External Modules, Laboratory Research Modules - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest in einem molekularbiologischen Forschungslabor und möchtest mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine spezifische DNA-Sequenz vervielfältigen. Beschreibe die wesentlichen Schritte der PCR und die benötigten Komponenten, sowie mögliche Herausforderungen, die bei der Durchführung einer PCR auftreten können.

a)

Erkläre die einzelnen Schritte der PCR: Denaturierung, Annealing und Elongation. Nenne dabei die typische Dauer und Temperatur für jeden dieser Zyklen und erläutere die Rolle eines Thermocyclers in diesem Prozess.

Lösung:

Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Schritte und Thermocycler

• Denaturierung:Die erste Phase der PCR besteht aus der Denaturierung der doppelsträngigen DNA. Hierbei wird die DNA erhitzt, um die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren zu brechen und die beiden Stränge zu trennen.
  • Typische Dauer: 20-30 Sekunden
  • Typische Temperatur: 94-98°C
  • Rolle: Die Denaturierung ermöglicht es den Primern, an die Einzelstränge zu binden.
• Annealing:In der zweiten Phase kühlt man die Temperatur ab, damit die Primer an die komplementären Stellen auf den Einzelsträngen binden können.
  • Typische Dauer: 20-40 Sekunden
  • Typische Temperatur: 50-65°C (abhängig von der Primersequenz)
  • Rolle: Die Annealing Phase ist wichtig, damit die Primer an die spezifischen Bereiche der DNA binden, die amplifiziert werden sollen.
• Elongation:In der letzten Phase wird die Temperatur auf das optimale Niveau für die DNA-Polymerase (meist Taq-Polymerase) erhöht, damit die Synthese des neuen DNA-Strangs erfolgen kann.
  • Typische Dauer: 1 Minute pro 1.000 Basenpaare
  • Typische Temperatur: 72°C (abhängig von der verwendeten Polymerase)
  • Rolle: In dieser Phase fügt die DNA-Polymerase Nukleotide zum 3'-Ende des Primers hinzu und synthetisiert den neuen komplementären DNA-Strang.

Der Thermocycler

• Rolle eines Thermocyclers:Ein Thermocycler ist ein Gerät, das die Temperaturzyklen der PCR automatisch steuert. Es ermöglicht die präzise Steuerung der Temperaturwechsel, die für die drei Phasen notwendig sind, und gewährleistet eine gleichmäßige Erhitzung und Abkühlung der Proben.
  • Funktion: Automatisches Durchlaufen der Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsphasen.

Mögliche Herausforderungen

• Unspezifische Bindung: Primer können unspezifisch an nicht-target Bereiche der DNA binden, was zu unerwünschten Amplifikationsprodukten führt.
• Enzym-Inaktivierung: Zu hohe oder zu lange Temperaturen können die DNA-Polymerase inaktivieren.
• Kontamination: Fremd-DNA kann eingeführt werden und die Ergebnisse verfälschen.

b)

Diskutiere die Rolle der Primer in der PCR. Wie würdest Du optimale Primer für Deine Ziel-DNA-Sequenz designen? Berücksichtige dabei Aspekte wie Schmelztemperatur (Tm), GC-Gehalt und Länge der Primer. Berechne die Schmelztemperatur eines Primers mit der Sequenz 5’-AGCTGACCTG-3’, wobei eine einfache Tm-Berechnungsformel \( T_m = 2(A + T) + 4(G + C) \) verwendet wird.

Lösung:

Die Rolle der Primer in der PCR

• Rolle der Primer:Primer sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Sequenzen, die komplementär zu den Zielbereichen auf der DNA sind. Sie sind essentiell für die PCR, weil sie der DNA-Polymerase einen Startpunkt für die DNA-Synthese bieten. Zwei Primer werden verwendet: ein Forward-Primer und ein Reverse-Primer, die an den jeweils gegenläufigen Strängen der DNA binden.

Design von optimalen Primern

• Beim Designen von Primern müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden:
• Schmelztemperatur (Tm):Die Schmelztemperatur ist die Temperatur, bei der die Hälfte der Primer mit der DNA gepaart sind. Optimal sollten die Tm-Werte der beiden Primer (Forward und Reverse) ähnlich sein, idealerweise zwischen 50-60°C.
  • Formel für die Berechnung der Tm: \[ T_m = 2(A + T) + 4(G + C) \]
• GC-Gehalt:Der GC-Gehalt der Primer sollte zwischen 40-60% liegen, um stabile Bindung bei den Reaktionstemperaturen zu gewährleisten.
• Länge der Primer:Typischerweise sollten Primer eine Länge von 18-25 Basen haben. Zu kurze Primer können unspezifische Bindungen verursachen, während zu lange Primer ineffizient und teuer sind.

Berechnung der Schmelztemperatur eines Primers

• Gegebene Primersequenz: 5’-AGCTGACCTG-3’
• Schritte zur Berechnung der Tm:
  • Zähle die Anzahl der A-, T-, G- und C-Basen in der Sequenz:
  • A=1
  • T=1
  • G=3
  • C=4
  • Verwende die einfache Tm-Formel:
  • \[T_m = 2(A + T) + 4(G + C) \]
  • Setze die Werte ein:
  • \[T_m = 2(1 + 1) + 4(3 + 4) = 2 \times 2 + 4 \times 7 = 4 + 28 = 32°C \]
• Die Schmelztemperatur (Tm) für den Primer 5’-AGCTGACCTG-3’ beträgt 32°C.

Aufgabe 2)

In einem vor kurzem veröffentlichten Artikel wurde eine Studie beschrieben, in der das CRISPR/Cas9-System zur Behandlung einer genetischen Erkrankung namens Mukoviszidose (Cystische Fibrose) verwendet wurde. Die Forscher nutzten eine spezifische gRNA (guide RNA) zur Korrektur der Mutation im CFTR-Gen, die für die Erkrankung verantwortlich ist. Sie führten die Gentherapie sowohl ex vivo als auch in vivo durch, wobei ex vivo modifizierte Zellen in den Patienten zurücktransplantiert wurden. Die Behandlung zeigte vielversprechende Ergebnisse, jedoch traten einige Herausforderungen und Bedenken bezüglich Off-target-Effekte und Immunantworten auf. Durch diese Fallstudie sollen die Folgenden Aspekte der CRISPR/Cas9-Technologie erläutert und untersucht werden.

a)

Beschreibe den grundlegenden Mechanismus, wie CRISPR/Cas9 zur gezielten Veränderung von DNA-Sequenzen verwendet wird. Besonderes Augenmerk sollte auf die Funktion der gRNA und des Cas9-Proteins gelegt werden.

Lösung:

Grundlegender Mechanismus, wie CRISPR/Cas9 zur gezielten Veränderung von DNA-Sequenzen verwendet wird:

• CRISPR/Cas9-System: Das CRISPR/Cas9-System stammt ursprünglich aus Bakterien, wo es als Abwehrmechanismus gegen virale DNA dient. Es besteht aus zwei Hauptkomponenten: der gRNA (guide RNA) und dem Cas9-Protein.
• Funktion der gRNA: Die gRNA ist eine kurze, synthetisch hergestellte RNA-Sequenz, die aus zwei Teilen besteht: dem CRISPR-RNA (crRNA) und dem trans-aktivierenden CRISPR-RNA (tracrRNA). Diese vereinigen sich zu einer einzigen, funktionsfähigen gRNA. Sie hat zwei wichtige Aufgaben:
  • Die crRNA-Komponente erkennt und bindet an eine komplementäre Ziel-DNA-Sequenz im Genom.
  • Die tracrRNA sorgt dafür, dass die gRNA eine stabile Struktur beibehält und leitet die Bindung der gRNA an das Cas9-Protein ein.
• Funktion des Cas9-Proteins: Das Cas9-Protein ist eine Endonuklease, die spezifisch an die gRNA bindet. Die Hauptaufgaben von Cas9 sind:
  • Die Bindung an die gRNA und Bildung eines aktiven Komplexes.
  • Das Cas9-gRNA-Komplex sucht die Ziel-DNA-Sequenz im Genom. Wenn die gRNA die komplementäre Sequenz in der DNA erkennt, bindet der Komplex daran.
  • Cas9 schneidet anschließend beide Stränge der Ziel-DNA an einer spezifischen Stelle, die direkt neben einer kurzen Einspeichersequenz, dem sogenannten PAM (protospacer adjacent motif), liegt.
• Reparaturmechanismus: Nach dem Schneiden der DNA durch Cas9 muss die Zelle die entstandene Doppelstrangbruch reparieren. Dies kann auf zwei Weisen geschehen:
  • Non-Homologous End Joining (NHEJ): Dies ist ein schneller, aber fehleranfälliger Reparaturmechanismus, bei dem die beiden Enden der geschnittenen DNA einfach wieder verbunden werden. Dies kann zu Insertionen oder Deletionen (Indels) führen, die das Gen deaktivieren können.
  • Homology-Directed Repair (HDR): Ein präziserer Mechanismus, der eine homologe DNA-Vorlage benötigt. Diese Vorlage kann eine künstlich eingeführte DNA-Sequenz sein, die als Schablone dient, um die gewünschte Sequenz korrekt einzufügen.
• Bedeutung der gRNA und Cas9 in der Gentherapie: Durch die gezielte Bindung der gRNA und die präzise Schneidfunktion des Cas9-Proteins kann eine spezifische Mutation im Genom korrigiert oder eine neue Sequenz eingeführt werden. Dies macht CRISPR/Cas9 zu einem leistungsfähigen Werkzeug in der Gentherapie, um Krankheiten wie Mukoviszidose zu behandeln.

b)

Erkläre die Unterschiede zwischen ex vivo und in vivo Anwendungen der CRISPR/Cas9-Technologie und diskutiere die Vor- und Nachteile beider Ansätze in Bezug auf die Behandlung von Mukoviszidose.

Lösung:

Unterschiede zwischen ex vivo und in vivo Anwendungen der CRISPR/Cas9-Technologie:

• Ex vivo Anwendung: Bei der ex vivo Methode werden die zu behandelnden Zellen zuerst aus dem Körper des Patienten entnommen. Diese Zellen werden dann im Labor mit der CRISPR/Cas9-Technologie behandelt, um die gewünschte genetische Modifikation durchzuführen. Die modifizierten Zellen werden anschließend zurück in den Patienten transplantiert.
• In vivo Anwendung: Bei der in vivo Methode wird die CRISPR/Cas9-Komponente direkt in den Körper des Patienten eingeführt. Dies geschieht durch verschiedene Methoden wie Injektionen oder Vecotorsysteme (z. B. virale Vektoren), die die CRISPR/Cas9-Komponenten in die Zielzellen liefern.

Vor- und Nachteile beider Ansätze in Bezug auf die Behandlung von Mukoviszidose:

• Ex vivo Ansatz:
  • Vorteile:
    • Höhere Kontrolle und Präzision:
    Im Labor können die Zellen genau überwacht und getestet werden, um sicherzustellen, dass die genetische Modifikation erfolgreich ist, bevor sie zurück in den Patienten transplantiert werden.
  • Weniger Risiko von Immunantworten:
  Da die Zellen außerhalb des Körpers manipuliert werden, gibt es ein geringeres Risiko, dass das Immunsystem des Patienten gegen die CRISPR/Cas9-Komponenten reagiert.
• Reduziertes Off-Target Risiko:
Durch die genaue Kontrolle im Labor können Off-Target-Effekte minimiert werden.

Nachteile:

• Invasivität:
Der Prozess erfordert die Entnahme von Zellen vom Patienten und eine Transplantation zurück in den Patienten, was invasiver ist.

Komplexität und Kosten:

Ex vivo Behandlungen sind oft komplexer und teurer, da sie spezielle Laboreinrichtungen und Expertise erfordern.

In vivo Ansatz:

• Vorteile:
  • Weniger invasiv:
  Es ist weniger invasiv, da die CRISPR/Cas9-Komponenten direkt in den Körper des Patienten eingeführt werden können.
• Einfacher und schneller:
Der Prozess ist im Allgemeinen einfacher und schneller, da keine Zellkultur und anschließende Rücktransplantation erforderlich ist.

Nachteile:

• Höheres Risiko von Immunantworten:
Das Immunsystem des Patienten könnte auf die eingeführten CRISPR/Cas9-Komponenten reagieren.

Geringere Kontrolle:

Es gibt weniger Kontrolle über den genauen Ort und die Präzision der genetischen Modifikation, was das Risiko von Off-Target-Effekten erhöht.

Schwierigkeiten der Verabreichung:

Die effektive Abgabe der CRISPR/Cas9-Komponenten an die Zielzellen kann eine Herausforderung darstellen, besonders in schwer zugänglichen Geweben.

c)

Berechne unter der Annahme, dass die Erfolgsrate der gRNA im Ziel-DNA-Bindungsprozess bei 75% liegt und dass Cas9 in 90% der Fälle einen erfolgreichen Schnitt durchführt, die Gesamterfolgsrate der Behandlung. Zeige alle Schritte deiner Berechnung.

Lösung:

Berechnung der Gesamterfolgsrate der Behandlung:

Um die Gesamterfolgsrate der Behandlung zu berechnen, müssen wir die Wahrscheinlichkeit berücksichtigen, dass sowohl die gRNA erfolgreich an die Ziel-DNA bindet als auch das Cas9-Protein einen erfolgreichen Schnitt durchführt.

• Erfolgsrate der gRNA im Ziel-DNA-Bindungsprozess: 75% oder 0.75
• Erfolgsrate des Cas9-Proteins beim Schneiden der DNA: 90% oder 0.90

Da beide Ereignisse unabhängig voneinander sind, multiplizieren wir die beiden Wahrscheinlichkeiten, um die Gesamterfolgsrate zu erhalten:

Gesamterfolgsrate = Erfolgsrate der gRNA × Erfolgsrate des Cas9-Proteins

• Gesamterfolgsrate = 0.75 × 0.90

Nun führen wir die Multiplikation durch:

• Gesamterfolgsrate = 0.75 × 0.90 = 0.675

Daher beträgt die Gesamterfolgsrate der Behandlung 67.5%.

Zusammengefasst:

• Die Wahrscheinlichkeit, dass die gRNA erfolgreich bindet, beträgt 75%.
• Die Wahrscheinlichkeit, dass das Cas9-Protein erfolgreich schneidet, beträgt 90%.
• Die kombinierte Erfolgsrate der Behandlung beträgt somit 67.5%.

d)

Diskutiere ethische und sicherheitsrelevante Fragen, die mit der Anwendung von CRISPR/Cas9 in der Gentherapie verbunden sind, insbesondere in Bezug auf Off-target-Effekte und mögliche Immunantworten. Wie könnten Wissenschaftler diese Herausforderungen in zukünftigen Studien adressieren?

Lösung:

Ethische und sicherheitsrelevante Fragen bei der Anwendung von CRISPR/Cas9 in der Gentherapie:

• Off-target-Effekte: Off-target-Effekte treten auf, wenn CRISPR/Cas9 nicht nur die gewünschte Zielsequenz, sondern auch andere ungeplante Stellen im Genom schneidet. Dies kann zu unerwünschten Mutationen und potenziellen gesundheitlichen Problemen führen.
• Ethische Bedenken: Das Risiko unvorhersehbarer genetischer Veränderungen kann langfristige gesundheitliche Folgen haben, die derzeit nicht vollständig verstanden sind. Dies wirft die Frage auf, ob es vertretbar ist, solche Eingriffe durchzuführen, insbesondere wenn die Risiken nicht vollständig quantifizierbar sind.
• Sicherheitsbedenken: Ungeplante Mutationen könnten potenziell zu neuen Krankheiten führen oder bestehende verschlimmern, was die Sicherheit des Patienten gefährdet.
• Mögliche Immunantworten: Das menschliche Immunsystem kann auf die eingeführten CRISPR/Cas9-Komponenten reagieren, insbesondere auf das bakterielle Cas9-Protein. Dies kann zu Entzündungen oder gar einer vollständigen Immunreaktion führen, die die Therapie unwirksam macht oder gesundheitliche Schäden verursacht.
• Ethische Bedenken: Die Immunantwort könnte unvorhersehbare und schwerwiegende Nebenwirkungen haben, die das Wohl des Patienten gefährden.
• Sicherheitsbedenken: Eine starke Immunreaktion könnte den Erfolg der Therapie verhindern und möglicherweise lebensbedrohliche Zustände hervorrufen.

Wie könnten Wissenschaftler diese Herausforderungen in zukünftigen Studien addressieren:

• Verbesserte Spezifität der gRNA: Durch die Entwicklung fortschrittlicherer Designtechniken für gRNA könnten Wissenschaftler die Spezifität der gRNA erhöhen und das Risiko von Off-target-Effekten reduzieren.
• Erweiterte Screening-Methoden: Durch umfassende genomweite Screening-Techniken nach der CRISPR/Cas9-Behandlung können Wissenschaftler Off-target-Effekte frühzeitig identifizieren und adressieren.
• Modifikation des Cas9-Proteins: Die Entwicklung neuer Cas9-Varianten, die weniger immunogen und präziser sind, könnte das Risiko von Immunantworten und Off-target-Effekten minimieren.
• Lokalisierte Verabreichung: Die gezielte Verabreichung von CRISPR/Cas9 an spezifische Gewebe oder Zelltypen kann die Wahrscheinlichkeit von Off-target-Effekten und systemischen Immunantworten verringern.
• Langzeitstudien und Monitoring: Durch langfristige Studien und kontinuierliche Überwachung der Patienten können unerwünschte Effekte frühzeitig erkannt und behandelt werden.
• Ethische Rahmenbedingungen: Eine klare ethische Richtlinie und der informierte Konsens der Patienten sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die Risiken und Vorteile der Behandlung umfassend verstanden und akzeptiert werden.

Aufgabe 3)

Pharmakogenetik und personalisierte MedizinUntersucht genetische Variationen, um die Reaktion auf Medikamente zu optimieren und individuelle Therapieansätze zu entwickeln.

• Genetische Variationen beeinflussen Medikamentenwirksamkeit und -verträglichkeit.
• Ziel: Verbesserung der Behandlungssicherheit und Wirksamkeit.
• Beispiele: CYP450-Enzyme, TPMT, HLA-B*5701.
• Methoden: genetische Tests, Bioinformatik.
• Einsatz: Onkologie, Psychiatrie, Kardiologie.

a)

Beschreibe, wie die genetische Variation des CYP2D6-Enzyms die Wirksamkeit des Medikaments Tamoxifen in der Behandlung von Brustkrebs beeinflusst.

Lösung:

Wie die genetische Variation des CYP2D6-Enzyms die Wirksamkeit des Medikaments Tamoxifen in der Behandlung von Brustkrebs beeinflusst:Das CYP2D6-Enzym ist für die Metabolisierung vieler Medikamente, einschließlich Tamoxifen, verantwortlich. Tamoxifen wird häufig zur Behandlung von Brustkrebs eingesetzt. Die genetische Variation im CYP2D6-Gen hat einen erheblichen Einfluss auf die Wirksamkeit von Tamoxifen.

• Metabolisierung von Tamoxifen: Tamoxifen ist ein Prodrug, das durch das CYP2D6-Enzym in seine aktive Form, Endoxifen, umgewandelt wird.
• Genetische Variationen: Es gibt mehrere Allele (Varianten) des CYP2D6-Gens, die die Enzymaktivität beeinflussen:
• Ultra-rapid Metabolizer (UM): Personen mit mehreren funktionellen Kopien des CYP2D6-Gens haben eine sehr hohe Enzymaktivität.
• Extensive Metabolizer (EM): Personen mit zwei funktionellen Kopien des CYP2D6-Gens haben eine normale Enzymaktivität.
• Intermediate Metabolizer (IM): Personen mit einer funktionellen und einer nicht-funktionellen Kopie des CYP2D6-Gens haben eine reduzierte Enzymaktivität.
• Poor Metabolizer (PM): Personen mit zwei nicht-funktionellen Kopien des CYP2D6-Gens haben eine sehr niedrige oder keine Enzymaktivität.

• Auswirkungen auf die Wirksamkeit:
• Ultra-rapid und Extensive Metabolizer: Diese Patienten haben in der Regel eine ausreichende Umwandlung von Tamoxifen in Endoxifen, was zu einer besseren therapeutischen Wirkung führt.
• Intermediate Metabolizer: Diese Patienten haben eine verringerte Umwandlung von Tamoxifen in Endoxifen, was möglicherweise zu einer geringeren Wirksamkeit des Medikaments führt.
• Poor Metabolizer: Diese Patienten können Tamoxifen nur sehr schlecht in Endoxifen umwandeln, was zu einer stark verringerten Wirksamkeit des Medikaments führt.

• Klinische Relevanz: Die Bestimmung des CYP2D6-Genotyps kann hilfreich sein, um die individuelle Wirksamkeit von Tamoxifen vorherzusagen und alternative Therapien in Betracht zu ziehen, insbesondere bei Patientinnen mit genetischen Varianten, die eine geringe Enzymaktivität aufweisen.

• Zusammenfassung: Genetische Variationen des CYP2D6-Enzyms beeinflussen maßgeblich die Fähigkeit des Körpers, Tamoxifen in seine aktive Form umzuwandeln, was die Wirksamkeit der Brustkrebsbehandlung beeinflusst. Daher kann ein genetischer Test auf CYP2D6-Varianten bei der personalisierten Therapieplanung von großem Nutzen sein.