Biochemisches Praktikum I - Cheatsheet

Techniken der Überexpression von Proteinen

Definition:

Methoden zur Erhöhung der Produktion eines spezifischen Proteins in einer Zelle.

Details:

• Verwendung von Expressionsvektoren (Plasmide, Viren) mit stark promotern
• Wirtszellen: Bakterien (z.B. E. coli), Hefe, Insekten- oder Säugerzellen
• Induktion der Expression: IPTG für E. coli, methanol für Pichia pastoris
• Verwendung von Tags für leichte Reinigung: His-Tag, GST-Tag
• Optimierung der Codon-Nutzung für den Wirt
• Kontrolle und Analyse: SDS-PAGE, Western Blot, Massenspektrometrie

Methoden zur Überprüfung der Proteinreinheit

Definition:

Methoden zur Überprüfung der Proteinreinheit analysieren, wie rein ein isoliertes Protein ist.

Details:

• SDS-PAGE: trennt Proteine nach Größe; Reinheit durch Bandenmuster analysierbar
• Western Blot: spezifische Identifizierung eines Proteins mithilfe von Antikörpern
• HPLC: trennt Proteine basierend auf ihrer Wechselwirkung mit der Säule
• Massenspektrometrie: Bestimmung der Masse und Sequenz des Proteins
• UV-Vis-Spektrophotometrie: misst Absorption bei spezifischen Wellenlängen
• Bradford-Assay: Farbwechsel zur Proteinkonzentrationsbestimmung

Michaelis-Menten-Kinetik und ihre Anwendung

Definition:

Michaelis-Menten-Kinetik analysiert die Geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen unter Annahme eines Enzym-Substrat-Komplexes.

Details:

• Wichtige Gleichung: \[ v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]} \]
• \( v \): Reaktionsgeschwindigkeit
• \( V_{max} \): max. Geschwindigkeit
• \( [S] \): Substratkonzentration
• \( K_m \): Michaelis-Konstante (Substratkonz. bei halbmax. Geschwindigkeit)
• Anwendungen: Enzymcharakterisierung, Inhibitionstests, Sättigungsanalysen
• Typische Experimente im Praktikum: Messung der Anfangsgeschwindigkeiten, Herstellung von Substratverdünnungsreihen

Inhibitoren und ihre Auswirkungen auf Enzymkinetik

Definition:

Inhibitoren: Moleküle, die die Aktivität von Enzymen beeinflussen, meist durch Verlangsamung oder Verhinderung der katalytischen Funktion.

Details:

• Arten von Inhibitoren: kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv.
• Kompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an das aktive Zentrum des Enzyms, erhöht den Km-Wert, Vmax bleibt konstant.
• Nicht-kompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an eine andere Stelle als das aktive Zentrum, verringert Vmax, Km bleibt konstant.
• Unkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet nur an den Enzym-Substrat-Komplex, verringert sowohl Km als auch Vmax.
• Michaelis-Menten-Gleichung:

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Definition:

Enzymatische Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen

Details:

• Schritte: Denaturierung, Annealing, Elongation
• Taq-Polymerase verwendet
• Primers: Startpunkte für DNA-Synthese
• Thermozykler: Gerät zur Durchführung von PCR
• Exponentielle Amplifikation der Ziel-DNA
• Anwendungen: Diagnostik, Klonierung, Genotypisierung
• \textit{Denaturierungstemperatur}: ca. 94-98°C
• \textit{Annealing-Temperatur}: ca. 50-65°C
• \textit{Elongationstemperatur}: ca. 72°C

Agarose-Gelelektrophorese

Definition:

Trennt Nukleinsäuren und Proteine basierend auf Größe und Ladung mittels eines elektrischen Feldes durch ein Agarosegel

Details:

• Puffer: z.B. TAE oder TBE
• DNA-Ladung: proportional zur Anzahl der Phosphatreste
• Ethidiumbromid: Interkalationsfarbstoff zur Visualisierung unter UV-Licht
• Elektrophorese: anlegen einer Spannung (meist 50-150 V)
• Gelkonzentration: beeinflusst Trennauflösung (z.B. 0,7% für große DNA-Fragmente, 2% für kleine)
• Loading Dye: enthält Farbstoff und Glycerin für Probeneinbringung

Flüssigchromatographie (HPLC, FPLC)

Definition:

HPLC und FPLC sind Techniken zur Trennung von Substanzen in einer Probe basierend auf deren unterschiedlichen Wechselwirkungen mit einer stationären Phase.

Details:

• HPLC: High Performance Liquid Chromatography
• FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
• Mobile Phase: Lösungsmittel, das die Probe durch die Säule transportiert.
• Stationäre Phase: Feststoff in der Säule, an dem die Trennung stattfindet.
• Detektion durch UV, Fluoreszenz oder andere Methoden.
• HPLC: hohe Auflösung, oft für kleine Moleküle genutzt.
• FPLC: optimiert für Proteintrennung.
• Elutionsprofil: Diagramm, zeigt die Detektion verschiedener Komponenten über die Zeit.

Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen

Definition:

Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen - Verfahren zur Quantifizierung spezifischer Moleküle in einer Probe.

Details:

• UV/Vis-Absorptionsspektroskopie: Messung der Lichtabsorption bei spezifischen Wellenlängen.
• Beer-Lambert-Gesetz: \(A = \varepsilon \,c \,d\) - \(A\): Absorption, \(\varepsilon\): molarer Extinktionskoeffizient, \(c\): Konzentration, \(d\): Schichtdicke.
• Fluorometrie: Fluoreszenz-Intensität proportional zur Konzentration.
• Bradford-Assay: Farbindikator bindet an Protein, Absorption bei 595 nm.
• BCA-Assay: Reduktion von Cu2+ zu Cu+, Absorption bei 562 nm proportional zur Proteinkonzentration.
• Kalibrierkurven: Konzentration vs. Absorption/Fluoreszenz zur Bestimmung unbekannter Proben.