Elective Module - Exam

Aufgabe 1)

Du bist Forscher im Bereich der molekularen Medizin und arbeitest an einem Projekt zur vollständigen Sequenzierung des menschlichen Genoms eines Patienten, um genetische Ursachen einer seltenen Krankheit zu identifizieren. Deine Aufgabe ist es, die geeignete Sequenzierungsmethode auszuwählen und die erhaltenen Daten zu analysieren.

a)

Beschreibe und vergleiche die verschiedenen Sequenzierungsmethoden (Sanger-Sequenzierung, Nächste Generation Sequenzierung (NGS), PacBio (SMRT), Oxford Nanopore) hinsichtlich ihrer Leseweite, Genauigkeit, Kosten und Anwendungsgebiete. Welche Methode würdest Du für die Sequenzierung des menschlichen Genoms empfehlen und warum?

Lösung:

Um die verschiedenen Sequenzierungsmethoden in Bezug auf Leseweite, Genauigkeit, Kosten und Anwendungsgebiete zu beschreiben und zu vergleichen, folgt eine detaillierte Analyse:

• Sanger-Sequenzierung:
  • Leseweite: Bis zu 1000 Basenpaare pro Durchlauf.
  • Genauigkeit: Sehr hoch, mit einer Fehlerquote von ungefähr 1 pro 100.000 Basen.
  • Kosten: Hohe Kosten pro Basenpaar. Es ist kostspielig und zeitaufwendig für die Sequenzierung ganzer Genome.
  • Anwendungsgebiete: Ideal für kleine DNA-Fragmente, Validierung von NGS-Daten, und spezifische Genanalysen.
• Nächste Generation Sequenzierung (NGS):
  • Leseweite: Kurze Reads (50-300 Basenpaare), abhängig von der Plattform (z.B., Illumina).
  • Genauigkeit: Hoch, aber variabel; oft erfordert Fehlerkorrektur.
  • Kosten: Vergleichsweise niedrige Kosten pro Basenpaar. Es können große Mengen an Daten in kurzer Zeit generiert werden.
  • Anwendungsgebiete: Breites Anwendungsspektrum, einschließlich ganzer Genomsequenzierung, Genexpressionanalyse (RNA-Seq), und Epigenetikstudien.
• PacBio (SMRT):
  • Leseweite: Lange Reads (10.000-15.000 Basenpaare, mit Spitzen bis 100.000 Basenpaare).
  • Genauigkeit: Moderat, Fehlerquote kann höher sein, allerdings werden Fehler weitgehend durch die Software korrigiert (HiFi Daten).
  • Kosten: Höhere Kosten im Vergleich zu NGS, jedoch sinken die Preise.
  • Anwendungsgebiete: Ideal für die Sequenzierung komplexer Genome, De-novo-Assemblierung, und Erkennung struktureller Variationen.
• Oxford Nanopore:
  • Leseweite: Sehr lange Reads, theoretisch bis zu mehreren Megabasen.
  • Genauigkeit: Moderate bis niedrige Genauigkeit, allerdings verbessern sich die Algorithmen stetig.
  • Kosten: Variable Kosten, relativ günstig im Vergleich zu anderen Langread-Technologien.
  • Anwendungsgebiete: Geeignet für Echtzeitanalysen, lange Reads zur Erkennung von strukturellen Variationen und zur Sequenzierung von schwierigen Regionen des Genoms.

Empfehlung: Für die vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms würde ich die Nächste Generation Sequenzierung (NGS) empfehlen. Die Gründe dafür sind:

• Hohe Genauigkeit und Zuverlässigkeit bei der Erzeugung kurzer Reads, die hervorragend für die Assemblierung großer Genome geeignet sind.
• Kosten sind im Vergleich zu anderen Methoden moderat, wodurch es für groß angelegte Studien erschwinglich ist.
• Weite Verbreitung und gut unterstützte Plattformen mit ausgereifter Bioinformatik-Infrastruktur.

Für spezifische Fragestellungen, wie die Erkennung von strukturellen Variationen oder schwer zu sequenzierende Regionen, könnte es sinnvoll sein, NGS mit PacBio (SMRT) oder Oxford Nanopore zu kombinieren. Diese ergänzen die Daten durch ihre Fähigkeit, lange Reads zu liefern.

b)

Nimm an, die Sequenzierungsdaten weisen mehrere Fragmente einer Länge von 150 Millionen Basenpaaren auf. Erläutere den Prozess der Datenanalyse vom Rohdatenstadium bis zur Interpretation und wie Du sicherstellen kannst, dass die identifizierten genetischen Varianten mit der Krankheit des Patienten in Verbindung stehen. Nutze hierbei mathematische Werkzeuge, wo nötig, um statistische Signifikanz oder andere relevante Parameter zu berechnen.

Lösung:

Der Prozess der Datenanalyse vom Rohdatenstadium bis zur Interpretation der identifizierten genetischen Varianten umfasst mehrere Schritte. Hier ist eine detaillierte Erläuterung, einschließlich der Verwendung mathematischer Werkzeuge zur Gewährleistung der statistischen Signifikanz:

• Schritt 1: Qualitätskontrolle der Rohdaten
  • Verwendung von Werkzeugen wie FastQC zur Überprüfung der Qualität der Sequenzierungsdaten (u.a. Sequenzqualität, Adapterkontamination, GC-Inhalt).
  • Filtern und Trimmen der Rohdaten, um minderwertige Reads und Adaptersequenzen zu entfernen (z.B. mit Trimmomatic).
• Schritt 2: Alignment der Sequenzdaten
  • Abgleich der gefilterten Reads auf ein Referenzgenom (z.B. humanes Referenzgenom GRCh38) mithilfe von Alignern wie BWA oder Bowtie2.
  • Samtools zum Sortieren und Bereinigen der alignierten Daten verwenden, gefolgt von der Umwandlung in BAM-Dateien für die weitere Analyse.
• Schritt 3: Identifikation von genetischen Varianten
  • Verwendung von Werkzeugen wie GATK oder FreeBayes zur Identifizierung von SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und InDels (Insertionen und Deletionen).
  • Filtern der identifizierten Varianten basierend auf Qualitätsmetriken, um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren.
• Schritt 4: Annotation und Priorisierung der Varianten
  • Verwendung von Annotationstools wie ANNOVAR oder SnpEff zur funktionellen Annotation der Varianten (z.B. Genort, Effekt auf das Protein).
  • Priorisierung der Varianten basierend auf ihrer potenziellen Pathogenität, z.B. mithilfe von Algorithmen wie CADD (Combined Annotation Dependent Depletion) oder PolyPhen-2.
• Schritt 5: Verknüpfung der Varianten mit der Krankheit
  • Vergleich der priorisierten Varianten mit Datenbanken bekannter Krankheitsgene (z.B. ClinVar, OMIM).
  • Berücksichtigung der Vererbungsmuster und der phänotypischen Konsistenz.
• Schritt 6: Statistische Analyse und Validierung
  • Verwendung statistischer Tests wie Chi-Quadrat-Tests oder Fisher's exact test zur Bewertung der Assoziation zwischen den identifizierten Varianten und der Krankheit.
  • Berechnung der p-Werte zur Bestimmung der statistischen Signifikanz. Ein typischer Grenzwert für die statistische Signifikanz ist p < 0.05.
  • Verwendung von Bonferroni-Korrektur oder False Discovery Rate (FDR) zur Anpassung der p-Werte bei Multiplen Tests.
  • Validierung der potenziellen Krankheitsvarianten durch Sanger-Sequenzierung.
• Beispiel für statistische Signifikanzberechnung:
  • Falls Du 10.000 Varianten identifizierst und jede einzeln testest, würde eine Bonferroni-Korrektur den Schwellenwert für die Signifikanzanpassung auf \(\frac{{0.05}}{{10.000}} = 5 \times 10^{-6}\) senken.

Interpretation und Schlussfolgerung Nachdem die Varianten identifiziert und ihre Assoziation mit der Krankheit statistisch signifikant bestätigt wurden, erfolgt die endgültige Interpretation unter Berücksichtigung der biologischen und klinischen Relevanz. Die Ergebnisse können dann für weitere funktionelle Studien oder klinische Anwendungen genutzt werden.

Aufgabe 2)

Ein Forschungsteam hat Reihenfolge-Daten von einer neuen Human-DNA-Probe mittels NGS-Technologien (Illumina und PacBio) generiert. Zur weitergehenden Analyse nutzen sie Methoden wie Alignment, Variant Calling und Transcriptomics, um genetische Variationen zu identifizieren und die Genexpression zu untersuchen. Bioinformatische Werkzeuge wie SAMtools und GATK sowie statistische Methoden, einschließlich PCA, werden verwendet, um Muster in den Daten zu erkennen und zu analysieren.

a)

• Sequenzierung und Alignment: Beschreibe detailliert den Prozess der Sequenzierung mittels Illumina und PacBio. Erkläre, wie diese Technologien sich in Bezug auf die Leselänge und Genauigkeit unterscheiden. Anschließend beschreibe, wie Du die generierten Sequenzen mittels BLAST oder Bowtie alignieren würdest, um homologe Bereiche zu identifizieren.

Lösung:

• Sequenzierung und Alignment: Um den Prozess der Sequenzierung mittels Illumina und PacBio detailliert zu beschreiben und die Unterschiede zwischen diesen Technologien sowie die nachfolgende Alignment-Analyse zu erläutern, müssen folgende Aspekte betrachtet werden: Illumina Sequenzierung:
  • Prozess: Illumina-Technologie basiert auf der Synthese von DNA. Nach Fragmentierung des Genoms und Anfügungen von Adaptern werden die DNA-Fragmente an eine Glasoberfläche gebunden. Während der Sequenzierung werden Nukleotide basenweise hinzugefügt und durch fluoreszierende Signale erkannt. Diese Signale werden von einem Detektor aufgezeichnet, was eine Erzeugung der DNA-Sequenz ermöglicht.
  • Leselänge: Illumina liefert kurze Reads, typischerweise zwischen 50-300 Basenpaaren (bps).
  • Genauigkeit: Die Technologie hat eine hohe Genauigkeit mit einer Fehlerrate von etwa 0,1%.
  PacBio Sequenzierung:
  • Prozess: Bei der PacBio-Sequenzierung wird die Technologie der 'Single Molecule Real-Time' (SMRT) verwendet. Die DNA-Polymerase synthetisiert einen neuen DNA-Strang innerhalb einer Nanostruktur, und dies wird in Echtzeit beobachtet. Fluoreszenzmarkierte Nukleotide emittieren Licht während der Inkorporation, das von einem Detektor erfasst wird.
  • Leselänge: PacBio kann sehr lange Reads erzeugen, die typischerweise zwischen 10.000 und 15.000 bps liegen, jedoch können sie auch länger als 20.000 bps sein.
  • Genauigkeit: Die Technologie hat eine höhere Fehlerrate bei einzelnen Lesevorgängen (circa 10-15%), aber durch Konsensus-Methoden können die Fehler stark reduziert werden.
  Alignment mit BLAST oder Bowtie:
  • BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): BLAST ist ein oft verwendetes Tool, um homologe Sequenzen zu finden. Durch das Eingeben der Abfragesequenz wird die Datenbank nach ähnlichen Sequenzen durchsucht. Dies geschieht durch heuristische Methoden, die schnelle und dennoch zuverlässige Ergebnisse liefern.
  • Bowtie: Bowtie ist ein schneller und speichereffizienter Sequenzierer für kurze Reads. Es wird besonders für die Alignment von Illumina Reads verwendet. Die Read-Sequenzen werden gegen ein Referenz-Genom ausgerichtet, um homologe Bereiche zu identifizieren.
  • Prozess für Alignment:
    • Vorbereitung: Datenbereinigung und Qualitätskontrolle der Sequenzen, z. B. durch Trimmen von Adapter-Sequenzen und Entfernen von schlechten Qualität Reads.
    • Index-Erstellung: Für Bowtie muss ein Index des Referenzgenoms erstellt werden. Dies ermöglicht schnelle Zugriffe während des Alignments.
    • Ausführung des Alignments: Die gereinigten Sequenzen werden mit dem Tool (BLAST oder Bowtie) gegen das Referenzgenom ausgerichtet.
    • Analyse der Ergebnisse: Die Ausrichtungsdateien werden analysiert, um homologe Sequenzen und mögliche genetische Variationen zu identifizieren. Die Ausgabeformate wie SAM/BAM werden weiter analysiert, z. B. mit SAMtools.

b)

• Variant Calling: Wie würdest Du SAMtools und GATK verwenden, um SNPs und Indels in den Reihenfolge-Daten zu identifizieren? Erkläre die einzelnen Schritte dieses Prozesses inklusive der Qualitätskontrolle.

Lösung:

• Variant Calling: Um SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) und Indels (Insertionen und Deletionen) in den Reihenfolge-Daten zu identifizieren, kannst Du SAMtools und GATK verwenden. Hier ist eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte dieses Prozesses einschließlich der Qualitätskontrolle:

1. Qualitätskontrolle der Rohdaten: Bevor Du mit dem eigentlichen Prozess des Variant Callings beginnst, ist es wichtig, die Qualität der Rohsequenzdaten zu überprüfen und sicherzustellen, dass sie den erforderlichen Standards entsprechen. Dies kann mit Tools wie FastQC durchgeführt werden.

• Datenbereinigung: Entferne Adapter-Sequenzen und Sequenzen von niedriger Qualität. Tools wie Trimmomatic oder Cutadapt können für diese Aufgabe verwendet werden.
• Überprüfung der Datenqualität: Nutze FastQC, um Berichte über Sequenzqualität, Basenverteilung und andere wichtige Metriken zu generieren.

2. Alignment der Sequenzen: Die bereinigten Sequenzen müssen gegen ein Referenzgenom ausgerichtet werden, um den Ursprung jeder Sequenz zu bestimmen. Dies kann mit einem Tool wie BWA (Burrows-Wheeler Aligner) oder Bowtie2 erledigt werden.

• Index-Erstellung: Erstelle einen Index des Referenzgenoms, um schnelle alignments zu ermöglichen.
• Alignment: Verwende zum Beispiel BWA-MEM für das Alignment der bereinigten Reads gegen das Referenzgenom.

3. Verarbeitung und Sortierung der alignierten Daten: Nach dem Alignment müssen die Daten verarbeitet und sortiert werden, bevor sie für das Variant Calling verwendet werden können.

• Konvertierung zu BAM-Format: Konvertiere die Resultate von SAM zu BAM (Binäres Format), da BAM-Dateien weniger Speicherplatz benötigen und schneller verarbeitet werden können.
• Sortierung: Sortiere die BAM-Dateien nach der Position der Reads im Referenzgenom. Dies kann mit SAMtools sort durchgeführt werden.
• Markieren duplizierter Reads: Markiere PCR-Duplikate, um Fehlvarianten zu vermeiden. Tools wie Picard können hierbei nützlich sein (Picard MarkDuplicates).
• Indizieren: Indiziere die BAM-Dateien, um schnellen Zugriff auf die Daten zu ermöglichen (SAMtools index).

4. Variant Calling mit SAMtools: SAMtools kann verwendet werden, um SNPs und Indels in den sortierten und indizierten BAM-Dateien zu identifizieren.

• Erzeugung der mpileup-Datei: Verwende SAMtools mpileup, um eine mpileup-Datei zu erzeugen, die Informationen über jede Position im Referenzgenom enthält.
• Variant Calling: Verwende bcftools call, um Varianten aus der mpileup-Datei zu identifizieren und eine VCF-Datei (Variant Call Format) zu erzeugen.

5. Variant Calling mit GATK: GATK (Genome Analysis Toolkit) bietet eine umfassendere Lösung für das Variant Calling. Hier sind die Schritte:

• HaplotypeCaller: Verwende GATK HaplotypeCaller für das Variant Calling, um eine GVCF-Datei (Genomic VCF) zu erzeugen.
• GenotypeGVCFs: Kombiniere mehrere GVCF-Dateien (falls vorhanden) und erzeuge eine endgültige VCF-Datei mit GATK GenotypeGVCFs.

6. Nachbearbeitung und Qualitätssicherung: Nachdem die Varianten identifiziert wurden, müssen sie weiter gefiltert und validiert werden.

• Variant Filtration: Verwende Filter wie Qualität der Leseabdeckung, Mapping-Qualität, etc., um Fehlvarianten zu entfernen (GATK VariantFiltration und bcftools filter).
• Anmerkung der Varianten: Kommentiere die Varianten mit Tools wie ANNOVAR oder SnpEff, um ihre mögliche funktionelle Bedeutung zu verstehen.

Durch sorgfältige Durchführung dieser Schritte gewährleistest Du eine hohe Qualität und Zuverlässigkeit der identifizierten SNPs und Indels.

Aufgabe 3)

Erkläre die Mechanismen der Signaltransduktion, second messengers und Proteinmodifikation, und diskutiere deren Rolle in der zellulären Signalverarbeitung.

a)

Beschreibe ausführlich die Rolle von second messengers in der Signaltransduktion. Nenne mindestens zwei Beispiele von second messengers und erkläre, wie sie zur Signalverstärkung und -übertragung in der Zelle beitragen. Welche Vorteile bietet die Verwendung von second messengers gegenüber einer direkten Signalübertragung?

Lösung:

Die Rolle von Second Messengers in der Signaltransduktion

Second Messenger spielen eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion, indem sie Signale, die durch extrazelluläre Moleküle (Primärsignale) an Zellmembranen oder innerhalb der Zelle ausgelöst werden, verstärken und weiterleiten. Durch die Vermittlung dieser Signale ermöglichen sie eine koordinierte und effiziente zelluläre Antwort auf verschiedene Reize. Hier sind die wichtigsten Mechanismen und Vorteile von Second Messengers sowie zwei Beispiele:

1. Funktion von Second Messengers

• Signalverstärkung: Second Messenger verstärken das ursprüngliche Signal. Ein einzelnes Molekül des Primärsignals kann zur Produktion vieler Moleküle des Second Messengers führen, was eine starke zelluläre Antwort auslöst. Dies sorgt dafür, dass auch schwache Signale eine signifikante Reaktion hervorrufen können.
• Signalweiterleitung: Second Messenger tragen das Signal von der Zellmembran ins Zellinnere, indem sie an verschiedene Effektorproteine binden und deren Aktivität modulieren. Dies führt zu einer Kaskade biochemischer Reaktionen innerhalb der Zelle.

2. Beispiele von Second Messengers

• cAMP (zyklisches Adenosinmonophosphat): cAMP wird durch das Enzym Adenylatzyklase aus ATP erzeugt, wenn ein Hormon oder ein anderes Signal die Zellmembran erreicht. cAMP aktiviert Proteinkinase A (PKA), welche verschiedene Zielproteine innerhalb der Zelle phosphoryliert und deren Aktivität verändert. Dies kann zahlreiche zelluläre Prozesse wie den Glykogenabbau und die Genexpression beeinflussen.
• Ca²⁺-Ionen: Ca²⁺ fungiert als Second Messenger in vielen Signalwegen. Bei der Aktivierung durch ein Signal kann Ca²⁺ aus internen Speichern wie dem Endoplasmatischen Retikulum freigesetzt werden. Die erhöhte Konzentration von Ca²⁺ aktiviert Calmodulin und andere Ca²⁺-abhängige Proteine, welche diverse Zellprozesse regulieren, einschließlich Muskelkontraktion, Sekretion und Stoffwechsel.

3. Vorteile von Second Messengers

• Signalverstärkung: Durch die Produktion einer großen Anzahl von Second Messenger-Molekülen aus einer kleinen Anzahl von Primärsignal-Molekülen wird das Signal stark verstärkt.
• Flexibilität: Second Messenger können eine Vielzahl von zellulären Effekten beeinflussen, da sie auf verschiedene Effektorproteine wirken können.
• Integration und Koordination: Verschiedene Second Messenger können miteinander interagieren und die Signalantworten miteinander verknüpfen. Dies ermöglicht eine koordinierte Zellantwort auf komplexe Signale und Umweltbedingungen.

Insgesamt bieten Second Messenger somit eine komplexere und effektivere Methode der Signalübertragung und -verstärkung im Vergleich zu direkten Signalwegen. Sie ermöglichen es der Zelle, auf unterschiedliche Umwelteinflüsse abgestimmt und abgestufte Reaktionen auszuführen.

b)

Proteinkinasen und Phosphatasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion. Wähle ein spezifisches Beispielszenario, in dem eine Proteinkinase in einer Signaltransduktionskaskade involviert ist. Erkläre den Mechanismus der Phosphorylierung und diskutiere, wie eine Dysregulation dieser Prozesse zu Krankheiten führen kann, wie zum Beispiel Krebs.

Lösung:

Die Rolle von Proteinkinasen und Phosphatasen in der Signaltransduktion

Proteinkinasen und Phosphatasen sind Schlüsselregulatoren in der Signaltransduktion. Sie modulieren die Aktivität von Proteinen durch Hinzufügen oder Entfernen von Phosphatgruppen. Dies führt zu Änderungen in der Struktur und Funktion der Zielproteine und beeinflusst zahlreiche zelluläre Prozesse. Ein bedeutendes Beispiel für eine Signaltransduktionskaskade, in der Proteinkinasen eine zentrale Rolle spielen, ist der MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase)-Weg.

1. Beispiel: Der MAPK-Weg

• Auslösender Faktor: Ein Wachstumsfaktor, wie zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), bindet an seinen Rezeptor (EGFR) auf der Zellmembran.
• Rezeptoraktivierung: Die Bindung des Wachstumsfaktors führt zur Dimerisierung und Autophosphorylierung des EGFR.
• Aktivierung der Kaskade: Der aktivierte EGFR rekrutiert und aktiviert GTPase Ras, welche wiederum RAF (eine Serin/Threonin-Proteinkinase) aktiviert.
• Kaskadenfortführung: RAF phosphoryliert und aktiviert MEK (eine duale Spezifität-Kinase), welche dann ERK (extrazellulär signalregulierte Kinase) phosphoryliert und aktiviert.
• Zelluläre Reaktionen: Aktiviertes ERK transloziert in den Zellkern und phosphoryliert Transkriptionsfaktoren, die Genexpression und Zellproliferation regulieren.

2. Mechanismus der Phosphorylierung

• Phosphorylierungsprozess: Proteinkinasen übertragen eine Phosphatgruppe von ATP auf eine spezifische Aminosäure (Serin, Threonin oder Tyrosin) eines Zielproteins.
• Funktionelle Änderungen: Die Anheftung einer Phosphatgruppe kann die Konformation, Aktivität, Lokalisierung oder Wechselwirkungen des Zielproteins verändern und damit bestimmte Signalwege aktivieren oder deaktivieren.
• Regulation durch Phosphatasen: Phosphatasen entfernen spezifisch Phosphatgruppen von Proteinen, wodurch die Signalprozesse wieder abgeschaltet werden können.

3. Dysregulation und Krankheiten

Fehlregulationen in der Phosphorylierung können zu schwerwiegenden Krankheiten führen, einschließlich Krebs:

• Überaktivierung von Kinasen: Mutationen oder Überexpression von Proteinkinasen wie EGFR oder Ras können zu einer konstanten Signalweiterleitung und unkontrollierten Zellproliferation führen. Dies ist häufig in verschiedenen Krebsarten zu beobachten.
• Fehlfunktion von Phosphatasen: Inaktive oder supprimierte Phosphatasen, wie zum Beispiel PTEN, verhindern die Deaktivierung von Signalwegen und tragen zur Tumorentwicklung bei.
• Therapeutische Ansätze: Kinase-Inhibitoren werden entwickelt, um die Hyperaktivität von Kinasen zu unterdrücken und somit das Tumorwachstum zu kontrollieren.

Zusammenfassend spielen Proteinkinasen und Phosphatasen eine zentrale Rolle in der Regulation zellulärer Funktionen durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Dysregulationen dieser Prozesse können zu Krankheiten wie Krebs führen, was die Relevanz dieser Enzyme als therapeutische Ziele unterstreicht.

Aufgabe 4)

Der Zellzyklus ist ein streng regulierter Prozess, der in mehreren Hauptphasen (G1, S, G2, Mitose) abläuft. Verschiedene Kontrollpunkte (G1/S, G2/M, Spindelkontrollpunkt) stellen sicher, dass jede Phase korrekt durchlaufen wird, bevor die Zelle in die nächste übergeht. Diese Kontrollpunkte verhindern Fehler wie DNA-Schäden oder fehlerhafte Zellteilung. Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) sind zentrale Proteine in dieser Regulation. Phosphorylierung und Dephosphorylierung spielen ebenfalls eine Schlüsselfunktion. Weiterhin gibt es CDK-Inhibitoren (CKIs), die das Fortschreiten des Zellzyklus kontrollieren.

a)

a) Beschreibe die Rolle der G1/S-Kontrollpunkte im Zellzyklus. Welche Hauptmechanismen verhindern das Weitergehen zum S-Phase bei einer Beschädigung der DNA?

Lösung:

a) Die G1/S-Kontrollpunkte spielen eine zentrale Rolle im Zellzyklus, indem sie sicherstellen, dass die Zelle bereit ist, zur S-Phase überzugehen. Zu diesem Zeitpunkt entscheidet die Zelle, ob sie sich teilen soll oder ob sie in den Ruhezustand (G0) übergeht. Ein wichtiges Kriterium ist, ob die DNA unbeschädigt ist und die Zelle die notwendige Größe sowie das benötigte Umfeld hat.

• Überprüfung der DNA-Integrität: Wenn DNA-Schäden vorhanden sind, aktivieren Sensorproteine wie ATM und ATR eine Signalkaskade, die letztendlich zur Aktivierung des Tumorsuppressor-Proteins p53 führt.
• p53-Mechanismus: p53 kann die Transkription des CDK-Inhibitors p21 hochregulieren. p21 bindet an und inhibiert Cyclin/CDK-Komplexe und verhindert so ihren Fortschritt. Dies sorgt für eine Zellzyklus-Arrest, was der Zelle Zeit gibt, die Schäden zu reparieren.
• Retinoblastom-Protein (Rb): Im G1-Phase ist das Rb-Protein hypophosphoryliert und bindet an den Transkriptionsfaktor E2F, wodurch die Expression von Genen, die für die DNA-Replikation benötigt werden, unterdrückt wird. Wenn Cyclin D1/CDK4- und Cyclin E/CDK2-Komplexe aktiv sind (sofern keine DNA-Schäden gestört werden), phosphorylieren sie Rb, wodurch E2F freigesetzt und die S-Phase initiiert wird. Bei DNA-Schäden wird diese Phosphorylierung durch p21 inhibiert.

So verhindern die G1/S-Kontrollpunkte durch p53, CKIs wie p21 und das Rb-Protein das Weitergehen zur S-Phase, bis die DNA-Schäden behoben sind. Diese Mechanismen gewährleisten die Integrität des Zellzyklus und schützen vor potenziellen Mutationen und Krebsbildung.

b)

b) Erkläre, wie Cycline und Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) den Übergang von der G2-Phase zur Mitose steuern. Welche spezifischen molekularen Interaktionen sind beteiligt?

Lösung:

b) Der Übergang von der G2-Phase zur Mitose im Zellzyklus wird durch ein komplexes Zusammenspiel von Cyclinen und Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) gesteuert. Insbesondere spielen Cyclin B und CDK1 (auch bekannt als Cdc2) eine zentrale Rolle in diesem Prozess.

• Bildung des Cyclin B/CDK1-Komplexes: In der G2-Phase akkumuliert Cyclin B und bindet an CDK1. Diese Bindung ist notwendig für die Aktivierung des CDK1.
• Vorläufige Inaktivierung durch Phosphorylierung: Initial wird der Cyclin B/CDK1-Komplex durch zwei Phosphorylierungen an den Threonin-14 (Thr14) und Tyrosin-15 (Tyr15) Resten im CDK1 inaktiviert. Diese Phosphorylierungen werden von den Kinasen Wee1 und Myt1 durchgeführt.
• Aktivierung durch Dephosphorylierung: Die Aktivierung des Cyclin B/CDK1-Komplexes erfolgt durch die Protein-Phosphatase Cdc25, die die inhibitorischen Phosphatgruppen an Thr14 und Tyr15 entfernt. Die Aktivität von Cdc25 wird wiederum durch eine positive Rückkopplungsschleife verstärkt, da der aktive Cyclin B/CDK1-Komplex Cdc25 selbst phosphoryliert und aktiviert.
• Positive Rückkopplungsschleifen: Neben der Aktivierung von Cdc25 phosphoryliert und inaktiviert der aktive Cyclin B/CDK1-Komplex die Kinasen Wee1 und Myt1, was weitere Inaktivierungen des Komplexes verhindert. Diese Rückkopplungsschleifen sorgen für einen abrupten und irreversiblen Übergang zur Mitose.
• Phosphorylierung von Zielproteinen: Der aktive Cyclin B/CDK1-Komplex phosphoryliert verschiedene Zielproteine, die für den Mitose-Eintritt und die Durchführung der Mitose notwendig sind, darunter Proteine, die den Abbau der Kernhülle, die Kondensation der Chromosomen und die Bildung des Spindelapparats steuern.

Durch diese spezifischen molekularen Interaktionen und Rückkopplungsschleifen wird ein koordinierter und kontrollierter Übergang von der G2-Phase zur Mitose gewährleistet. Somit spielen Cycline und CDKs eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Zellzyklus und der Sicherstellung der Zellteilung.

c)

c) Zeichne ein Flussdiagramm, das die zyklische Beziehung zwischen Cyclinen, CDKs, und deren Inhibitoren (CKIs) im Zellzyklus zeigt. Vermerke die Schritte, bei denen Phosphorylierung und Dephosphorylierung wichtig sind.

Lösung:

c) Hier ist ein Flussdiagramm, das die zyklische Beziehung zwischen Cyclinen, CDKs und deren Inhibitoren (CKIs) im Zellzyklus darstellt. Die Schritte der Phosphorylierung und Dephosphorylierung sind ebenfalls vermerkt.

• G1-Phase
  • Cyclin D/Cdk4,6-Komplex
  • Phosphorylierung von Rb-Protein
  • Freisetzung von E2F-Transkriptionsfaktor
  • Expression von S-Phase-Genen
• G1/S-Übergang
  • Überprüfung der DNA-Integrität
  • Aktivierung von p53 bei Schäden
  • p21 (CKI) hemmt Cyclin E/Cdk2
• S-Phase
  • Cyclin A/Cdk2-Komplex
  • DNA-Replikation
• G2-Phase
  • Cyclin A/Cdk1-Komplex
• G2/M-Übergang
  • Cyclin B/Cdk1-Komplex (MPF)
  • Inhibitorische Phosphorylierung an Thr15 und Tyr15
  • Aktivierung durch Dephosphorylierung durch Cdc25
  • Phosphorylierung von Mitose-Proteinen
• Mitose
  • Zellteilung
• CKIs
  • p21, Hemmung von Cyclin E/Cdk2
  • p27, Hemmung von Cyclin A/Cdk2
  • Bindung und Inaktivierung der Cyclin/CDK-Komplexe

Dieses Diagramm verdeutlicht, wie Cyclin/CDK-Komplexe durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung aktiviert und deaktiviert werden, und wie CKIs durch Bindung an diese Komplexe das Fortschreiten im Zellzyklus regulieren.

d)

d) Angenommen, die Konzentration eines bestimmten Cyclin-Proteins in der G1-Phase folgt der Funktion:

 f(t) = e^{0.1t} - 1 

wobei t in Stunden angegeben ist. Berechne, nach wie vielen Stunden die Konzentration des Cyclins 10 Einheiten erreicht, und interpretiere die biologische Bedeutung deines Ergebnisses.

Lösung:

d) Angenommen, die Konzentration eines bestimmten Cyclin-Proteins in der G1-Phase folgt der Funktion:

 f(t) = e^{0.1t} - 1 

wobei t in Stunden angegeben ist. Berechne, nach wie vielen Stunden die Konzentration des Cyclins 10 Einheiten erreicht, und interpretiere die biologische Bedeutung deines Ergebnisses.

Um zu bestimmen, nach wie vielen Stunden die Konzentration des Cyclin-Proteins 10 Einheiten erreicht, setzen wir die gegebene Funktion gleich 10:

 e^{0.1t} - 1 = 10 

Schritte der Berechnung:

• 1. Addiere 1 zu beiden Seiten der Gleichung:

 e^{0.1t} = 11 

2. Wende den natürlichen Logarithmus (ln) auf beide Seiten an, um die Exponentialfunktion zu eliminieren:

 \ln(e^{0.1t}) = \ln(11) 

3. Da \ln(e^{x}) = x, vereinfacht sich die Gleichung zu:

 0.1t = \ln(11) 

4. Teile beide Seiten durch 0.1, um t zu isolieren:

 t = \frac{\ln(11)}{0.1} = \frac{2.3979}{0.1} \approx 23.98 

Nach ca. 23.98 Stunden erreicht die Konzentration des Cyclins 10 Einheiten.

Biologische Bedeutung: Der Wert von t gibt die Zeit an, die benötigt wird, damit die Cyclin-Konzentration während der G1-Phase ein bestimmtes Niveau erreicht. Diese Konzentrationsstufe spielt möglicherweise eine entscheidende Rolle bei der Progression des Zellzyklus an den G1/S-Kontrollpunkt. Diese Schwelle ist entscheidend, da sie bestimmt, ob die Zelle in die DNA-Synthese (S-Phase) übergeht. Der Übergang zur S-Phase ist ein kritischer Schritt, da die Zelle sicherstellen muss, dass alle Voraussetzungen erfüllt sind, um DNA-Schäden zu vermeiden und die Zellteilung korrekt durchzuführen.