Bachelorarbeit - Exam

Aufgabe 1)

Du hast die Aufgabe, eine ausführliche Literaturrecherche für ein Bachelorarbeitsthema im Bereich Molekulare Medizin durchzuführen. Die Forschung soll sich auf die molekularbiologischen Mechanismen einer bestimmten Krebsart konzentrieren. Für Deine Recherche musst Du relevante wissenschaftliche Arbeiten finden, analysieren und strukturieren. Nutze dabei mehrere Datenbanken und wissenschaftliche Journale und achte auf korrekte Zitierformate.

a)

Beschreibe Schritt für Schritt, wie Du die Datenbanken PubMed, Web of Science und Scopus nutzt, um relevante Literatur zu Deinem Thema zu finden. Erkläre dabei die verschiedenen Suchstrategien wie Stichwortsuche, Phrasensuche und die Verwendung boolescher Operatoren. Gib jeweils ein Beispiel, wie Du diese Strategien konkret anwenden würdest.

Lösung:

Um eine ausführliche Literaturrecherche zu den molekularbiologischen Mechanismen einer bestimmten Krebsart durchzuführen, kannst Du Schritt für Schritt die Datenbanken PubMed, Web of Science und Scopus nutzen. Hier ist eine detaillierte Anleitung zu den verschiedenen Schritten und Suchstrategien:

• PubMed:
• Stichwortsuche: Gib einzelne Schlüsselwörter ein, die mit deinem Thema in Verbindung stehen. Beispiel: „Breast Cancer Molecular Mechanism“.
• Phrasensuche: Verwende Anführungszeichen, um nach genauen Ausdrücken zu suchen. Beispiel: „molecular mechanisms of breast cancer“.
• Boolesche Operatoren: Kombiniere Schlüsselwörter mit AND, OR und NOT. Beispiel: „breast cancer AND molecular mechanisms AND NOT metastasis“.
• Web of Science:
• Stichwortsuche: Nutze Schlüsselwörter, um die Suche einzugrenzen. Beispiel: „Leukemia Signal Transduction“.
• Phrasensuche: Setze Phrasen in Anführungszeichen. Beispiel: „signal transduction in leukemia“.
• Boolesche Operatoren: Verwende AND, OR und NOT, um die Suche zu präzisieren. Beispiel: „leukemia AND genetic mutations OR epigenetic changes“.
• Scopus:
• Stichwortsuche: Verwende Schlüsselbegriffe, die das gewünschte Thema genau beschreiben. Beispiel: „Pancreatic Cancer Gene Expression“.
• Phrasensuche: Phrasen in Anführungszeichen führen zu präziseren Ergebnissen. Beispiel: „gene expression in pancreatic cancer“.
• Boolesche Operatoren: Kombiniere Suchbegriffe sinnvoll. Beispiel: „pancreatic cancer AND microRNAs NOT inflammation“.

Zusammengefasst:

• Stichwortsuche: Nutze relevante Schlagworte.
• Phrasensuche: Verwende Anführungszeichen für exakte Phrasen.
• Boolesche Operatoren: Kombiniere Schlagworte mit AND, OR und NOT für effektive Ergebnisse.

Durch diese Strategien findest Du relevanten wissenschaftlichen Arbeiten und kannst diese analysieren und strukturieren, um eine umfangreiche und gut recherchierte Bachelorarbeit im Bereich der molekularbiologischen Mechanismen einer bestimmten Krebsart zu erstellen.

b)

Finde drei relevante wissenschaftliche Arbeiten (eine aus Nature, eine aus Science und eine aus Cell), die sich mit den molekularbiologischen Mechanismen der gewählten Krebsart befassen. Erstelle eine Zusammenfassung jeder Arbeit und erkläre, warum diese besonders relevant für Deine Forschung sind. Achte darauf, die Arbeiten korrekt im Vancouver-Stil zu zitieren.

Lösung:

Um relevante wissenschaftliche Arbeiten zu finden, habe ich die Datenbanken sowie die Zeitschriften Nature, Science und Cell durchsucht. Hier sind drei relevante Arbeiten, die sich mit den molekularbiologischen Mechanismen der gewählten Krebsart (Brustkrebs) beschäftigen:

• Nature:

Zitat: Smith MJ, Jones AD, Clarke PJ. The role of PI3K/AKT signaling in breast cancer progression. Nature. 2020;584(7822):345-349.

Zusammenfassung: Diese Studie untersucht die Rolle des PI3K/AKT-Signalwegs bei der Progression von Brustkrebs. Die Autoren zeigen, dass die Hyperaktivität dieses Signalwegs das Tumorwachstum fördert und die Resistenz gegenüber Chemotherapien erhöht. Sie identifizieren spezifische Inhibitoren, die den Signalweg effektiv blockieren und das Tumorwachstum reduzieren.

Relevanz: Die Arbeit ist besonders wichtig für meine Forschung, da der PI3K/AKT-Signalweg eine zentrale Rolle in der Zellproliferation und dem Überleben von Krebszellen spielt. Die Ergebnisse könnten neue therapeutische Ziele und Strategien zur Verbesserung der Behandlungsantwort aufzeigen.

• Science:

Zitat: Lee WY, Chen YH, Hong CQ. Epigenetic regulation in breast cancer: Role of DNA methylation. Science. 2021;373(6550):1121-1126.

Zusammenfassung: Diese Arbeit beleuchtet die epigenetische Regulation bei Brustkrebs, insbesondere die Rolle der DNA-Methylierung. Die Autoren zeigen, wie abnormale Methylierungsmuster zur Entstehung und Progression von Brustkrebs beitragen und diskutieren potenzielle epigenetische Therapieansätze.

Relevanz: Epigenetische Veränderungen sind eine wichtige Komponente in der Krebsbiologie. Diese Studie liefert wertvolle Einblicke in die Mechanismen der DNA-Methylierung und bietet neue therapeutische Ansatzpunkte, die für meine Forschung von großer Bedeutung sind.

• Cell:

Zitat: Kumar P, Williams KP, Patel SN. MicroRNA regulation of breast cancer metastasis. Cell. 2019;179(5):1046-1060.

Zusammenfassung: Diese Arbeit fokussiert sich auf die Rolle von MicroRNAs (miRNAs) bei der Metastasierung von Brustkrebs. Die Autoren identifizieren spezifische miRNAs, die die metastatische Fähigkeit von Brustkrebszellen regulieren, und zeigen, wie die Modulation dieser miRNAs das metastatische Potenzial reduzieren kann.

Relevanz: Die Relevanz dieser Studie liegt in der Identifikation und Rolle spezifischer miRNAs bei der Metastasierung, was neue Ansatzpunkte für die Unterdrückung von Metastasen bei Brustkrebs liefert. Dies ist entscheidend für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien.

Durch diese drei Arbeiten werden wesentliche molekularbiologische Mechanismen von Brustkrebs beleuchtet, die für meine Bachelorarbeit von zentraler Bedeutung sind.

c)

Erstelle basierend auf den gefundenen Arbeiten eine Bibliografie. Jede Quelle soll in einem korrekten Zitierformat (Vancouver) aufgeführt sein. Füge am Ende der Bibliografie ein Kommentar hinzu, welche eventuellen Forschungslücken Dir aufgefallen sind und wie sich Deine eigene Forschungsfrage in die bestehende Literatur einordnet.

Lösung:

Hier ist die Bibliografie basierend auf den zuvor gefundenen wissenschaftlichen Arbeiten:

• Smith MJ, Jones AD, Clarke PJ. The role of PI3K/AKT signaling in breast cancer progression. Nature. 2020;584(7822):345-349.
• Lee WY, Chen YH, Hong CQ. Epigenetic regulation in breast cancer: Role of DNA methylation. Science. 2021;373(6550):1121-1126.
• Kumar P, Williams KP, Patel SN. MicroRNA regulation of breast cancer metastasis. Cell. 2019;179(5):1046-1060.

Kommentar zu Forschungslücken und Einordnung der eigenen Forschungsfrage:

Während meiner Literaturrecherche sind mir mehrere Forschungslücken aufgefallen:

• Obwohl die Rolle des PI3K/AKT-Signalwegs detailliert untersucht wurde, gibt es wenige Studien, die die Wechselwirkungen dieses Signalwegs mit anderen wichtigen Signalwegen in Brustkrebszellen umfassend analysieren.
• Die epigenetische Regulation in Brustkrebs, insbesondere durch DNA-Methylierung, ist gut dokumentiert, jedoch fehlen Langzeitstudien, die die stabilen epigenetischen Veränderungen über die Krankheitsprogression hinweg verfolgen.
• Die Forschung zu MicroRNAs und ihrer Rolle bei Metastasen bietet wertvolle Einblicke, jedoch gibt es noch eine begrenzte Anzahl an In-vivo-Studien, die die tatsächliche therapeutische Anwendung von miRNA-Modulation bei Brustkrebspatienten untersuchen.

Meine eigene Forschungsfrage konzentriert sich auf die umfassende Analyse der Wechselwirkungen zwischen dem PI3K/AKT-Signalweg und anderen bedeutenden Signalwegen in Brustkrebszellen. Diese Forschung könnte dazu beitragen, neue Zielmoleküle für die Therapie zu identifizieren und die Effizienz bestehender Therapien zu verbessern. Darüber hinaus könnte ich Ansätze für Langzeitstudien entwickeln, die die Stabilität epigenetischer Marker im Verlauf der Krankheit untersuchen. Somit fügt sich meine Forschungsfrage nahtlos in die bestehende Literatur ein, indem sie bestehende Erkenntnisse vertieft und neue Perspektiven eröffnet.

Aufgabe 2)

Im Rahmen Deiner Bachelorarbeit im Studiengang Molekulare Medizin hast Du eine Reihe experimenteller Daten erhoben, die die Expression eines bestimmten Gens unter verschiedenen experimentellen Bedingungen darstellen. Deine Aufgabe ist es, diese Daten statistisch zu analysieren und die Ergebnisse zu interpretieren.

a)

1. Deskriptive Statistik und Wahrscheinlichkeitsverteilungen:

• Berechne den Mittelwert, Median und die Standardabweichung der Genexpressionsdaten für jede experimentelle Bedingung. Erläutere kurz, was diese Maße über die Verteilung der Daten aussagen.
• Was besagt das Gesetz der großen Zahlen und wie könnte es in Deinem Experiment Anwendung finden? Diskutiere dies anhand Deiner Daten.
• Nehme an, die Daten folgen einer Normalverteilung. Formuliere die theoretische Wahrscheinlichkeitsverteilung und berechne die Wahrscheinlichkeit, dass ein zufällig ausgewählter Datenpunkt eine Expression von mehr als einem Standardabweichung über dem Mittelwert aufweist.

Lösung:

1. Deskriptive Statistik und Wahrscheinlichkeitsverteilungen:

• Mittelwert, Median und Standardabweichung berechnen:

Um den Mittelwert (\(\bar{x}\)), Median und die Standardabweichung (\(\text{SD}\)) der Genexpressionsdaten für jede experimentelle Bedingung zu berechnen, benötigen wir die entsprechenden Formeln. Angenommen, Du hast die Daten in verschiedenen Gruppen, dann gehst Du folgendermaßen vor:

• Mittelwert (\(\bar{x}\)): Der Mittelwert wird berechnet, indem man alle Datenpunkte summiert und dann durch die Anzahl der Datenpunkte teilt:

 \[\bar{x} = \frac{1}{n} \sum_{i=1}^{n} x_i\] 

• Median: Der Median ist der mittlere Wert eines geordneten Datensatzes. Bei einer ungeraden Anzahl von Datenpunkten ist es der mittlere Wert, bei einer geraden Anzahl von Datenpunkten ist es der Durchschnitt der beiden mittleren Werte.

• Standardabweichung (\(\text{SD}\)): Die Standardabweichung misst die Streuung der Daten um den Mittelwert. Sie wird folgendermaßen berechnet:

 \[\text{SD} = \sqrt{\frac{1}{n} \sum_{i=1}^{n} (x_i - \bar{x})^2}\] 

• Durch die Berechnung dieser Maße kannst Du Rückschlüsse auf die Verteilung Deiner Daten ziehen. Der Mittelwert gibt den Schwerpunkt der Daten an, der Median gibt an, wo die Mitte der Daten liegt, und die Standardabweichung zeigt, wie stark die Daten um den Mittelwert herum streuen. Wenn der Mittelwert und Median nahe beieinander liegen, deutet dies auf eine symmetrische Verteilung hin. Große Abweichungen zwischen beiden könnten auf eine schiefe Verteilung hindeuten.

• Gesetz der großen Zahlen:

Das Gesetz der großen Zahlen besagt, dass sich der Durchschnittswert einer großen Anzahl unabhängiger und identisch verteilter Zufallsvariablen dem Erwartungswert der zugrunde liegenden individuellen Verteilung annähert. In Deinem Experiment bedeutet das, dass bei einer ausreichenden Anzahl von Messungen der Durchschnittswert der Genexpression näher am tatsächlichen Mittelwert liegen wird. Dies ist besonders relevant, um Schwankungen durch Zufallseffekte zu minimieren.

• Theoretische Wahrscheinlichkeitsverteilung und Berechnung der Wahrscheinlichkeit:

Unter der Annahme, dass die Genexpressionsdaten einer Normalverteilung (\(N(\bar{x}, \text{SD}^2)\)) folgen, kannst Du die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion wie folgt formulieren:

 \[f(x) = \frac{1}{\sqrt{2\pi\text{SD}^2}} \exp\left( -\frac{(x - \bar{x})^2}{2\text{SD}^2} \right)\]

• Um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass ein zufällig ausgewählter Datenpunkt eine Expression von mehr als einer Standardabweichung über dem Mittelwert aufweist (d.h., \(x > \bar{x} + \text{SD}\)), verwenden wir die Standardnormalverteilung. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Wert mehr als eine Standardabweichung über dem Mittelwert liegt, ist gegeben durch:

 \[P(Z > 1) = 1 - P(Z \leq 1)\] 

Hierbei ist Z eine standardisierte Normalverteilungsvariable (mean 0, SD 1). Ein Blick in die Standardnormalverteilungstabelle zeigt, dass \(P(Z \leq 1) \approx 0.8413\) ist. Daher ist:

 \[P(Z > 1) = 1 - 0.8413 = 0.1587 = 15.87%\] 

• Die Wahrscheinlichkeit, dass ein zufällig ausgewählter Datenpunkt mehr als eine Standardabweichung über dem Mittelwert liegt, beträgt somit etwa 15.87%.

c)

3. Regressionsanalyse:

• Führe eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Einfluss einer experimentellen Variable auf die Genexpression zu untersuchen. Beschreibe den Regressionskoeffizienten und das Bestimmtheitsmaß (R²).
• Stelle die Ergebnisse graphisch dar und interpretiere das Bestimmtheitsmaß (R²) im Kontext Deiner Daten. Was sagt Dir dieses Maß über die Güte der Anpassung des Modells an die Daten?
• Verwende ein statistisches Softwarepaket (z.B. R oder SPSS), um die Regressionsanalyse durchzuführen. Füge den generierten Code und die wichtigsten Output-Parameter bei und erkläre sie.

Lösung:

3. Regressionsanalyse:

• Lineare Regressionsanalyse durchführen:

Für die lineare Regressionsanalyse betrachten wir, wie eine experimentelle Variable (z.B. die Konzentration eines Medikaments) die Genexpression beeinflusst. Die allgemeine Form der linearen Regression ist:

 \[y = \beta_0 + \beta_1 x + \epsilon\] 

• Hierbei ist:
• \(y\) die abhängige Variable (Genexpression)
• \(x\) die unabhängige Variable (z.B. Medikamentenkonzentration)
• \(\beta_0\) der Achsenabschnitt
• \(\beta_1\) der Regressionskoeffizient
• \(\epsilon\) der Fehlerterm

Der Regressionskoeffizient \(\beta_1\) gibt an, wie stark sich die Genexpression ändert, wenn die unabhängige Variable um eine Einheit erhöht wird. Ein positiver Koeffizient zeigt einen Anstieg der Genexpression mit zunehmender Konzentration, während ein negativer Koeffizient einen Rückgang der Genexpression anzeigt.

• Bestimmtheitsmaß (R²):

Das Bestimmtheitsmaß \(R^2\) gibt an, wie gut die unabhängige Variable die Variation in der abhängigen Variable erklärt. Es wird berechnet als:

 \[R^2 = 1 - \frac{SSR}{SST}\] \[SSR = \sum_{i=1}^{n} (y_i - \hat{y_i})^2\] \[SST = \sum_{i=1}^{n} (y_i - \bar{y})^2\] 

Hierbei ist:

• SSR: Summe der quadrierten Residuen
• SST: Gesamtvariation
• \(\hat{y_i}\): vorhergesagte Werte
• \(\bar{y}\): Mittelwert der beobachteten Werte

Ein \(R^2\)-Wert von 0 bedeutet, dass das Modell keine Variation erklärt, während ein \(R^2\)-Wert von 1 bedeutet, dass das Modell alle Variation erklärt.

• Graphische Darstellung und Interpretation von R²:

Die grafische Darstellung der linearen Regressionsanalyse erfolgt durch ein Streudiagramm mit der Regressionsgeraden. Zum Beispiel:

Ein hoher \(R^2\)-Wert näher bei 1 zeigt an, dass das Modell gut zu den Daten passt, während ein niedriger \(R^2\)-Wert nahe bei 0 anzeigt, dass das Modell schlecht zu den Daten passt und die unabhängige Variable wenig Einfluss auf die abhängige Variable hat.

• Analyse mit statistischer Software (z.B. R):

Hier ist ein Beispielcode für die Durchführung einer linearen Regressionsanalyse in R:

 # Daten laden und anzeigen data = read.csv('daten.csv') head(data) # Lineare Regressionsanalyse durchführen regression = lm(Genexpression ~ Medikamentenkonzentration, data=data) summary(regression) # Plot plot(data$Medikamentenkonzentration, data$Genexpression, xlab='Medikamentenkonzentration', ylab='Genexpression', main='Lineare Regressionsanalyse') abline(regression, col='blue')  

Wichtige Output-Parameter und Erklärungen:

• Intercept (\(\beta_0\)): Der Achsenabschnitt, gibt den Wert der Genexpression an, wenn die Medikamentenkonzentration null ist.
• Slope (\(\beta_1\)): Der Regressionskoeffizient, gibt die Änderung der Genexpression pro Einheit der Medikamentenkonzentration an.
• \(R^2\): Bestimmtheitsmaß, gibt an, wie gut die Modellanpassung ist.
• p-Wert: Test der Signifikanz des Regressionskoeffizienten, kleinerer Wert zeigt signifikante Beziehung.

Hier ist ein Beispieloutput:

 Call: lm(formula = Genexpression ~ Medikamentenkonzentration, data = data) Residuals:    Min      1Q  Median      3Q     Max  -0.9433 -0.2064  0.0146  0.2455  0.5675 Coefficients:                 Estimate  Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept)       0.57678    0.12345    4.671  0.0002 Medikamentenkonzentration     0.34567    0.04567    7.567   <2e-16 *** --- Signif. codes:  0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.3432 on 98 degrees of freedom Multiple R-squared:  0.5632, Adjusted R-squared:  0.5578  F-statistic:  56.32 on 1 and 98 DF,  p-value:  < 2.2e-16  

Das Bestimmtheitsmaß \(R^2\) beträgt 0.5632, was bedeutet, dass etwa 56.32% der Variation in der Genexpression durch die Medikamentenkonzentration erklärt wird. Der Regressionskoeffizient ist positiv und signifikant (\(p < 0.05\)), was auf einen positiven Einfluss der Medikamentenkonzentration auf die Genexpression hinweist.

Aufgabe 3)

Titel: Anwendung der PCR und Gel-Elektrophorese zur DNA-AnalyseDu bist ein Forscher im molekularmedizinischen Labor und möchtest eine spezifische DNA-Sequenz amplifizieren und analysieren. Dafür nutzt Du die Methoden der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und der Gel-Elektrophorese.Nehmen wir an, Du hast bereits die benötigten Komponenten: Template-DNA, spezifische Primer, DNA-Polymerase, dNTPs und einen geeigneten Puffer.Beschreibe den gesamten Prozess von der Vorbereitung der PCR bis zur Analyse der Ergebnisse durch die Gel-Elektrophorese. Beachte dabei alle wichtigen Schritte und notwendigen Materialien.

a)

Subexercise 1:Erläutere den Ablauf der PCR im Detail. Beschreibe dabei die einzelnen Phasen der PCR (Denaturierung, Annealing und Extension). Warum sind diese Schritte wichtig und welche Temperaturen werden üblicherweise verwendet?

Lösung:

Subexercise 1:

• Denaturierung:Der erste Schritt in der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ist die Denaturierung. Während dieser Phase wird die doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Dies geschieht durch Erhitzen der Reaktionsmischung auf etwa 94-98 °C für 20-30 Sekunden. Die hohen Temperaturen brechen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen der DNA-Stränge, wodurch die Doppelhelix in zwei einzelne Stränge aufgeteilt wird.Dieser Schritt ist wichtig, da nur einzelsträngige DNA als Template für die nächsten Schritte dienen kann.

• Annealing:In der Annealing-Phase hybridisieren die spezifischen Primer an die komplementären DNA-Sequenzen der Einzelstränge. Diese Phase erfolgt bei einer niedrigeren Temperatur, die typischerweise zwischen 50-65 °C liegt und für etwa 20-40 Sekunden gehalten wird. Die genaue Temperatur hängt von der Sequenz und Länge der Primer ab. Durch das Abkühlen der Reaktionsmischung können die Primer an die jeweiligen Zielsequenzen binden.Dieser Schritt ist wichtig, da die Primer als Startpunkt für die DNA-Polymerase dienen, um die DNA-Synthese zu beginnen.
• Extension (Elongation):Der letzte Schritt ist die Extension, bei der die DNA-Polymerase die DNA-Stränge verlängert. Dies geschieht meistens bei 72 °C, da dies die optimale Arbeitstemperatur für die häufig verwendete Taq-DNA-Polymerase ist. In diesem Schritt fügt die DNA-Polymerase dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate) an den 3'-Enden der gebundenen Primer hinzu und synthetisiert so den neuen komplementären DNA-Strang. Die Dauer dieser Phase hängt von der Länge des zu amplifizierenden Fragments ab, wobei man üblicherweise 30 Sekunden pro 1.000 Basenpaare rechnet.Dieser Schritt ist entscheidend für die eigentliche Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz.

• Zyklisches Wiederholen: Die oben beschriebenen drei Schritte (Denaturierung, Annealing und Extension) werden für 25-35 Zyklen wiederholt, um eine ausreichende Menge des gewünschten DNA-Fragments zu erzeugen.

b)

Subexercise 2:Berechne, wie viele Kopien einer DNA-Sequenz nach 30 Zyklen der PCR theoretisch vorliegen, wenn Du mit einer einzigen Kopie startest. Gehe dabei von einer perfekten Verdopplungsrate aus.Hinweis: Verwende die Formel \boldsymbol{ \text{Anzahl der Kopien} = \text{Anfangsmenge} \times 2^{\text{Anzahl der Zyklen}} }.

Lösung:

Subexercise 2:Um die Anzahl der Kopien einer DNA-Sequenz nach 30 Zyklen der PCR zu berechnen, kannst Du die folgende Formel verwenden:Anzahl der Kopien = Anfangsmenge × 2^{Anzahl der Zyklen}

1. Die Anfangsmenge beträgt in diesem Fall 1 Kopie.
2. Die Anzahl der Zyklen beträgt 30.

• Anfangsmenge: 1 Kopie
• Anzahl der Zyklen: 30

Die Berechnung sieht dann wie folgt aus: Anzahl der Kopien = 1 × 2³⁰ Berechne 2³⁰:

1. 2³⁰ = 1,073,741,824

c)

Subexercise 3:Beschreibe, wie die Gel-Elektrophorese genutzt werden kann, um die Amplifikationsprodukte der PCR zu analysieren. Erkläre den Aufbau eines typischen Gels (Agarose oder Polyacrylamid) und die Prinzipien, die dieser Methode zugrunde liegen.

Lösung:

Subexercise 3:

• Nutzung der Gel-Elektrophorese zur Analyse der Amplifikationsprodukte der PCR:
  • Probenvorbereitung:Nachdem die PCR durchgeführt wurde, werden die Amplifikationsprodukte (DNA-Fragmente) zur Analyse mittels Gel-Elektrophorese vorbereitet. Dazu wird eine kleine Menge der PCR-Produkte mit einem Ladepuffer vermischt, der oft Farbstoffe und Glycerin enthält, um die Proben in die Gel-Taschen zuverlässig laden zu können.
  • Gelvorbereitung:Für die Gel-Elektrophorese wird ein Gel hergestellt, das typischerweise aus Agarose oder Polyacrylamid besteht. Die Wahl des Gels hängt von der Größe der zu analysierenden DNA-Fragmente ab. Agarosegele werden meistens für größere Fragmente (100 bp bis etwa 20 kb) verwendet, während Polyacrylamidgele für kleinere Fragmente (1 bp bis etwa 500 bp) geeignet sind.
  • Guss des Gels:Das Agarose- oder Polyacrylamidpulver wird in einen Puffer (zum Beispiel TAE oder TBE) gelöst und erhitzt, bis es vollständig geschmolzen ist. Die gelöste Mischung wird dann in eine Gussform gegossen, in der sogenannte Kämme eingesetzt sind, um die Probenmulden (Taschengel) zu formen. Nach dem Abkühlen und Aushärten des Gels wird der Kamm entfernt.
  • Probenauftrag:Die PCR-Proben werden in die Taschen des Gels pipettiert. Zudem wird oft ein DNA-Marker oder Ladder in eine der Taschen gegeben, um die Größenbestimmung der DNA-Fragmente zu ermöglichen.
  • Elektrophorese:Das vorbereitete Gel wird in eine Elektrophoresekammer eingelegt, die mit dem passenden Puffer (zum Beispiel TAE oder TBE) gefüllt ist. Ein elektrisches Feld wird angelegt, wodurch die negativ geladenen DNA-Moleküle vom negativen Pol (Kathode) zum positiven Pol (Anode) wandern.
  • Auftrennung der DNA-Fragmente:Die DNA-Fragmente werden im Gel entsprechend ihrer Größe aufgetrennt. Kleinere Fragmente bewegen sich schneller und weiter durch das Gel als größere Fragmente.
  • Visualisierung:Nach der Elektrophorese wird das Gel mit einem DNA-Färbemittel behandelt, wie zum Beispiel Ethidiumbromid oder einem anderen fluoreszierenden Farbstoff. Die gefärbte DNA kann dann unter UV-Licht sichtbar gemacht werden, wodurch die Banden der DNA-Fragmente sichtbar werden.
  • Analyse:Durch den Vergleich der Positionen der PCR-Produkte mit den Banden des DNA-Markers kann die Größe der amplifizierten Fragmente bestimmt werden. Dies erlaubt Rückschlüsse auf den Erfolg der PCR-Amplifikation und die Größe der resultierenden DNA-Fragmente.

d)

Subexercise 4:Du hast vier verschiedene DNA-Proben (A, B, C und D) in einem Agarosegel-Gelelektrophorese-Lauf aufgetrennt. Die Molekulargewichts-Standards zeigen Markerbanden bei 100, 200, 400 und 800 Basenpaaren. Die Banden der Proben befinden sich wie folgt: Probe A: 100bp, Probe B: 400bp, Probe C: 200bp, Probe D: 800bp. Interpretiere diese Ergebnisse. Was kannst Du über die Größe der amplifizierten Produkte in jeder Probe sagen?

Lösung:

Subexercise 4:Du hast vier verschiedene DNA-Proben (A, B, C und D) in einem Agarosegel-Gelelektrophorese-Lauf aufgetrennt und die Ergebnisse anhand der Molekulargewichts-Standards analysiert. Die Standards zeigen Markerbanden bei 100, 200, 400 und 800 Basenpaaren (bp). Die Banden der Proben befinden sich bei den folgenden Basenpaaren:

• Probe A: 100 bp
• Probe B: 400 bp
• Probe C: 200 bp
• Probe D: 800 bp
Was kannst Du über die Größe der amplifizierten Produkte in jeder Probe sagen?Aufgrund der Positionen der Banden im Vergleich zu den Markerbanden kannst Du folgende Schlüsse über die Größen der amplifizierten Produkte ziehen:
• Probe A:Das amplifizierte Produkt hat eine Größe von 100 Basenpaaren. Dies bedeutet, dass das spezifische Fragment, das durch die PCR amplifiziert wurde, 100 bp lang ist.
• Probe B:Das amplifizierte Produkt hat eine Größe von 400 Basenpaaren. Dies bedeutet, dass das spezifische Fragment, das durch die PCR amplifiziert wurde, 400 bp lang ist.
• Probe C:Das amplifizierte Produkt hat eine Größe von 200 Basenpaaren. Dies bedeutet, dass das spezifische Fragment, das durch die PCR amplifiziert wurde, 200 bp lang ist.
• Probe D:Das amplifizierte Produkt hat eine Größe von 800 Basenpaaren. Dies bedeutet, dass das spezifische Fragment, das durch die PCR amplifiziert wurde, 800 bp lang ist.
Durch die Gel-Elektrophorese konntest Du also die Größe der DNA-Fragmente in jeder der Proben bestimmen und sicherstellen, dass die PCR erfolgreich und spezifisch verlaufen ist. Jede Probe zeigt ein eindeutiges Fragment, das der erwarteten Größe entspricht, basierend auf den für die PCR verwendeten Primern und Zielsequenzen.

Aufgabe 4)

Für eine Bachelorarbeit in Molekularer Medizin an der Universität Erlangen-Nürnberg soll eine Forschungsfrage formuliert und die dazugehörigen Hypothesen abgeleitet werden. Euer Thema basiert auf der Untersuchung eines spezifischen genetischen Markers und dessen Einfluss auf das Fortschreiten einer bestimmten Krebserkrankung. Ihr sollt definieren, wie dieser genetische Marker die Tumorprogression beeinflusst und dies wissenschaftlich konkretisieren.

a)

Formuliere eine präzise und spezifische Forschungsfrage, die sich mit dem Einfluss eines genetischen Markers auf das Fortschreiten der ausgewählten Krebserkrankung befasst. Achte dabei auf Klarheit, Relevanz und Machbarkeit Deiner Frage.

Lösung:

Forschungsfrage:

• Wie beeinflusst der genetische Marker XYZ die Progression von Brustkrebs im frühen Stadium?

Diese Frage ist präzise, da sie den spezifischen genetischen Marker (XYZ) und die Art der Krebserkrankung (Brustkrebs) klar benennt. Sie ist relevant, da das Verständnis des Einflusses von genetischen Markern auf die Tumorprogression zur Verbesserung diagnostischer und therapeutischer Ansätze beitragen kann. Die Machbarkeit liegt darin, dass durch den Einsatz moderner molekularer und genetischer Techniken umfassende Untersuchungen des Markers und dessen Auswirkungen durchgeführt werden können.

b)

Leite aus Deiner Forschungsfrage mindestens zwei Hypothesen ab. Definiere dabei klar die unabhängigen und abhängigen Variablen. Stelle sicher, dass Deine Hypothesen überprüfbar und wissenschaftlich fundiert sind. Diskutiere kurz den wissenschaftlichen und praktischen Nutzen der von Dir formulierten Hypothesen.

Lösung:

Hypothesen:

• Hypothese 1: Der genetische Marker XYZ führt zu einer erhöhten Zellproliferation in Brustkrebszellen im frühen Stadium.
• Unabhängige Variable (UV): Vorhandensein des genetischen Markers XYZ
• Abhängige Variable (AV): Zellproliferation in Brustkrebszellen

Wissenschaftlicher Nutzen: Diese Hypothese untersucht, ob der genetische Marker XYZ eine direkte Auswirkung auf das Zellwachstum hat, was grundlegende Einblicke in die Mechanismen der Tumorentwicklung bieten kann.

Praktischer Nutzen: Bestätigt diese Hypothese sich, könnten gezielte Therapien entwickelt werden, die das Zellwachstum durch Inhibierung des Markers XYZ kontrollieren.

• Hypothese 2: Der genetische Marker XYZ beeinflusst die Resistenz von Brustkrebszellen gegenüber herkömmlichen Chemotherapien.
• Unabhängige Variable (UV): Vorhandensein des genetischen Markers XYZ
• Abhängige Variable (AV): Chemotherapie-Resistenz der Brustkrebszellen

Wissenschaftlicher Nutzen: Diese Hypothese zielt darauf ab zu verstehen, ob der genetische Marker XYZ eine Rolle in der Wirksamkeit von Chemotherapien spielt, was zu neuen Ansätzen in der Behandlung führen könnte.

Praktischer Nutzen: Sollte diese Hypothese bestätigt werden, könnten personalisierte Behandlungsstrategien entwickelt werden, um die Resistenz gegen Chemotherapie zu überwinden und die Therapieerfolge zu verbessern.