ob die fehlende Genexpression durch DNA-Methylierung verursacht wird.
• b) Wie würdest Du überprüfen, ob ein fehlender Transkriptionsfaktor verantwortlich ist?

Lösung:

Regulation der Genexpression im menschlichen KörperDie Regulation der Genexpression ist für die ordnungsgemäße Funktion jeder Zelle im menschlichen Körper unerlässlich. Zellen verwenden eine Vielzahl von Mechanismen, um sicherzustellen, dass Gene zur richtigen Zeit und im richtigen Maß exprimiert werden. Zu diesen Mechanismen gehören Transkription, Translation, DNA-Elemente wie Promotoren und Enhancer, sowie verschiedene Arten von RNA und epigenetischen Modifikationen. Eine Störung dieser Mechanismen kann zu Krankheiten wie Krebs oder genetischen Störungen führen.

• a) Beschreibe den experimentellen Ansatz zur Bestimmung, ob die fehlende Genexpression durch DNA-Methylierung verursacht wird.Um zu bestimmen, ob die fehlende Genexpression durch DNA-Methylierung verursacht wird, kann folgender experimenteller Ansatz verwendet werden:
  • Bisulfit-Sequenzierung: Zunächst wird die DNA der betroffenen Zelllinie isoliert. Dann erfolgt eine Behandlung mit Natriumbisulfit, das nicht-methylierte Cytosin-Basen in Uracil umwandelt, während methylierte Cytosin-Basen unverändert bleiben. Nach der Behandlung wird die DNA sequenziert, um den Methylierungsstatus der Cytosin-Reste in der Region des interessierten Gens zu bestimmen. Eine hohe Methylierung kann auf eine silenziertes Gen hindeuten.
  • Methylation-Spezifische PCR (MSP): Zusätzlich oder alternativ kann eine MSP durchgeführt werden. Hierbei werden spezifische Primer verwendet, die entweder methylierte oder nicht-methylierte DNA erkennen. Durch den Vergleich der Amplifikationsmuster der beiden Primer-Sets lässt sich der Methylierungsstatus des Gens schnell bestimmen.
  • Demethylierungsbehandlung: Schließlich kann eine demethylierende Behandlung mit Agenzien wie 5-Azacytidin durchgeführt werden. Diese Chemikalie inhibiert die DNA-Methyltransferasen und reduziert somit die DNA-Methylierung. Eine nachfolgende Analyse der Genexpression durch RT-qPCR nach der Behandlung kann zeigen, ob die De-Methylierung zur Wiederherstellung der Genexpression führt.
• b) Wie würdest Du überprüfen, ob ein fehlender Transkriptionsfaktor verantwortlich ist?Um zu überprüfen, ob ein fehlender Transkriptionsfaktor für die fehlende Genexpression verantwortlich ist, kann folgender experimenteller Ansatz verwendet werden:
  • Western Blot: Zuerst wird ein Western Blot durchgeführt, um die Präsenz und Mengen der verdächtigen Transkriptionsfaktoren in der Zelllinie zu überprüfen. Durch den Einsatz spezifischer Antikörper, die an die Transkriptionsfaktoren binden, können diese visualisiert und quantifiziert werden.
  • Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP): Diese Methode ermöglicht das Nachweisen, ob der Transkriptionsfaktor an die Promotorregion des interessierten Gens binden kann. Immunpräzipitation des Chromatins mit einem Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor und anschließende Sequenzierung oder PCR der gebundenen DNA-Regionen zeigen, ob der Transkriptionsfaktor physisch im Komplex mit der DNA vorhanden ist.
  • Plasmid-Transfektion: Schließlich kann ein Überexpressionsplasmid, das das Gen für den verdächtigen Transkriptionsfaktor enthält, in die Zelllinie transfiziert werden. Nach der Transfektion und einer inkubationszeit wird die Genexpression durch RT-qPCR analysiert. Eine erhöhte Genexpression nach der Überexpression des Transkriptionsfaktors würde zeigen, dass der Mangel an diesem Transkriptionsfaktor für die fehlende Genexpression verantwortlich ist.
  • Elektrophoretische Mobilitätsverschiebungsassay (EMSA): EMSAs können verwendet werden, um zu überprüfen, ob der Transkriptionsfaktor in der Lage ist, spezifische DNA-Sequenzen zu binden. Hierfür werden Kernextrakte der Zelllinie und eine radioaktiv oder fluoreszenzmarkierte DNA-Sequenz, die die Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors enthält, verwendet. Eine Verschiebung des DNA-Bandes im Gel weist auf die Bindung des Transkriptionsfaktors hin.