Biochemie und Molekularbiologie II - Exam

Aufgabe 1)

Histon-Modifikationen und ChromatinstrukturHiston-Modifikationen beeinflussen die Chromatinstruktur und somit die Genexpression.

• Modifikationen: Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinylierung
• Verändern die Zugänglichkeit der DNA
• Acetylierung (HATs): öffnet Chromatin, erhöht Genexpression
• Deacetylierung (HDACs): schließt Chromatin, verringert Genexpression
• Methylierung: kann sowohl Aktivierung als auch Repression bewirken
• Histon-Code-Hypothese: Kombinationen der Modifikationen bestimmen spezifische Chromatinzustände und Genexpression

a)

Erkläre den Mechanismus, wie die Acetylierung durch Histon-Acetyltransferasen (HATs) die Chromatinstruktur verändert und die Genexpression erhöht. In Deiner Antwort sollst Du auf die Rolle der Chromatinzugänglichkeit und die Wechselwirkungen zwischen DNA und Histonproteinen eingehen.

Lösung:

Erklärung des Mechanismus der Acetylierung durch Histon-Acetyltransferasen (HATs)Histon-Acetyltransferasen (HATs) spielen eine zentrale Rolle bei der Regulation der Chromatinstruktur und somit der Genexpression. Hier sind die Schlüsselmechanismen, wie die Acetylierung durch HATs die Chromatinstruktur verändert und die Genexpression erhöht:

• Acetylierung der Lysinreste: HATs fügen Acetylgruppen an spezifische Lysinreste auf den Histonproteinen hinzu. Dies neutralisiert die positive Ladung der Lysine.
• Verringerung der DNA-Histon-Wechselwirkungen: Durch die Neutralisierung der positiven Ladung der Lysine vermindert die Acetylierung die elektrostatische Anziehung zwischen den negativ geladenen DNA-Phosphatgruppen und den positiv geladenen Histonen.
• Chromatinöffnung: Eine verminderte DNA-Histon-Wechselwirkung führt zu einer Lockerung der Chromatinstruktur. Das Chromatin wird offener und weniger kompakt, was als „euchromatinischer Zustand“ bezeichnet wird.
• Zugänglichkeit für Transkriptionsfaktoren: Die Lockerung der Chromatinstruktur erhöht die Zugänglichkeit der DNA für verschiedene Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine, die für die Initiation der Transkription notwendig sind.
• Erhöhte Genexpression: Durch die erhöhte Zugänglichkeit können Transkriptionsfaktoren und die RNA-Polymerase leichter an die spezifischen DNA-Sequenzen binden, was zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität und somit einer gesteigerten Genexpression führt.

Zusammenfassung: Die Acetylierung durch Histon-Acetyltransferasen (HATs) führt zur Neutralisierung der positiven Ladung der Histon-Lysinreste, was die DNA-Histon-Wechselwirkungen vermindert und die Chromatinstruktur öffnet. Dies erhöht die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine, was letztlich die Genexpression steigert.

b)

Beschreibe den Dualismus der Methylierung als Histonmodifikation. Wie kann sie sowohl zur Aktivierung als auch zur Repression der Genexpression führen? Nenne zwei konkrete Beispiele, die die unterschiedlichen Effekte der Methylierung auf die Genregulation verdeutlichen.

Lösung:

Dualismus der Methylierung als HistonmodifikationDie Methylierung ist eine vielseitige Modifikation, die je nach Kontext sowohl zur Aktivierung als auch zur Repression der Genexpression führen kann. Hier sind die Mechanismen und zwei konkrete Beispiele, die die unterschiedlichen Effekte der Methylierung verdeutlichen:

• Mechanismus der Methylierung: Bei der Methylierung werden Methylgruppen (-CH₃) an spezifische Aminosäuren in den Histonproteinen, meist Lysin- oder Argininreste, durch Enzyme wie Histon-Methyltransferasen (HMTs) hinzugefügt. Dies beeinflusst die Struktur und Funktion des Chromatins.
• Aktivierungsmechanismus: Die Methylierung an bestimmten Stellen kann zu einer Lockerung des Chromatins und zur Rekrutierung von Transkriptionsaktivatoren führen. Dies erhöht die Zugänglichkeit der DNA für die Transkriptionsmaschinerie.
• Repressionsmechanismus: Umgekehrt kann die Methylierung an anderen spezifischen Stellen zur Verdichtung des Chromatins und zur Rekrutierung von Transkriptionsrepressoren führen. Dies macht die DNA weniger zugänglich für Transkriptionsfaktoren.

Beispiele für die unterschiedlichen Effekte der Methylierung

• Aktivierende Methylierung: Ein Beispiel ist die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 4 (H3K4me3). Diese Modifikation ist häufig an den Promotorregionen von aktiv transkribierten Genen zu finden und wird als Marker für aktive Transkription anerkannt. H3K4me3 fördert die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren und Chromatin-Remodeling-Komplexen, die das Chromatin in eine offene Struktur überführen.
• Repressive Methylierung: Ein Beispiel für repressive Methylierung ist die Trimethylierung von Histon H3 an Lysin 27 (H3K27me3). Diese Modifikation wird durch das Polycomb-Repressive Complex 2 (PRC2) hinzugefügt und ist ein Marker für repressive Chromatinregionen. H3K27me3 rekrutiert Polycomb-Gruppe-Proteine, die das Chromatin in eine kompakte Form überführen und die Transkription verhindern.

Zusammenfassung: Die Methylierung als Histonmodifikation kann je nach Kontext entweder zur Aktivierung oder zur Repression der Genexpression führen. Beispiele wie H3K4me3 und H3K27me3 verdeutlichen die unterschiedlichen Effekte der Methylierung auf die Genregulation. Während H3K4me3 die Genexpression durch Förderung einer offenen Chromatinstruktur aktiviert, führt H3K27me3 durch Verdichtung des Chromatins zur Repression der Genexpression.

c)

Die Histon-Code-Hypothese besagt, dass spezifische Kombinationen von Modifikationen auf Histonproteinen unterschiedliche Chromatinzustände und somit Genexpressionsmuster bestimmen. Beschreibe, wie diese Hypothese experimentell getestet werden könnte. Welche Technologien und Methoden könnten dabei zum Einsatz kommen?

Lösung:

Experimentelle Testung der Histon-Code-HypotheseDie Histon-Code-Hypothese besagt, dass spezifische Kombinationen von Modifikationen auf Histonproteinen unterschiedliche Chromatinzustände und somit Genexpressionsmuster bestimmen. Um diese Hypothese zu testen, können verschiedene experimentelle Ansätze und Technologien eingesetzt werden. Hier sind einige der wichtigsten Methoden, die dabei zum Einsatz kommen könnten:

• Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP): Diese Methode erfasst die Bindung von Proteinen an DNA. Durch Verwendung spezifischer Antikörper gegen verschiedene Histonmodifikationen können Forscher herausfinden, wo im Genom bestimmte Modifikationen vorliegen. Durch die Kombination von ChIP mit Sequenzierung (ChIP-Seq) kann das gesamte Genom auf solche Bindungsstellen untersucht werden.
• Massenspektrometrie: Massenspektrometrie kann verwendet werden, um die genaue Zusammensetzung und Modifikationen von Histonproteinen zu bestimmen. Dies ist besonders nützlich, um die spezifischen Kombinationen von Modifikationen auf denselben oder unterschiedlichen Histonmolekülen zu identifizieren.
• RNA-Sequenzierung (RNA-Seq): Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung der Genexpression im gesamten Genom. Durch die Korrelation von RNA-Seq-Daten mit ChIP-Seq-Daten können Forscher untersuchen, wie spezifische Histonmodifikationen die Genexpression beeinflussen.
• Genome Editing (z.B. CRISPR/Cas9): Mit CRISPR/Cas9 können gezielte Mutationen oder Modifikation von Histonen oder den sie modifizierenden Enzymen durchgeführt werden. Dies ermöglicht funktionelle Studien darüber, wie Veränderungen bestimmter Histonmodifikationen die Chromatinstruktur und Genexpression beeinflussen.
• Chromatin Accessibility Assays (z.B. ATAC-Seq): Diese Methoden messen die Zugänglichkeit des Chromatins im Genom. Durch die Kombination von Daten aus Chromatinzugänglichkeits-Assays mit Daten über Histonmodifikationen können Forscher untersuchen, wie verschiedene Modifikationen die Chromatinstruktur beeinflussen.
• Co-Immunpräzipitation (Co-IP): Diese Technik ermöglicht die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Sie kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche Proteine durch spezifische Histonmodifikationen rekrutiert werden und welche Komplexe sich an bestimmte modifizierte Histone binden.

Zusammenfassung: Die experimentelle Testung der Histon-Code-Hypothese erfordert eine Kombination verschiedener biochemischer, genomischer und molekularbiologischer Methoden. Technologien wie Chromatin-Immunpräzipitation, Massenspektrometrie, RNA-Sequenzierung, Genome Editing, Chromatin Accessibility Assays und Co-Immunpräzipitation spielen dabei eine zentrale Rolle. Diese Ansätze ermöglichen es, die spezifischen Kombinationen von Histonmodifikationen zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf Chromatinzustände und Genexpression zu verstehen.

Aufgabe 2)

Die DNA-Replikation ist ein komplexer Vorgang, bei dem die Doppelhelix der DNA in zwei identische Tochterstränge kopiert wird. Diese Replikation beginnt an den Origins of Replication, wo die DNA-Doppelhelix durch das Enzym Helikase entwunden wird. Die Synthese des führenden Strangs erfolgt kontinuierlich, während der Folgestrang in diskontinuierlichen Fragmenten (Okazaki-Fragmente) synthetisiert wird. Wichtige Enzyme, die bei der Replikation eine Rolle spielen, sind neben der Helikase auch die DNA-Polymerase, die Primase und die Ligase. Die DNA-Polymerase besitzt eine Proofreading-Funktion, die fehlerhafte Basen erkennen und korrigieren kann. Verschiedene Reparaturmechanismen sichern die Genauigkeit der Replikation, darunter die Mismatch-Reparatur (MMR), die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER), die Basen-Exzisionsreparatur (BER), die homologe Rekombination (HR) und das nicht-homologe End-Joining (NHEJ). Diese Mechanismen beheben unterschiedliche Arten von DNA-Schäden, z.B. korrigiert BER falsch eingebaute Basen, NER entfernt sperrige DNA-Schäden wie Pyrimidindimere, und MMR korrigiert Fehlpaarungen, die nach der Replikation auftreten. HR und NHEJ sind für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen zuständig.

a)

Beschreibe den Unterschied zwischen der Synthese des führenden und des Folgestrangs während der DNA-Replikation. Warum benötigen die beiden Stränge unterschiedliche Mechanismen? Nutze die Begriffe kontinuierliche Synthese und diskontinuierliche Synthese in deiner Antwort.

Lösung:

Während der DNA-Replikation gibt es grundsätzliche Unterschiede in der Synthese des führenden Strangs und des Folgestrangs:

• Führender Strang: Die Synthese des führenden Strangs erfolgt kontinuierlich. Da die DNA-Polymerase nur in 5' zu 3' Richtung arbeiten kann, erfolgt die Synthese des führenden Strangs kontinuierlich vom Origin of Replication ausgehend in Richtung der Helicase, die die DNA-Doppelhelix auftrennt.
• Folgestrang: Im Gegensatz dazu erfolgt die Synthese des Folgestrangs diskontinuierlich. Da die DNA-Polymerase auch hier nur in 5' zu 3' Richtung arbeiten kann, aber die Replikationsgabel sich in die entgegengesetzte Richtung bewegt, muss der Folgestrang in kleinen Fragmenten synthetisiert werden, den sogenannten Okazaki-Fragmenten. Diese Fragmente werden später durch die DNA-Ligase miteinander verbunden.

Die unterschiedlichen Mechanismen werden aufgrund der antiparallelen Struktur der DNA und der Richtung, in der die DNA-Polymerase arbeitet, benötigt. Der führende Strang kann kontinuierlich synthetisiert werden, weil seine Synthese in die gleiche Richtung wie die Entwindung der DNA erfolgt. Der Folgestrang hingegen muss diskontinuierlich synthetisiert werden, weil er in kleinen Stücken rückwärts zur Entwindung der DNA synthetisiert wird.

b)

Erkläre die Rolle der DNA-Polymerase in der Replikation, insbesondere die Proofreading-Funktion. Weshalb ist diese Funktion für die Zelle essenziell?

Lösung:

Die DNA-Polymerase spielt eine zentrale Rolle in der DNA-Replikation und hat mehrere wichtige Funktionen:

• Synthese neuer DNA-Stränge: Die Hauptaufgabe der DNA-Polymerase ist die Synthese neuer DNA-Stränge, indem sie Nukleotide ergänzt, die zu den Einzelsträngen der getrennten DNA-Doppelhelix komplementär sind. Die DNA-Polymerase arbeitet stets in 5' zu 3' Richtung.
• Proofreading-Funktion: Während der Synthese besitzt die DNA-Polymerase eine Proofreading-Funktion, die dafür sorgt, dass fehlerhaft eingebaute Basen erkannt und korrigiert werden. Dies geschieht durch ihre 3' zu 5' Exonuklease-Aktivität, die es der Polymerase ermöglicht, falsch eingebaute Nukleotide zu entfernen und durch die korrekten zu ersetzen.

Die Proofreading-Funktion ist für die Zelle essenziell aus mehreren Gründen:

• Sicherstellung der genetischen Genauigkeit: Fehler in der DNA-Replikation können zu Mutationen führen, die potenziell schädlich für die Zelle sein können. Durch das Proofreading wird die Fehlerrate bei der Replikation drastisch reduziert, was die genetische Integrität erhält.
• Verhinderung von Krankheiten: Viele Krankheiten, einschließlich Krebs, können durch Mutationen in der DNA verursacht werden. Indem die Proofreading-Funktion Fehler frühzeitig korrigiert, wird das Risiko von Mutationen und damit verbundenen Krankheiten reduziert.
• Generationenübergreifende Stabilität: Fehlerhafte DNA-Replikation kann in Keimbahnzellen zu genetischen Defekten bei Nachkommen führen. Die Proofreading-Funktion stellt sicher, dass die genetische Information korrekt an die nächste Generation weitergegeben wird.

c)

Diskutiere (in etwa 150 Wörtern) den Mechanismus und die biologische Bedeutung der Basen-Exzisionsreparatur (BER). Welche Enzyme sind daran beteiligt und wie tragen sie zur Genauigkeit der DNA-Replikation bei?

Lösung:

Die Basen-Exzisionsreparatur (BER) ist ein essenzieller Mechanismus zur Korrektur kleinerer DNA-Schäden, die aus basalen Veränderungen resultieren, wie z.B. oxidierte, alkylierte oder desaminierte Basen. Diese Veränderungen, wenn sie nicht korrigiert werden, können zu Mutationen führen.

Der BER-Mechanismus umfasst mehrere Schritte und Enzyme:

• DNA-Glykosylase: Erster Schritt der BER ist die Erkennung und Entfernung der geschädigten Base durch eine spezifische DNA-Glykosylase. Dies erzeugt eine apurinische/apyrimidinische (AP)-Stelle.
• AP-Endonuklease: Diese AP-Stelle wird anschließend von einer AP-Endonuklease geschnitten, was die Zucker-Phosphat-Bindung bricht und eine Einzelstrangbrücke erzeugt.
• DNA-Polymerase: Die Lücke wird dann durch das Einfügen des korrekten Nukleotids von einer DNA-Polymerase aufgefüllt.
• DNA-Ligase: Schließlich wird die verbleibende Brücke im Zucker-Phosphat-Rückgrat durch eine DNA-Ligase versiegelt.

Die biologische Bedeutung der BER liegt in der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität und Integrität. Sie sorgt dafür, dass die DNA frei von kleinen, in potenziell mutagenen Schäden bleibt und trägt somit maßgeblich zur Genauigkeit der DNA-Replikation bei.

d)

Ein doppelsträngiger DNA-Bruch kann sowohl durch homologe Rekombination (HR) als auch durch nicht-homologes End-Joining (NHEJ) repariert werden. Vergleiche die beiden Mechanismen hinsichtlich ihres Ablaufs und ihrer Genauigkeit. Welcher Mechanismus wird bevorzugt und warum?

Lösung:

Ein doppelsträngiger DNA-Bruch (DSB) kann durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologes End-Joining (NHEJ) repariert werden. Beide Mechanismen haben unterschiedliche Abläufe und Genauigkeit:

• Homologe Rekombination (HR):
  • Ablauf: HR verwendet eine homologe Schwesterchromatide als Vorlage zur Reparatur. Zuerst wird der DSB erkannt und die Enden durch Endonukleasen und Helicase bearbeitet. Danach erfolgt die Invasion eines der Enden in eine intakte Schwesterchromatide, wodurch ein D-Loop (Displacement Loop) gebildet wird. Die DNA-Polymerase verlängert das 3'-Ende, indem sie die Vorlage sequenziert. Nach der Verlängerung werden die Enden ligiert, um die Struktur zu stabilisieren und die Replikation zu beenden.
  • Genauigkeit: Sehr genau, da die Vorlage zur Reparatur eine identische oder fast identische Sequenz besitzt.
• Nicht-homologes End-Joining (NHEJ):
  • Ablauf: NHEJ erkennt den DSB und bearbeitet die Enden, um sie für die Ligation vorzubereiten. Spezifische Enzyme, darunter Ku-Proteine und DNA-Protein-Kinase (DNA-PK), binden die Bruchstellen und erleichtern die Endverarbeitung. Danach werden die Enden durch eine DNA-Ligase direkt verbunden, ohne die Verwendung einer homologen Vorlage.
  • Genauigkeit: Weniger genau, da es oft zu kleinen Deletionen oder Insertionen an der Bruchstelle kommt.

Welcher Mechanismus bevorzugt wird, hängt vom Zellzyklus und der Situation ab:

• HR: Bevorzugt in der S- und G2-Phase des Zellzyklus, wenn eine Schwesterchromatide verfügbar ist. Dies ermöglicht eine genaue Reparatur.
• NHEJ: Bevorzugt in der G1-Phase und in Zellen, die sich nicht teilen, da keine Schwesterchromatide zur Verfügung steht. Es ist schneller und kann in Notfällen verwendet werden, obwohl es weniger genau ist.

Aufgabe 3)

Die Genomeditierung durch das CRISPR-Cas9-System stellt eine Revolution in der Molekularbiologie dar. Dieses System erlaubt es, gezielte Veränderungen in DNA-Sequenzen lebender Organismen vorzunehmen. Die Systeme basieren auf zwei Hauptkomponenten: den Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) und dem CRISPR-assoziierten Protein 9 (Cas9), einer Endonuklease. Die Cas9-Endonuklease wird durch die guide RNA (gRNA) zu einer spezifischen DNA-Sequenz geführt, die sie schneidet. Die geschnittene DNA kann durch zelluläre Reparaturmechanismen wie die nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ) oder die homologe gerichtete Reparatur (HDR) repariert werden. Diese präzise Technologie wird für verschiedene Anwendungen wie den Gentransfer,

a)

Erläutere den Mechanismus der Cas9-Endonuklease und wie sie spezifisch zur Ziel-DNA-Sequenz geführt wird. Diskutiere dabei die Rolle der guide RNA (gRNA) und beschreibe die anschließenden zellulären Reparaturmechanismen NHEJ und HDR.

Lösung:

Mechanismus der Cas9-Endonuklease und ihr Weg zur Ziel-DNA-Sequenz:

• Das CRISPR-Cas9-System ist eine molekularbiologische Methode zur gezielten Genomeditierung.
• Die Cas9-Endonuklease ist ein Enzym, das DNA schneiden kann.
• Die Cas9-Endonuklease wird durch die guide RNA (gRNA) zu einer spezifischen DNA-Sequenz geführt. Die gRNA besteht aus zwei Teilen:
  • einer kurzen, komplementären Sequenz, die zur Ziel-DNA passt, und
  • einer konstanten Sequenz, die mit der Cas9-Endonuklease interagiert.
• Sobald die gRNA die Zielsequenz in der DNA findet, bindet sie daran und formt eine RNA-DNA-Hybriddoppelhelix.
• Durch diese Bindung wird die Cas9-Endonuklease aktiviert und schneidet beide Stränge der DNA, was einen Doppelstrangbruch verursacht.

Rolle der guide RNA (gRNA):

• Die gRNA hat eine entscheidende Rolle in der Spezifität des CRISPR-Cas9-Systems. Sie bestimmt, welche DNA-Sequenz geschnitten wird.
• Die Anpassung der komplementären Sequenz der gRNA ermöglicht die gezielte Modifikation fast jeder gewünschten DNA-Sequenz im Genom.

Zelluläre Reparaturmechanismen nach dem DNA-Schnitt:

• Nachdem die Cas9-Endonuklease die DNA geschnitten hat, wird der Doppelstrangbruch durch zelluläre Reparaturmechanismen repariert.
• Es gibt hauptsächlich zwei Reparaturmechanismen:
• 1. Nicht-homologe Endverknüpfung (NHEJ):
  • Dieser Reparaturmechanismus verbindet die Enden des DNA-Bruchs ohne Vorlage.
  • Es handelt sich um einen schnellen und häufigen Mechanismus, der jedoch fehleranfällig sein kann.
  • NHEJ kann zu kleinen Insertionen oder Deletionen (Indels) führen, die möglicherweise Funktionsverlust in Genen verursachen können.
• 2. Homologe gerichtete Reparatur (HDR):
  • Dieser Mechanismus verwendet eine homologe DNA-Sequenz als Vorlage zur präzisen Reparatur des Bruchs.
  • HDR ist genauer als NHEJ, tritt jedoch weniger häufig in Zellen auf und erfordert eine homologe Vorlage, die während des Reparaturprozesses bereitgestellt werden muss.
  • HDR ermöglicht gezielte genetische Modifikationen, wie das Einfügen neuer DNA-Sequenzen in das Genom.

Aufgabe 4)

Protein-Protein-InteraktionenWechselwirkungen zwischen zwei oder mehr Proteinen, die spezifisch und oft transient sind. Sie sind essentiell für zelluläre Prozesse und Signaltransduktionswege.

• Können kovalent oder nicht-kovalent sein
• Erkennungsmotive: SH2-Domänen, PDZ-Domänen, etc.
• Techniken: Co-Immunpräzipitation, Yeast-Two-Hybrid, FRET
• Regulieren: Enzymaktivität, Zellzyklus, Apoptose

a)

Erläutere den Mechanismus der Co-Immunpräzipitation (Co-IP) und wie diese Technik verwendet werden kann, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Gehe dabei insbesondere auf folgende Punkte ein:

• Prinzip der Co-IP
• Wichtige Schritte und Reagenzien, die in dieser Methode verwendet werden
• Mögliche Artefakte und wie man diese minimieren kann

Lösung:

Mechanismus der Co-Immunpräzipitation (Co-IP)Die Co-Immunpräzipitation (Co-IP) ist eine beliebte Methode, um Protein-Protein-Interaktionen in einer biochemischen Analyse zu untersuchen. Diese Technik basiert auf der spezifischen Bindung eines Antikörpers an ein Zielprotein und das anschließende Isolieren dieses Komplexes, einschließlich aller Interaktionspartner. Hierbei handelt es sich um eine nicht-kovalente Interaktion.

• Prinzip der Co-IPDas Grundprinzip der Co-IP besteht darin, einen spezifischen Antikörper zu verwenden, der an das Zielprotein bindet. Wenn das Zielprotein als ein Teil eines größeren Protein-Komplexes besteht, wird dieser gesamte Komplex durch Immunpräzipitationen isoliert. Diese isolierten Proteine können dann durch weitere Techniken wie SDS-PAGE und Western Blotting analysiert werden, um die interagierenden Partner zu identifizieren.
• Wichtige Schritte und Reagenzien, die in dieser Methode verwendet werden
  • Zelllysat: Das Zelllysat dient als Quelle des Zielproteins und seiner Interaktionspartner.
  • Antikörper: Spezifische Antikörper gegen das Zielprotein werden hinzugefügt, um die Immunpräzipitation zu vermitteln.
  • Protein A/G-konjugierte Agarose-Perlen: Diese Perlen binden an den Fc-Teil des Antikörpers und ermöglichen das physische Einfangen des Protein-Antikörper-Komplexes.
  • Waschen: Mehrfaches Waschen dient dazu, unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
  • Elution: Der Protein-Komplex wird von den Perlen eluiert, oft unter Verwendung eines denaturierenden Puffers.
  • Analyse: SDS-PAGE und Western Blotting dienen zur Identifizierung und Analyse der ko-immunopräzipitierten Proteine.
• Mögliche Artefakte und wie man diese minimieren kann
  • Unspezifische Bindung: Unspezifische Bindung kann durch umfangreiches Waschen und die Verwendung von Kontrollen wie einem Isotyp-Kontrollantikörper minimiert werden.
  • Falsch-positive Ergebnisse: Falsch-positive Ergebnisse können durch den Einsatz von mehr als einem Antikörper gegen verschiedene Epitope des Zielproteins und durch die Validierung der Ergebnisse mit alternativen Methoden reduziert werden.
  • Proteindenaturierung: Die Verwendung von milden Waschbedingungen hilft gegen die Denaturierung der Proteine und erhält deren native Konformation.
  • Antikörper-abhängige Artefakte: Unspezifische Wechselwirkungen können durch präzise Antikörper-Selektion und Validierung auf Spezifität minimiert werden.

b)

Beschreibe die Rolle von SH2-Domänen bei Protein-Protein-Interaktionen. Beantworte dabei folgende Fragen:

• Was charakterisiert SH2-Domänen und wie erkennen sie ihre Bindungspartner?
• Warum sind diese Interaktionen wichtig für die Signaltransduktion?
• Wie könnten Mutationen in SH2-Domänen die zelluläre Signalübertragung beeinträchtigen? Verwende spezifische Beispiele.

Lösung:

Rolle von SH2-Domänen bei Protein-Protein-InteraktionenSH2-Domänen (Src-Homology 2-Domänen) sind strukturell konservierte Proteinmodule, die eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion spielen, indem sie spezifisch an phosphorylierte Tyrosinreste binden.

• Was charakterisiert SH2-Domänen und wie erkennen sie ihre Bindungspartner?SH2-Domänen sind etwa 100 Aminosäuren lange Motive, die in einer Vielzahl von Proteinen vorkommen. Sie erkennen und binden spezifisch an phosphorylierte Tyrosinreste (pY) in einer Konsensussequenz innerhalb eines Proteins. Die Bindung erfolgt über eine Kombination aus elektrostatischen Wechselwirkungen und spezifischen hydrophoben Kontakten zwischen der SH2-Domäne und den umgebenden Aminosäuren des phosphorylierten Tyrosins.
• Warum sind diese Interaktionen wichtig für die Signaltransduktion?SH2-Domänen-vermittelte Interaktionen sind entscheidend für die Weiterleitung von Signalen, die durch Tyrosinphosphorylierung initiiert werden. Diese Interaktionen ermöglichen es Signalmolekülen, an spezifische phosphorylierte Stellen zu binden und so Signalkaskaden zu aktivieren oder zu modulieren. Beispiele sind die Aktivierung der Ras-MAP-Kinase-Signalkaskade oder die Regulation der JAK-STAT-Signalwege. Durch diese genaue und spezifische Bindung tragen SH2-Domänen zur Herstellung und Aufrechterhaltung der Signalübertragungswege bei.
• Wie könnten Mutationen in SH2-Domänen die zelluläre Signalübertragung beeinträchtigen? Verwende spezifische Beispiele.Mutationen in SH2-Domänen können zu einer fehlerhaften Signalübertragung führen, indem sie die Fähigkeit der SH2-Domäne zur Bindung an phosphorylierte Tyrosine beeinträchtigen. Spezifische Beispiele sind:
  • SRC-Familie-Kinasen: Mutationen in der SH2-Domäne dieser Kinasen können deren Interaktion mit Signalmolekülen verhindern und so die Aktivierung von Downstream-Signalen blockieren. Dies könnte zu einer verminderten Zellproliferation und -differenzierung führen.
  • STAT-Proteine: STAT-Proteine (Signal Transducer and Activator of Transcription) enthalten SH2-Domänen, die für die Dimerisierung und nukleäre Translokation nach Tyrosinphosphorylierung notwendig sind. Mutationen in der SH2-Domäne können die Dimerisierung verhindern und somit die Transkription von Zielgenen beeinträchtigen, was zur Unterdrückung von Immunantworten und anderen kritischen Zellfunktionen führen kann.
  • PI3K: Die p85-Untereinheit von PI3K enthält eine SH2-Domäne, die an phosphorylierte Tyrosine bindet, um die PI3K-Aktivität zu regulieren. Mutationen können die Bindung an Rezeptortyrosin-Kinasen stören, was zur fehlerhaften PI3K-Aktivierung und möglicherweise zur Entstehung von Krebs führen könnte.