Elective Compulsory Seminar Module 2 - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest in einem Forschungslabor, welches sich mit der Analyse von Tumor-DNA-Proben mittels Next-Generation Sequencing (NGS) befasst. Die Proben wurden bereits sequenziert und du erhältst die Rohdaten im Format \texttt{fastq} sowie die Ergebnisse der Qualitätskontrolle von FastQC. Nutze dein Wissen über NGS-Technologien und die Datenanalyse, um die folgenden Aufgaben zu lösen.

a)

Erkläre die Hauptunterschiede zwischen den verschiedenen NGS-Technologien (Illumina, Ion Torrent, PacBio, Oxford Nanopore). Nenne jeweils eine spezifische Anwendung, für die jede Technologie besonders gut geeignet ist.

Lösung:

Hauptunterschiede zwischen den verschiedenen NGS-Technologien

• Illumina
  • Technologie: Illumina verwendet eine Sequenzierung durch Synthese (Sequencing by Synthesis, SBS), wobei reversible terminierende Nukleotide verwendet werden.
  • Vorteile: Hohe Genauigkeit, große Datenmengen, niedrige Fehlerraten.
  • Nachteile: Erfordert teure Geräte und umfangreiche Infrastruktur.
  • Spezifische Anwendung: Moderne Anwendungsfälle wie Genomik in großem Maßstab und Transkriptom-Analysen aufgrund der hohen Datenmenge und Genauigkeit.
• Ion Torrent
  • Technologie: Ion Torrent verwendet Halbleitersequenzierung, bei der der pH-Wert bei der DNA-Polymerisation gemessen wird.
  • Vorteile: Schnellere Zeit bis zum Ergebnis, niedrige Kosten im Vergleich zu Illumina.
  • Nachteile: Höhere Fehlerraten als Illumina und kürzere Leselängen.
  • Spezifische Anwendung: Gut geeignet für schnelle Zielgenanalysen und kleine bis mittlere Genomprojekte aufgrund der geringeren Kosten und schnelleren Ergebnisse.
• PacBio (Pacific Biosciences)
  • Technologie: PacBio verwendet Einzelmolekülsynthese (Single-Molecule Real-Time, SMRT) und kann lange DNA-Abschnitte am Stück sequenzieren.
  • Vorteile: Sehr lange Leselängen, nützlich für die Sequenzierung von Regionen mit vielen Wiederholungen und strukturellen Variationen.
  • Nachteile: Höhere Fehlerquote und kostenintensiver als Illumina.
  • Spezifische Anwendung: Gut geeignet für die De-novo-Genomassemblierung und die Charakterisierung komplexer genomischer Regionen aufgrund der extrem langen Leselängen.
• Oxford Nanopore
  • Technologie: Oxford Nanopore verwendet Nanoporentechnologie, bei der die DNA durch einen winzigen Proteinporenkanal gezogen und der Stromfluss gemessen wird.
  • Vorteile: Lange Leselängen, tragbare Geräte, Echtzeit-Sequenzierung möglich.
  • Nachteile: Höhere Fehlerquote im Vergleich zu Illumina.
  • Spezifische Anwendung: Ideal für Feldforschung und schnelle Diagnosen, da die Geräte tragbar sind und keine umfangreiche Infrastruktur benötigen.

b)

Nach der Qualitätskontrolle der \texttt{fastq}-Dateien mittels FastQC stellst du fest, dass einige Reads eine niedrige Qualitätsbewertung aufweisen. Beschreibe den Prozess, wie du diese Reads vor dem Alignment filterst und welche Tools du dafür verwenden würdest.

Lösung:

Filterung von Reads mit niedriger Qualitätsbewertung vor dem Alignment

Nach der Qualitätskontrolle der fastq-Dateien mit FastQC stehen verschiedene Schritte und Werkzeuge zur Verfügung, um Reads mit niedriger Qualitätsbewertung vor dem Alignment zu filtern. Hier ist ein detaillierter Prozess:

1. Bewertung der Qualitätskontroll-Ergebnisse:
   • Öffne die FastQC-Berichte und prüfe die verschiedenen Qualitätsmetriken, wie z.B. Per Base Sequence Quality, Per Sequence Quality Scores und Per Base N Content.
   • Identifiziere die Abschnitte oder Reads, die eine niedrige Qualitätsbewertung (Q-Score) aufweisen, typischerweise Q < 20.
2. Verwendung von Trimming-Tools: Um die Reads zu filtern und zu trimmen, können verschiedene Tools verwendet werden:
   • Trim Galore: Trim Galore kombiniert die Funktionalität von Cutadapt und FastQC und ist ein populäres Tool für das Trimmen von Reads.

     trim_galore --quality 20 --fastqc input.fastq

   • Cutadapt: Cutadapt ist ein flexibles Tool, um Adaptersequenzen und Reads mit niedriger Qualität zu entfernen.

     cutadapt -q 20 -o output.fastq input.fastq

   • Trimmomatic: Trimmomatic ist ein weiteres weit verbreitetes Tool, das eine große Auswahl an Optionen zum Trimmen und Filtern bietet.

     trimmomatic SE -phred33 input.fastq output.fastq SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:50

3. Iterative Überprüfung und Anpassung: Nach dem Trimmen und Filtern führst du nochmals FastQC auf den gefilterten Daten durch, um sicherzustellen, dass die Qualität der Reads verbessert wurde. Falls notwendig, passe die Trimming-Parameter an und wiederhole den Prozess.
4. Bereitstellung der gefilterten Reads: Nach der Qualitätssicherung können die gefilterten and getrimmten Reads für das Alignment mit Tools wie BWA oder Bowtie2 verwendet werden.

Durch diese Schritte stellst du sicher, dass nur hochwertige Reads für das Alignment verwendet werden, was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der nachfolgenden Analysen erhöht.

c)

Erkläre die Schritte des Alignments und der Variantenanalyse, die du nach dem Filtern der Daten durchführen würdest. Nenne die spezifischen Programme, die du verwenden und welche Datenformate dabei erzeugt werden.

Lösung:

Schritte des Alignments und der Variantenanalyse

Nach dem Filtern der fastq-Daten durch Trimming und Qualitätskontrolle gehst du die Schritte der Alignment- und Variantenanalyse durch. Hier sind die spezifischen Schritte und Programme, die verwendet werden:

1. Alignment der Reads:
   • Tool: BWA (Burrows-Wheeler Aligner) oder Bowtie2 BWA und Bowtie2 sind weit verbreitete Alignertools für kurze Reads.

     // Beispiel BWA-Befehl:bwa mem -t 8 reference_genome.fasta filtered_reads.fastq > aligned_reads.sam// Beispiel Bowtie2-Befehl:bowtie2 -x reference_genome -U filtered_reads.fastq -S aligned_reads.sam

   • Output: SAM-Datei (Sequence Alignment/Map) Die Ausgabe ist eine .sam-Datei, die die alignierten Reads im referenzierten Genom enthält.
2. Konvertierung der SAM-Datei in BAM-Format:
   • Tool: SAMtools SAMtools wird verwendet, um die SAM-Datei in eine BAM-Datei (Binary Alignment/Map) umzuwandeln und diese zu sortieren.

     // Konvertierung von SAM zu BAM:samtools view -Sb aligned_reads.sam > aligned_reads.bam// Sortieren der BAM-Datei:samtools sort aligned_reads.bam -o sorted_aligned_reads.bam

   • Output: BAM-Datei (sortiert)
3. Markieren von PCR-Duplikaten:
   • Tool: Picard Picard wird verwendet, um PCR-Duplikate zu markieren und aus der Analyse auszuschließen.

     // Markieren von Duplikaten:picard MarkDuplicates I=sorted_aligned_reads.bam O=dedup_sorted_aligned_reads.bam M=metrics.txt

   • Output: BAM-Datei (dedupliziert), Metrik-Datei
4. Variantenaufruf (Variant Calling):
   • Tool: GATK (Genome Analysis Toolkit) GATK bietet ein umfassendes Toolkit für die Variantenanalyse. Zunächst werden die Alignments bausteinweise lokal realigniert, und dann die Varianten aufgerufen.

     // Realignierung um Indels:gatk RealignerTargetCreator -R reference_genome.fasta -I dedup_sorted_aligned_reads.bam -o target_intervals.listgatk IndelRealigner -R reference_genome.fasta -I dedup_sorted_aligned_reads.bam -targetIntervals target_intervals.list -o realigned_reads.bam// Basisqualität neu kalibrieren:gatk BaseRecalibrator -I realigned_reads.bam -R reference_genome.fasta --known-sites known_variants.vcf -O recal_data.tablegatk ApplyBQSR -R reference_genome.fasta -I realigned_reads.bam --bqsr-recal-file recal_data.table -O recal_reads.bam// Varianten aufrufen:gatk HaplotypeCaller -R reference_genome.fasta -I recal_reads.bam -O raw_variants.vcf

   • Output: VCF-Datei (Variant Call Format) Die Ausgabe ist eine .vcf-Datei, die die aufgerufenen Varianten enthält.
5. Filtern und Annotation der Varianten:
   • Tool: VCFtools und ANNOVAR oder SnpEff VCFtools wird verwendet, um die Varianten zu filtern, und ANNOVAR oder SnpEff für die funktionelle Annotation der Varianten.

     // Filtern der Varianten:vcftools --vcf raw_variants.vcf --minQ 30 --recode --out filtered_variants.vcf// Annotation der Varianten: SnpEffsnpEff ann hg19 filtered_variants.vcf > annotated_variants.vcf// Annotation der Varianten: ANNOVARconvert2annovar.pl --format vcf4 filtered_variants.vcf > variants.avinputannotate_variation.pl -buildver hg19 variants.avinput humandb/

   • Output: Annotierte VCF-Datei

Durch diese Schritte stellst du sicher, dass die Sequenzdaten effektiv verarbeitet und die Varianten präzise identifiziert und annotiert werden, wodurch eine solide Grundlage für nachfolgende Analysen und Interpretationen geschaffen wird.

d)

Ein Hauptziel deiner Analyse ist die Identifizierung von varianten Allelen, die mit einer erhöhten Krebswahrscheinlichkeit assoziiert werden. Verwende das mathematische Modell der Mapping Quality. Angenommen, die Mapping Quality ist gegeben durch \(\text{MAPQ} = -10 \times \text{log}_{10}(P)\)\, beschreibe, was dieser Wert bedeutet und berechne die Wahrscheinlichkeit \(P\) bei einer Mapping Quality von 30.

Lösung:

Bedeutung und Berechnung der Mapping Quality (MAPQ)

Die Mapping Quality (MAPQ) ist ein Wert, der die Zuverlässigkeit des Alignments eines Sequenz-Reads mit einem Referenzgenom angibt. Er wird anhand der Wahrscheinlichkeit (\text{P}) berechnet, dass das Alignment an einer anderen Position genauso oder besser sein könnte. Die Formel zur Berechnung lautet:

Formel: \ \ \ \ \ \ \:

\(\text{MAPQ} = -10 \times \text{log}_{10}(P)\)

Bedeutung:

• Ein höherer MAPQ-Wert indiziert eine höhere Zuverlässigkeit des Alignments.
• Ein niedrigerer MAPQ-Wert indiziert geringere Zuverlässigkeit.

Berechnung der Wahrscheinlichkeit \(P\) bei einer Mapping Quality von 30

1. Gegebene MAPQ: \(\text{MAPQ} = 30\)
2. Umstellen der Formel, um \(P\) zu berechnen: \(30 = -10 \times \text{log}_{10}(P)\)
3. Auflösung für \(P\): \:
   • Teilen durch -10: \(\frac{30}{-10} = \text{log}_{10}(P)\)
   • \(\text{log}_{10}(P) = -3\)
4. Exponentiierung, um \(P\) zu berechnen:\(P = 10^{-3}\)
5. Berechnung:\(P = 0.001\)

Ergebnis:\(\displaystyle P = 0.001\)”). Dies bedeutet, dass die Wahrscheinlichkeit, dass das Alignment falsch ist, bei \(0.1\%\) liegt.

Aufgabe 2)

Massenspektrometrie in der Proteomik (Methoden und Interpretation)Massenspektrometrie verwendet zur Identifikation und Quantifizierung von Proteinen in komplexen Proben durch Analyse von Peptidmassen und -ladungen.

• Probenvorbereitung: Proteolyse (z.B. Trypsin), Peptidtrennung (HPLC)
• Ionisierungstechniken: MALDI, ESI
• Massendetektoren: TOF, Quadrupol, Orbitrap
• Identifikation: Datenbankenabgleich (Sequenz, Masse)
• Quantifizierung: Label-frei, isobarische Markierungen, SILAC
• Dateninterpretation: Software wie Mascot, X!Tandem, PEAKS
• Anwendungen: Biomarker-Entdeckung, Proteinprofilierung, PTM-Analyse

a)

Beschreibe den Prozess der Probenvorbereitung in der Massenspektrometrie in der Proteomik. Gehe hierbei speziell auf die Rolle der Proteolyse und der Peptidtrennung ein. Warum ist dieser Schritt für die anschließende Analyse wichtig?

Lösung:

Prozess der Probenvorbereitung in der Massenspektrometrie in der Proteomik

Die Probenvorbereitung ist ein kritischer Schritt in der Massenspektrometrie-basierte Proteomik, da sie den Grundstein für alle nachfolgenden Analysen legt. In diesem Prozess spielen insbesondere die Proteolyse und die Peptidtrennung eine zentrale Rolle.

• Proteolyse:

Die Proteolyse bezeichnet den gezielten Abbau von Proteinen in kleinere Peptidfragmente durch proteolytische Enzyme. Ein weitverbreitetes Enzym in diesem Kontext ist Trypsin, das spezifisch an den C-terminalen Seiten der Aminosäuren Lysin und Arginin schneidet. Dieser Schritt ist entscheidend, weil:

• Spezifität: Trypsin produziert durch seine spezifische Spaltung kleine Peptide, die für eine geordnete Analyse besser geeignet sind.
• Reproduzierbarkeit: Einhaltung konsistenter Spaltstellen führt zu reproduzierbaren und vorhersagbaren Peptidfragmenten, was den Vergleich von Probendaten erleichtert.

• Peptidtrennung:

Nach der Proteolyse müssen die resultierenden Peptide getrennt werden, um sie eindeutig identifizieren und quantifizieren zu können. Eine häufig angewandte Methode zur Peptidtrennung ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Dieser Schritt ist wichtig, weil:

• Komplexität reduzieren: Die Trennung der Peptide in einfachere Subsets verringert die Komplexität der Probe und erleichtert somit die anschließende Massenspektrometrie-Analyse.
• Signalstärke erhöhen: Durch die Trennung können die Peptide in kleineren Mengen und höherer Konzentration analysiert werden, was die Detektion und Identifikation verbessert.

Wichtigkeit des Probenvorbereitungsschritts für die anschließende Analyse

Die Probenvorbereitung ist unerlässlich, weil sie die Präzision und Genauigkeit der nachfolgenden Massenspektrometrie-Analyse maßgeblich beeinflusst. Eine gut vorbereitete Probe sorgt für:

• Effizientere Detektion: Klar definierte und getrennte Peptide erleichtern die Ionisierung und Detektion im Massenspektrometer.
• Exakte Identifikation: Die spezifischen Peptidfragmente lassen eine exakte Zuordnung zu Proteinsequenzen durch Datenbankabgleich zu.
• Quantitative Genauigkeit: Gleichmäßige und reproduzierbare Peptidprofile erlauben eine präzise quantitative Analyse mittels verschiedener Techniken wie label-frei oder isobarische Markierungen.

Daher ist der gesamte Probenvorbereitungsprozess von zentraler Bedeutung für den Erfolg der massenspektrometrischen Proteomik.

b)

Vergleiche die Ionisierungstechniken MALDI und ESI hinsichtlich ihrer Prinzipien und typischen Anwendungsgebiete in der Proteomik. Welche Vor- und Nachteile haben diese Techniken jeweils?

Lösung:

Vergleich der Ionisierungstechniken MALDI und ESI in der Proteomik

In der Massenspektrometrie kommen verschiedene Ionisierungstechniken zum Einsatz, um Moleküle in die Gasphase zu überführen und ionisierbar zu machen. Zwei der gebräuchlichsten Methoden in der Proteomik sind MALDI (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisierung) und ESI (Elektrospray-Ionisierung). Beide Techniken haben charakteristische Prinzipien und spezifische Anwendungsgebiete, die sie für bestimmte Aufgaben besser geeignet machen.

• Prinzipien

• MALDI (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisierung):

MALDI basiert auf der Einbettung der zu analysierenden Probe in eine lichtabsorbierende Matrix. Ein Laserstrahl trifft auf die Matrix, was zur Desorption und Ionisation der eingebetteten Moleküle führt.

• Funktion: Die Matrix absorbiert den Laserimpuls und überträgt die Energie auf die Probe, wodurch diese ionisiert wird.
• Typische Anwendungsgebiete: Protein- und Peptid-Analyse, insbesondere die Identifizierung großer Biomoleküle und komplexer Proteinmischungen.

• ESI (Elektrospray-Ionisierung):

ESI ionisiert Moleküle durch Erzeugen eines feinen Aerosols aus der Probe, die in einer Lösung vorliegt. Eine Hochspannung wird angelegt, wodurch die Tröpfchen sich aufladen und beim Verdampfen Ionen freisetzen.

• Funktion: Die Lösung wird durch eine feine Kapillare gedrückt und in einem elektrischen Feld zerstäubt. Die entstehenden Tröpfchen verdampfen teilweise und erzeugen geladene Ionen.
• Typische Anwendungsgebiete: Analyse von Proteinen, kleinen Molekülen und Metaboliten, insbesondere in Flüssigchromatographie-MS-Kopplungen (LC-MS).

• Vor- und Nachteile

• MALDI:

• Vorteile:

• Einfachheit: Schnelle Probenvorbereitung und einfache Messung.
• Sensitivität: Sehr empfindlich für große Biomoleküle.
• Stabilität: MALDI-erzeugte Ionen sind oft stabiler und neigen weniger zur Fragmentierung.

• Nachteile:

• Matrixeinflüsse: Matrix-Signale können das Spektrum stören.
• Komplexität: Schwierigkeiten bei der Analyse von sehr komplexen Proteingemischen.

• ESI:

• Vorteile:

• Kopplung: Perfekt geeignet für Online-Kopplungen mit HPLC.
• Breites Anwendungsspektrum: Kann sowohl kleine als auch große Moleküle analysieren.
• Weiche Ionisierung: Reduziert die Fragmentierung großer Moleküle.

• Nachteile:

• Ladungszustände: Erzeugt oft Ionen mit mehreren Ladungen, was die Dateninterpretation erschweren kann.
• Probenanforderungen: ESI erfordert, dass die Probe in Lösung ist, was nicht immer praktikabel ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sowohl MALDI als auch ESI ihre eigenen Stärken und Anwendungsbereiche haben. MALDI ist ideal für die schnelle und empfindliche Analyse großer Biomoleküle, während ESI durch seine Vielseitigkeit und Fähigkeit zur Kopplung mit chromatographischen Techniken punktet. Die Wahl der geeigneten Ionisierungstechnik hängt letztlich vom spezifischen Anwendungsfall und den Eigenschaften der zu analysierenden Probe ab.

c)

Erläutere den Einsatz von Massendetektoren in der Proteomik. Vergleiche TOF, Quadrupol und Orbitrap hinsichtlich ihrer Funktionsweise und Sensitivität. Berechne die Auflösung eines TOF-MS, wenn der Flugweg 1 Meter beträgt und die Flugzeitdifferenz zwischen zwei benachbarten Massen 10 Nanosekunden ist.

Lösung:

Einsatz von Massendetektoren in der Proteomik

Massendetektoren sind entscheidende Komponenten in der Massenspektrometrie, die es ermöglichen, die Masse-zu-Ladungsverhältnisse (m/z) von Ionen zu messen. In der Proteomik werden verschiedene Arten von Massendetektoren verwendet, um spezifische Anforderungen in Bezug auf Empfindlichkeit, Genauigkeit und Auflösung zu erfüllen. Zu den häufig verwendeten Massendetektoren gehören TOF (Time-of-Flight), Quadrupol und Orbitrap.

• TOF (Time-of-Flight) Massendetektor:

Der TOF-Detektor misst die Zeit, die ein Ion benötigt, um eine bestimmte Flugstrecke zurückzulegen. Leichtere Ionen erreichen den Detektor schneller als schwerere Ionen. Die Flugzeit wird in ein Masse-zu-Ladungsverhältnis umgerechnet.

• Funktionsweise: Ionen werden beschleunigt und in einen Flugrohr überführt. Die Flugzeit der Ionen bis zum Detektor wird gemessen und zur Berechnung der m/z-Werte verwendet.
• Empfindlichkeit: Der TOF-Detektor hat eine hohe Empfindlichkeit und ist besonders gut geeignet für die Analyse von großen Molekülen und komplexen Gemischen.
• Quadrupol Massendetektor:

Ein Quadrupol-Detektor besteht aus vier parallelen Stäben, die ein oszillierendes elektrisches Feld erzeugen. Ionen werden durch dieses Feld geführt und nur Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhältnis können den Quadrupol passieren und den Detektor erreichen.

• Funktionsweise: Wechselnde elektrische Felder lenken Ionen ab. Nur Ionen mit bestimmten m/z-Werten gelangen in den Detektor, während andere Ionen abgelenkt werden.
• Empfindlichkeit: Quadrupol-Detektoren bieten hohe Empfindlichkeit und Genauigkeit, sind jedoch in ihrer Auflösung begrenzt im Vergleich zu TOF und Orbitrap.
• Orbitrap Massendetektor:

Der Orbitrap-Detektor nutzt die Bewegung von Ionen in einem elektrostatischen Feld, um ihre m/z-Verhältnisse zu messen. Ionen bewegen sich auf spiralförmigen Bahnen und erzeugen ein oszillierendes Signal, das zur Bestimmung der Masse verwendet wird.

• Funktionsweise: Ionen werden in einer elektrostatischen Falle gespeichert und bewegen sich auf stabilen Bahnen. Das erzeugte oszillierende Signal wird analysiert, um das m/z-Verhältnis zu berechnen.
• Empfindlichkeit: Der Orbitrap-Detektor bietet eine sehr hohe Auflösung und Genauigkeit, was ihn besonders geeignet für die detaillierte Analyse von Proteinen und Peptiden macht.
• Berechnung der Auflösung eines TOF-MS

Die Auflösung eines TOF-Massenspektrometers kann mit der Formel

R = \frac{t}{Δt}

berechnet werden, wobei

• R: Auflösung
• t: Flugzeit des Ions
• Δt: Flugzeitdifferenz zwischen zwei benachbarten Massen

Angenommen, der Flugweg (L) beträgt 1 Meter und die Flugzeitdifferenz zwischen zwei benachbarten Massen (Δt) beträgt 10 Nanosekunden. Wenn wir die Geschwindigkeit der Ionen (v) als konstant annehmen können, dann ist

t = \frac{L}{v}

Um die Auflösung zu berechnen, benötigen wir ferner eine Näherung der Flugzeit t des Ions. Für ein Ion mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 10^6 m/s über einen 1-Meter-Flugweg, beträgt die Flugzeit

t ≈ 10^{-6} Sekunden

Die Auflösung (R) wäre dann

R = \frac{10^{-6}}{10^{-9}} = 1000

Somit beträgt die Auflösung des TOF-MS unter den gegebenen Bedingungen 1000.

Zusammengefasst spielen TOF, Quadrupol und Orbitrap unterschiedliche Rollen in der Proteomik, wobei jeder Detektor spezifische Vorteile für verschiedene Analysetypen bietet.

d)

Beschreibe die verschiedenen Methoden zur Quantifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie. Diskutiere die Prinzipien der label-freien Quantifizierung und isobarischer Markierungen sowie SILAC. Wie beeinflussen diese Methoden die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Quantifizierungsdaten?

Lösung:

Methoden zur Quantifizierung von Proteinen mittels Massenspektrometrie

In der Massenspektrometrie werden verschiedene Methoden zur Quantifizierung von Proteinen eingesetzt. Diese Methoden lassen sich in zwei Hauptkategorien unterteilen: label-freie Quantifizierung und markierungsbasierte Quantifizierung. Zu den letzteren gehören isobarische Markierungen und SILAC (Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture).

• Label-freie Quantifizierung (LFQ):

Bei der label-freien Quantifizierung wird die Intensität der Peptid- oder Proteinsignale direkt gemessen. Dies geschieht entweder durch die Integration der Peptidspitzen in einem Chromatogramm oder durch die Zählung der Peptidfragmentationen in Massenpeaks (Spectral Counting).

• Prinzip: Die Intensität des Signals eines Peptids oder Proteins ist proportional zu seiner Konzentration in der Probe.
• Vorteile: Keine Notwendigkeit für chemische Markierungen oder isotopenmarkierte Standards; geeignet für die Analyse großer Probenmengen.
• Nachteile: Mögliche Variabilität aufgrund von Drift im MS-Signal oder Unterschiede in der Probenvorbereitung; anfällig gegenüber schwankenden instrumentellen Bedingungen.
• Isobarische Markierungen (z.B. iTRAQ, TMT):

Isobarische Markierungen sind chemische Markierungen, die an Peptide gebunden werden. Diese Markierungen erzeugen Ionen mit identischer Masse, werden jedoch in der MS/MS-Stufe aufgetrennt und erzeugen reporter Ionen mit spezifischen Massen, die für die Quantifizierung verwendet werden können.

• Prinzip: Gleichartige Peptide aus unterschiedlichen Proben werden chemisch markiert, kombiniert und dann in einem einzigen MS-Lauf analysiert. Die Quantifizierung erfolgt über die Intensitäten der reporter Ionen im MS/MS-Spektrum.
• Vorteile: Erlaubt die parallele Analyse und Quantifizierung mehrerer Proben gleichzeitig; reduziert Variabilität durch kombiniertes Messen.
• Nachteile: Teure Reagenzien; möglicherweise Qualitätseinbußen durch Intra- und Interpeptidinterferenzen.
• SILAC (Stable Isotope Labeling by/with Amino acids in Cell culture):

SILAC ist eine Methode zur Markierung von Proteinen direkt in Zellen durch Kultivierung dieser in Medien, die stabile Isotopen (wie ¹³C oder ¹⁵N) enthalten.

• Prinzip: Zellen werden in Medien mit leichten oder schweren Isotopen kultiviert. Proteine aus diesen Zellen werden dann gemischt und gemeinsam analysiert. Unterschiede in den Peptidintensitäten im MS-Spektrum liefern quantitative Informationen.
• Vorteile: Minimale Probenaufbereitung und keine chemische Modifikation notwendig; erlaubt direkte Vergleichbarkeit durch In-vivo-Markierung.
• Nachteile: Begrenzung auf zellkulturbasierte Anwendungen; hohes Kostenaufkommen für isotonische Aminosäuren.
• Einfluss auf Genauigkeit und Reproduzierbarkeit:

Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Daten hängt stark von der gewählten Methode ab:

• Label-freie Quantifizierung: Hohe Variabilität möglich aufgrund von instrumentellen Schwankungen und Probenvorbereitungsunterschieden; jedoch hohe Durchsatzkapazität und weniger Kosten.
• Isobarische Markierungen: Bessere Reproduzierbarkeit durch gleichzeitige Analyse mehrerer Proben im selben Lauf; jedoch mögliche Interferenzen und hohe Kosten.
• SILAC: Sehr wenig Probenaufbereitungs-Artefakte und hohe quantitative Genauigkeit; Einschränkungen durch notwendige Zellkulturen.

In der Proteomik sollten die Quantifizierungsmethoden abhängig von den experimentellen Anforderungen, verfügbaren Ressourcen und dem gewünschten Genauigkeitsgrad gewählt werden.

Aufgabe 3)

Die Integration von Ethik und Datenschutz ist entscheidend für die Forschung in der Genomik und Proteomik, da diese Bereiche oft mit umfangreichen und sensitiven personenbezogenen Daten hantieren. Eine starke Betonung liegt auf der Einhaltung ethischer Standards und dem Schutz persönlicher Daten. Wichtige Maßnahmen umfassen:

• Einwilligung (Informed Consent): Die informierte Zustimmung der Teilnehmer ist unerlässlich.
• Anonymisierung: Sicherstellung der Datenvertraulichkeit durch geeignete Anonymisierungsverfahren.
• Gute wissenschaftliche Praxis: Vermeidung von Diskriminierung und unethischem Verhalten.
• Datenzugriff: Implementierung kontrollierter Zugangsrechte zu Datenbanken.
• Regulierungen: Einhaltung gesetzlicher Richtlinien wie der DSGVO.

a)

1. Diskutiere die Bedeutung der informierten Einwilligung (Informed Consent) im Kontext der Genom- und Proteomikforschung. Inwiefern trägt diese Praxis zum Schutz der Teilnehmer bei und welche ethischen Implikationen könnten entstehen, wenn diese nicht ordnungsgemäß eingeholt wird?

Lösung:

Diskussion der Bedeutung der informierten Einwilligung (Informed Consent) im Kontext der Genom- und Proteomikforschung:

• Schutz der Teilnehmer: Die informierte Einwilligung ist ein zentraler Bestandteil des ethischen Umgangs mit Teilnehmerdaten in der Genom- und Proteomikforschung. Sie gewährleistet, dass die Teilnehmer vollständig über den Zweck, die Methoden, potenzielle Risiken und Vorteile der Studie informiert sind, bevor sie zustimmen, daran teilzunehmen. Dies schützt die Teilnehmer vor ungewollter Nutzung ihrer Daten und stellt sicher, dass sie eine bewusste Entscheidung treffen können.
• Transparenz und Vertrauen: Ein transparenter Prozess der Einholung der Einwilligung fördert das Vertrauen der Öffentlichkeit und der Teilnehmer in die Forschung. Es zeigt, dass die Forscher die Rechte und das Wohlergehen der Teilnehmer respektieren.
• Ethik und Recht: In vielen Ländern ist die informierte Einwilligung nicht nur eine ethische, sondern auch eine gesetzliche Anforderung. Das Ignorieren dieser Verpflichtung kann zu rechtlichen Konsequenzen führen und den Ruf der Forschungseinrichtung schädigen.
• Potenzielle ethische Implikationen bei Nichteinholung: Wenn die informierte Einwilligung nicht ordnungsgemäß eingeholt wird, können mehrere ethische Probleme entstehen:
  • Verletzung der Autonomie: Ohne informierte Einwilligung wird die Autonomie der Teilnehmer missachtet, da sie keine Kontrolle über die Nutzung ihrer personenbezogenen Daten haben.
  • Risiko von Missbrauch: Es besteht ein erhöhtes Risiko, dass die Daten für unethische Zwecke verwendet werden, was zu Diskriminierung oder sozialen Nachteilen für die Teilnehmer führen könnte.
  • Vertrauensverlust: Die Teilnehmer und die Öffentlichkeit könnten das Vertrauen in die Forschung verlieren, was die Bereitschaft zur Teilnahme an zukünftigen Studien beeinträchtigen könnte.
  • Rechtliche Konsequenzen: Das Versäumnis, eine ordnungsgemäße Einwilligung einzuholen, kann rechtliche Folgen haben und gegen Datenschutzgesetze wie die DSGVO verstoßen.

b)

2. Berechne ein Beispiel für die statistische Wahrscheinlichkeit einer versehentlichen Re-Identifikation einer Person aus einer anonymisierten Datenbank im Rahmen der Genomikforschung. Nehmen wir an, dass eine Datenbank 10.000 Datensätze enthält und für jeden Datensatz 100 spezifische genetische Marker anonymisiert vorliegen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein genetischer Marker zufällig einem anderen Datensatz entspricht, beträgt 0,001. Wie hoch ist die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer der genetischen Marker für eine Person identifizierbar ist?

Lösung:

Berechnung der Wahrscheinlichkeit einer versehentlichen Re-Identifikation:

• Gegeben: Eine Datenbank mit 10.000 Datensätzen, jeder Datensatz enthält 100 spezifische genetische Marker. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner genetischer Marker zufällig einem anderen Datensatz entspricht, beträgt 0,001 (0,1%).
• Wir wollen die Wahrscheinlichkeit berechnen, dass mindestens einer der genetischen Marker für eine Person identifizierbar ist.
• Zunächst berechnen wir die Wahrscheinlichkeit, dass ein einzelner genetischer Marker nicht übereinstimmt:
• P(\text{nicht übereinstimmender Marker}) = 1 - 0,001 = 0,999
• Die Wahrscheinlichkeit, dass keiner der 100 genetischen Marker übereinstimmt, ist:
• P(\text{kein übereinstimmender Marker}) = 0,999^{100}
• Diese Wahrscheinlichkeit können wir wie folgt berechnen:
• P(\text{kein übereinstimmender Marker}) ≈ e^{-100 \times 0,001}
• P(\text{kein übereinstimmender Marker}) ≈ e^{-0,1}
• P(\text{kein übereinstimmender Marker}) ≈ 0,9048
• Die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer der 100 genetischen Marker übereinstimmt, ist somit:
• P(\text{mindestens ein übereinstimmender Marker}) = 1 - P(\text{kein übereinstimmender Marker})
• P(\text{mindestens ein übereinstimmender Marker}) = 1 - 0,9048
• P(\text{mindestens ein übereinstimmender Marker}) ≈ 0,0952
• Das bedeutet, die Wahrscheinlichkeit, dass mindestens einer der genetischen Marker für eine Person identifizierbar ist, beträgt etwa 9,52%.

Aufgabe 4)

In den letzten Jahrzehnten hat es erhebliche Fortschritte im Verständnis der Signaltransduktionswege gegeben, die das Wachstum und Überleben von Krebszellen beeinflussen. Diese Signalwege sind oft durch genetische Mutationen aktiviert oder verändert. Eingriffe in diese Signalwege können daher potenzielle therapeutische Ziele darstellen.

Betrachte drei wichtige Signalwege, die in Krebszellen eine bedeutende Rolle spielen: MAPK, PI3K/AKT, und Wnt/β-Catenin. Genetische Veränderungen betreffen sowohl Onkogene (z.B., RAS) als auch Tumorsuppressorgene (z.B., TP53). Mutationen in diesen Genen können zu unkontrolliertem Zellwachstum und Apoptose-Resistenz führen.

a)

Diskutiere detailliert die Rolle der MAPK-Signalkaskade in der Krebsentstehung. Nenne die Schlüsselkomponenten dieses Signalweges und beschreibe, wie Mutationen in RAS oder anderen Genen diesen Weg beeinflussen können. Wie könnte eine therapeutische Intervention aussehen?

Lösung:

Die MAPK-Signalkaskade (Mitogen-aktivierte Proteinkinase) ist ein zentraler Signalweg, der das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Zellen reguliert. Eine Fehlregulation dieses Signalweges kann zur Krebsentstehung beitragen. Lassen uns die Schlüsselkomponenten und die Auswirkungen von Mutationen im Detail betrachten:

• Schlüsselkomponenten der MAPK-Signalkaskade:
• RAS: Dies ist ein kleines GTPase-Protein, das bei Aktivierung GTP bindet und eine Kaskade von Phosphorylierungen startet. Mutationen im RAS-Gen, wie z.B. KRAS, NRAS oder HRAS, führen oft zu einer konstitutiven Aktivierung des Proteins, was unkontrolliertes Zellwachstum fördert.
• RAF: Es gehört zur Familie der Serin/Threonin-Proteinkinasen und schaltet MAPK-Signalwege an. BRAF ist eine häufig mutierte Form in Krebszellen, insbesondere im Melanom.
• MEK: Diese Kinasen phosphorylieren und aktivieren die MAPKs. MEK1 und MEK2 sind die typischen Mitglieder, die durch RAF aktiviert werden.
• ERK: Die extrazellulär regulierten Kinasen (ERK1 und ERK2) sind die ultimativen Effektoren dieses Signalweges. Sie phosphorylieren verschiedene Zielproteine im Zellkern und im Zytoplasma, was zur Zellproliferation und zum Überleben beiträgt.
• Mutationen und ihre Auswirkungen:
• RAS: Mutationen im RAS-Gen, wie z.B. Infektionen, die zu einer ständigen GTP-Bindung führen, können eine permanente Aktivierung der MAPK-Signalkaskade zur Folge haben. Dies resultiert in unkontrolliertem Zellwachstum und kann zur Tumorbildung beitragen.
• BRAF: Mutationen, insbesondere V600E, führen zu einer konstante Aktivierung des RAF-Kinasewegs, was eine kontinuierliche Steuerung des Zellzyklus und damit auch das Tumorwachstum unterstützt.
• Andere Komponenten wie MEK und ERK können auch durch genetische Veränderungen beeinflusst werden, was ebenfalls zu einer dauerhaften Aktivierung der Signalkaskade führt.
• Therapeutische Interventionen:
• MEK-Inhibitoren: Diese Medikamente blockieren gezielt MEK und verhindern so die Weiterleitung des Signals in der Kaskade, was das Tumorwachstum reduziert. Beispiele sind Trametinib und Selumetinib.
• RAF-Inhibitoren: Das bekannteste Beispiel ist Vemurafenib, das speziell gegen mutiertes BRAF (z.B. BRAF V600E) wirkt.
• RAS-Inhibitoren: Direkte Inhibitoren von RAS sind schwer zu entwickeln, aber es gibt Ansätze, um die Interaktion von RAS mit anderen Proteinen oder seine posttranslationale Modifikation zu blockieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die MAPK-Signalkaskade eine zentrale Rolle in der Krebsentstehung spielt. Mutationen in Genen wie RAS oder BRAF führen zu einer anhaltenden Aktivierung des Signalwegs, was zu unkontrolliertem Zellwachstum führt. Therapeutische Interventionen, wie die Nutzung von spezifischen Inhibitoren gegen Komponenten der Signalkaskade, bieten vielversprechende Ansätze zur Behandlung von Krebs.

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Vergleiche und kontrastiere die Mechanismen der PI3K/AKT- und Wnt/β-Catenin-Signalwege. Welche Rolle spielen diese Signalwege bei der Apoptose-Resistenz und dem unkontrollierten Zellwachstum? Erkläre, wie zielgerichtete Therapien, wie Kinase-Inhibitoren und monoklonale Antikörper, in diese Signalwege eingreifen können.

Lösung:

Die PI3K/AKT- und Wnt/β-Catenin-Signalwege spielen beide eine entscheidende Rolle in der Regulation von Zellprozessen wie Wachstum, Überleben und Differenzierung. Beide Signalwege können bei ihrer Fehlregulation zur Krebsentstehung beitragen. Hier folgt ein detaillierter Vergleich und Kontrast dieser Signalwege:

PI3K/AKT-Signalweg:

• Mechanismus:
  • Der PI3K/AKT-Signalweg wird durch die Bindung von Wachstumshormonen oder anderen Liganden an Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTKs) aktiviert.
  • PI3K (Phosphoinositid-3-Kinase) wird rekrutiert und aktiviert, was zur Produktion von PIP3 (Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat) führt.
  • PIP3 rekrutiert und aktiviert AKT, auch bekannt als Protein Kinase B (PKB).
  • Aktiviertes AKT phosphoryliert verschiedene Zielproteine, die Zellwachstum, Zellproliferation und Überleben fördern und Apoptose unterdrücken.
• Rolle bei der Apoptose-Resistenz:
  • AKT phosphoryliert und inaktiviert pro-apoptotische Proteine wie BAD und FOXO, was zur Zellüberleben beiträgt.
  • AKT fördert auch die Expression von Anti-Apoptose-Proteinen wie Bcl-2 und Mcl-1.
• Rolle beim unkontrollierten Zellwachstum:
  • Durch die Aktivierung von mTOR (mechanistic target of rapamycin) und anderen Wachstumsfaktoren fördert AKT die Zellzyklusprogression und das Zellwachstum.
  • Mutationen und Überaktivierung von PI3K oder AKT führen oft zu unkontrolliertem Zellwachstum und Tumorbildung.

Wnt/β-Catenin-Signalweg:

• Mechanismus:
  • Der Wnt/β-Catenin-Signalweg wird durch die Bindung von Wnt-Proteinen an ihre Rezeptoren (Frizzled und LRP5/6) aktiviert.
  • Dies führt zur Inaktivierung des Zerstörungskomplexes (AXIN, APC, GSK-3β), der normalerweise β-Catenin abbaut.
  • Stabilisiertes β-Catenin akkumuliert im Zytoplasma und transloziert in den Zellkern, wo es mit TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren interagiert und die Expression von Zielgenen aktiviert.
• Rolle bei der Apoptose-Resistenz:
  • Eine erhöhte β-Catenin-Aktivität kann die Expression von Anti-Apoptose-Genen wie survivin und Bcl-xl fördern.
• Rolle beim unkontrollierten Zellwachstum:
  • Die transkriptionelle Aktivierung von Zielgenen durch β-Catenin fördert Zellproliferation und Tumorwachstum.
  • Mutationen in Wnt-Signalweg-Komponenten wie APC oder β-Catenin führen zu einer konstitutiven Aktivierung dieses Signalwegs und zu Krebs.

Zielgerichtete Therapien:

• Kinase-Inhibitoren:
  • Im PI3K/AKT-Signalweg:
    • PI3K-Inhibitoren (z.B. Alpelisib) blockieren die Aktivierung von PI3K und folglich die Produktion von PIP3.
    • AKT-Inhibitoren (z.B. Ipatasertib) verhindern die Aktivierung von AKT.
    • mTOR-Inhibitoren (z.B. Everolimus) zielen auf nachgelagerte Effektoren ab, die für Zellwachstum und Überleben verantwortlich sind.
  • Im Wnt/β-Catenin-Signalweg:
    • GSK-3β-Inhibitoren wirken auf den Zerstörungskomplex.
    • κ-Catenin-Inhibitoren (z.B. PRI-724) blockieren die Interaktion von β-Catenin mit TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren.
• Monoklonale Antikörper:
  • Monoklonale Antikörper können gegen spezifische Proteine der Signalwege gerichtet werden, wie z.B. HER2-Antikörper (z.B. Trastuzumab) im PI3K/AKT-Signalweg, die die Rezeptor-Aktivierung blockieren.
  • Im Wnt-Signalweg können Antikörper gegen Frizzled-Rezeptoren oder Wnt-Liganden genutzt werden, um die Signalweiterleitung zu hemmen.

Zusammengefasst spielen sowohl der PI3K/AKT- als auch der Wnt/β-Catenin-Signalweg eine wichtige Rolle bei der Apoptose-Resistenz und dem unkontrollierten Zellwachstum in Krebszellen. Zielgerichtete Therapien wie Kinase-Inhibitoren und monoklonale Antikörper bieten spezifische Ansätze, um diese Signalwege zu blockieren und das Tumorwachstum zu kontrollieren.