Biochemisches Praktikum I - Exam

Aufgabe 1)

In einem Experiment möchtest Du ein spezifisches menschliches Protein in hohen Mengen in E. coli produzieren. Dazu planst Du die Verwendung eines Expressionsvektors, der für das Zielprotein kodiert. Der Vektor enthält einen starken Promoter und einen His-Tag für die nachfolgende Reinigung. Um die Expression zu induzieren, verwendest Du IPTG. Im Anschluss kontrollierst Du die Proteinproduktion mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot.

a)

Beschreibe die Funktionsweise von IPTG in Deiner Produktion und erkläre, warum es zur Induktion der Proteinexpression in E. coli verwendet wird.

Lösung:

• IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid): IPTG ist ein Molekül, das häufig in molekularbiologischen Experimenten verwendet wird, um die Expression von Genen zu induzieren, die durch den Lac-Operon-Regulator kontrolliert werden.
• Funktionsweise von IPTG:
  • Induktion: IPTG wirkt als analoges Substrat zu Laktose und aktiviert die Transkription des Zielgens. Es bindet an den Repressor des Lac-Operons (LacI) und verhindert, dass der Repressor an den Operator bindet. Dadurch wird die Blockierung der RNA-Polymerase aufgehoben und die Transkription des Zielgens eingeleitet.
  • Stabilität: Im Gegensatz zu Laktose wird IPTG nicht durch β-Galactosidase abgebaut, was zu einer stabilen und konstanten Induktion führt.
• Anwendung in der Proteinexpression in E. coli:
  • Promoter: In Deinem Experiment enthält der Expressionsvektor einen starken Promoter, der durch IPTG induziert wird. Der Promoter kontrolliert die Transkription des Gens, das für das Zielprotein kodiert.
  • Effizienz: Durch die Zugabe von IPTG in das Wachstumsmedium der E. coli-Kulturen wird die Expression des Zielproteins effizient induziert. Dies ist besonders nützlich, um hohe Mengen des Proteins für nachfolgende Analysen und Anwendungen zu produzieren.
  • Reinigung: Der His-Tag am Zielprotein erleichtert die nachfolgende Reinigung des Proteins mittels Nickel-Affinitätschromatographie.

b)

Welche Vorteile bietet der Einsatz eines His-Tags bei der Proteinreinigung und wie funktioniert die His-Tag basierte Reinigung genau? Gehe dabei auch auf mögliche Probleme ein, die hierbei auftreten können.

Lösung:

• Vorteile des Einsatzes eines His-Tags bei der Proteinreinigung:
  • Hohe Affinität: Der His-Tag (ein Polyhistidin-Tag) besteht typischerweise aus sechs Histidinresten, die eine starke Affinität zu Nickel- oder Kobalt-Ionen haben, die an eine Chromatographiesäule gebunden sind. Dies ermöglicht eine effiziente und spezifische Bindung des His-getaggten Proteins.
  • Einfache und schnelle Reinigung: Die Proteinreinigung mittels His-Tag ist relativ unkompliziert und kann in wenigen Schritten durchgeführt werden. Es erfordert keine komplexen oder teuren Reagenzien.
  • Hohe Ausbeute: Der Prozess ermöglicht in der Regel eine hohe Ausbeute an reinem Protein, da die meisten unerwünschten Proteine nicht an die Säule binden.
  • Wiederverwendbarkeit: Die Chromatographiesäulen können nach der Reinigung regeneriert und wiederverwendet werden, was die Kosten reduziert.
• Funktionsweise der His-Tag basierten Reinigung:
  • Bindung: Das Zelllysat, das das His-getaggte Protein enthält, wird durch eine Nickel- oder Kobalt-affine Chromatographiesäule geleitet. Der His-Tag bindet an die Ionen in der Säule.
  • Waschen: Nicht gebundene Proteine und Verunreinigungen werden durch Waschen mit einem geeigneten Puffer entfernt, während das His-getaggte Protein an die Säule gebunden bleibt.
  • Elution: Das gebundene His-getaggte Protein wird durch die Zugabe eines Imidazol-haltigen Puffers eluiert. Imidazol konkurriert um die Bindungsstellen zwischen dem His-Tag und den Nickel- oder Kobalt-Ionen und löst das Protein von der Säule.
• Mögliche Probleme und Herausforderungen:
  • Unvollständige Bindung: Wenn das Protein falsch gefaltet ist oder die Zugänglichkeit des His-Tags eingeschränkt ist, kann die Bindung an die Säule ineffizient sein.
  • Koproteine und Verunreinigungen: Einige andere Proteine aus dem Zelllysat können ebenfalls an die Säule binden, was zu Verunreinigungen führt. Dies kann oft durch optimierte Wasch- und Elutionsbedingungen minimiert werden.
  • Elutionsbedingungen: Zu hohe Konzentrationen von Imidazol können das Protein denaturieren oder seine Funktion beeinträchtigen. Es ist wichtig, die Elutionsbedingungen sorgfältig zu optimieren.
  • Regenerierung der Säule: Die wiederholte Nutzung der Säule kann zu einer Abnahme der Bindungskapazität führen, wenn die Säule nicht ordnungsgemäß regeneriert wird.

c)

Du hast die Proteinproduktion durchgeführt und möchtest nun die Mengen des produzierten Proteins quantifizieren. Erkläre, wie Du vorgehst und wie die SDS-PAGE und der Western Blot Dir dabei helfen können. Gehe dabei detailliert auf beide Methoden ein und erkläre, wie Du die Proteinmenge bestimmst.

Lösung:

• Quantifizierung der Proteinmengen: Um die Mengen des produzierten Proteins zu quantifizieren, kannst Du die Proteinproduktion mithilfe von SDS-PAGE und Western Blot analysieren. Hierbei gehst Du wie folgt vor:

• SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis):
  • Vorbereitung: Das Proteinlysat wird mit einem Laemmli-Puffer gemischt, der SDS enthält. SDS denaturiert die Proteine und verleiht ihnen eine negative Ladung, proportional zu ihrer Größe. Gleichzeitig wird eine Reduzierungsmittel (wie β-Mercaptoethanol) hinzugefügt, um Disulfidbrücken aufzubrechen.
  • Elektrophorese: Die Proben werden in die Taschen eines Polyacrylamidgels geladen. Wenn ein elektrisches Feld angelegt wird, wandern die Proteine durch das Gel. Kleinere Proteine bewegen sich schneller und weiter durch das Gel als größere Proteine.
  • Färbung: Nach der Elektrophorese wird das Gel gefärbt (z.B. mit Coomassie-Brillantblau), um die Proteine sichtbar zu machen. Die Intensität der Proteinbänder korreliert mit der Menge des Proteins.
• Western Blot:
  • Transfer: Nach der Trennung der Proteine durch SDS-PAGE werden die Proteine auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Dies erfolgt typischerweise durch elektrophoretischen Transfer.
  • Blockieren: Die Membran wird in einer blockierenden Lösung (z.B. Milchpulver oder BSA in Puffer) inkubiert, um unspezifische Bindungen zu verhindern.
  • Inkubation mit Antikörpern:
    • Primärantikörper: Die Membran wird mit einem spezifischen Primärantikörper inkubiert, der das Zielprotein erkennt und bindet.
    • Sekundärantikörper: Anschließend wird die Membran mit einem sekundären Antikörper inkubiert, der an den Primärantikörper bindet. Der sekundäre Antikörper ist oft mit einem Enzym (z.B. Horseradish Peroxidase, HRP) konjugiert.
  • Detektion: Das gebundene Enzym katalysiert eine chemilumineszente Reaktion, die auf einem Film oder einem Detektionsgerät sichtbar gemacht wird. Die Intensität der Signale gibt Aufschluss über die Menge des Zielproteins.
• Quantifizierung der Proteinmenge:
  • SDS-PAGE:Die Intensität der Proteinbänder im gefärbten Gel kann mit einem Gel-Dokumentationssystem und entsprechender Software analysiert werden. Durch Vergleich mit einer Standardkurve bekannter Proteinmengen kann die Menge des Zielproteins in den Proben geschätzt werden.
  • Western Blot:Die Intensität der Banden im Western Blot kann ebenfalls quantifiziert werden. Die relative Menge des Proteins kann durch Vergleich der Bandintensität mit einer Standardkurve oder durch Verwendung eines internen Kontrolproteins quantifiziert werden.

d)

Nach der Optimierung des Prozesses stellst Du fest, dass trotz starker Expression der Ausbeute niedrig ist. Nenne mögliche Ursachen für die geringe Ausbeute und beschreibe methodische Ansätze, die du zur Verbesserung der Proteinproduktion und -reinigung ergreifen könntest. Gib dabei insbesondere auf die Optimierung der Codon-Nutzung für E. coli ein.

Lösung:

• Mögliche Ursachen für die geringe Ausbeute:
  • Ungeeignete Codon-Nutzung: Menschliche Gene enthalten häufig Codons, die in E. coli selten verwendet werden. Dies kann die Translationseffizienz und damit die Proteinproduktion verringern.
  • Proteindegradation: Das exprimierte Protein könnte durch proteolytische Enzyme in E. coli abgebaut werden.
  • Inklusionskörperbildung: Das Protein könnte in unlöslichen Aggregaten (Inklusionskörpern) exprimiert werden, was die Ausbeute des löslichen und funktionellen Proteins verringert.
  • Toxizität des Proteins: Das Zielprotein könnte für E. coli toxisch sein, wodurch die Zellen langsamer wachsen oder absterben.
  • Fehler bei der Induktion: Die IPTG-Induktion könnte nicht optimal durchgeführt worden sein, was die Proteinexpression beeinträchtigen könnte.
• Methodische Ansätze zur Verbesserung der Proteinproduktion und -reinigung:
  • Codon-Optimierung: Du könntest das Gen so modifizieren, dass es bevorzugte Codons für E. coli verwendet. Dies kann die Translationseffizienz erheblich verbessern. Es gibt Software-Tools, die die Codon-Nutzung für E. coli optimieren können.
  • Cotransformation mit tRNA-Plasmiden: Du könntest E. coli-Stämme verwenden, die zusätzliche tRNA-Plasmide enthalten, die seltene tRNAs kodieren. Dies kann die Translation von Genen mit seltenen Codons unterstützen.
  • Expressionstemperatur: Die Expression bei niedrigeren Temperaturen (z.B. 16-25°C anstelle von 37°C) kann die Bildung von Inklusionskörpern verringern und die Löslichkeit des Proteins erhöhen.
  • Protease-Inhibitoren: Du könntest Protease-Inhibitoren in das Kulturmedium oder während der Zelllyse hinzufügen, um den proteolytischen Abbau des Proteins zu verhindern.
  • Chaperone-Kotransformation: Die Coexprimierung von molekularen Chaperonen (z.B. GroEL/GroES oder DnaK/DnaJ) kann die Faltung und Löslichkeit des rekombinanten Proteins verbessern.
  • Optimierung der Induktionsbedingungen: Die Optimierung der IPTG-Konzentration und der Induktionszeit kann ebenfalls die Ausbeute steigern. Eine zu hohe IPTG-Konzentration kann toxisch für die Zellen sein und die Ausbeute verringern.
  • Alternative Expressionsphasen: Du kannst die Zellen bis zur mittel-logarithmischen Phase wachsen lassen, bevor Du die Induktion beginnst. In dieser Phase sind die Zellen oft am gesündesten und produktivsten.

Aufgabe 2)

Du hast ein Protein isoliert und möchtest dessen Reinheit überprüfen, um sicherzustellen, dass das Protein für nachfolgende biochemische Experimente geeignet ist. Beschreibe und analysiere die Anwendungen und Ergebnisse, die du mit verschiedenen Methoden zur Überprüfung der Proteinreinheit erhalten kannst.

a)

Erkläre, wie die SDS-PAGE Methode zur Überprüfung der Proteinreinheit eingesetzt wird. Welche Informationen kannst du aus dem Bandenmuster ableiten?

Lösung:

SDS-PAGE Methode zur Überprüfung der ProteinreinheitDie SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse der Reinheit von Proteinen. Sie basiert auf der Trennung von Proteinen anhand ihrer Größe. Hier ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, wie die SDS-PAGE Methode eingesetzt wird und welche Informationen aus dem Bandenmuster abgeleitet werden können:

• Vorbereitung der Proteinprobe: Das zu analysierende Protein wird in einem Puffer gelöst, der SDS (ein anionisches Detergens) enthält. SDS denaturiert die Proteine und verleiht ihnen eine negative Ladung proportional zu ihrer Länge.
• Denaturierung: Die Proteine werden durch Erhitzen denaturiert, um sekundäre, tertiäre und quartäre Strukturen zu zerstören. Dadurch erhält man lineare Proteinmoleküle.
• Elektrophorese: Die denaturierten Proteine werden in die Vertiefungen eines Polyacrylamid-Gels geladen und eine elektrische Spannung wird angelegt. Die Proteine wandern durch das Gel von der negativen zur positiven Elektrode. Kleinere Proteine wandern schneller als größere.
• Färbung: Nach der Elektrophorese wird das Gel gefärbt (z.B. mit Coomassie-Brillantblau), um die Proteine sichtbar zu machen. Alternativ können auch andere Färbemethoden wie Silberfärbung oder Western Blotting verwendet werden.
• Analyse des Bandenmusters: Die gefärbten Proteine erscheinen als Banden im Gel. Jede Bande repräsentiert ein Protein oder eine Proteinkomponente. Hier sind die Informationen, die aus dem Bandenmuster abgeleitet werden können:
  • Anzahl der Banden: Gibt einen Hinweis auf die Anzahl der Proteinkomponenten in der Probe. Mehrere Banden deuten auf Verunreinigungen hin, während eine einzelne Bande auf ein reines Protein hinweist.
  • Intensität der Banden: Die Intensität (Dicke) einer Bande kann auf die Menge des jeweiligen Proteins in der Probe hinweisen. Dunkle und dicke Banden bedeuten eine hohe Menge des entsprechenden Proteins.
  • Molekulargewicht: Durch Vergleich der Wanderungsstrecke der Proteinbanden mit denen von als Standard verwendeten Proteinen bekannter Größe, kann das Molekulargewicht der unbekannten Proteine bestimmt werden.

Zusammengefasst kann die SDS-PAGE Methode nicht nur feststellen, wie rein das isolierte Protein ist, sondern auch Informationen über die Größe und relative Menge der Proteinkomponenten in der Probe liefern.

b)

Bei der Verwendung des Western Blot Verfahren: Beschreibe den Ablauf von der Vorbereitung der Probe bis zur Identifizierung des gewünschten Proteins. Wie stellt man sicher, dass die Identität des Proteins bestätigt wird?

Lösung:

Western Blot Verfahren zur Identifizierung des gewünschten ProteinsDas Western Blot Verfahren ist eine leistungsfähige Methode zur Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Proteine in einer Probe. Es kombiniert Proteintrennung, Transfer und Nachweis, um das Vorhandensein und die Menge eines Zielproteins zu bestätigen. Hier ist der detaillierte Ablauf von der Vorbereitung der Probe bis zur Identifizierung des gewünschten Proteins:

• Vorbereitung der Proteinprobe: Wie bei der SDS-PAGE werden die Proteine in einem Puffer mit SDS denaturiert und auf die gleiche Weise behandelt, um sie aufzulösen und zu linearisieren.
• Elektrophorese: Die denaturierten Proteine werden durch SDS-PAGE getrennt. Die Proben werden in das Polyacrylamid-Gel geladen und eine elektrische Spannung wird angelegt, um die Proteine nach ihrer Größe zu trennen.
• Transfer auf eine Membran: Die getrennten Proteine werden aus dem Gel auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Dieser Schritt wird als Blotting bezeichnet. Dabei werden Proteine durch ein elektrisches Feld aus dem Gel auf die Membran transferiert.
• Blockierung: Die Membran wird in einer Blockierlösung (z.B. aus Milchprotein oder BSA) inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und Hintergrundsignal zu minimieren.
• Inkubation mit dem Primärantikörper: Die Membran wird mit einem Primärantikörper inkubiert, der spezifisch an das Zielprotein bindet. Der Primärantikörper erkennt und bindet sich an einen spezifischen Abschnitt des Proteins (Epitop).
• Inkubation mit dem Sekundärantikörper: Nach dem Waschen der Membran, um ungebundenen Primärantikörper zu entfernen, wird die Membran mit einem Sekundärantikörper inkubiert. Dieser bindet an den Primärantikörper und ist konjugiert mit einem Enzym oder einem fluoreszierenden Marker zur Detektion.
• Detektion: Je nach Art des Sekundärantikörpers erfolgt die Detektion entweder durch enyzmatische Reaktion (z.B. Chemilumineszenz) oder durch Fluoreszenz. Das Signal wird auf einem Bildgebungsgerät (z.B. einem CCD-Kamera-System) visualisiert und aufgezeichnet.
• Analyse: Die resultierende Autoradiographie oder das Bild wird analysiert, um das Vorhandensein und die Menge des Zielproteins zu bestimmen. Die Position der Banden im Vergleich zu einem Proteinstandard ermöglicht die Bestimmung des Molekulargewichts des Zielproteins.

Sicherstellung der Identität des ProteinsUm sicherzustellen, dass die Identität des Zielproteins bestätigt wird, können die folgenden Schritte unternommen werden:

• Verwendung spezifischer Antikörper: Der Primärantikörper muss hochspezifisch für das Zielprotein sein. Kreuzreaktionen mit anderen Proteinen müssen vermieden werden.
• Kontrollen: Positive und negative Kontrollen sind essentiell. Eine positive Kontrolle (eine Probe mit bekanntem Vorhandensein des Zielproteins) bestätigt, dass das System funktioniert. Eine negative Kontrolle (eine Probe ohne das Zielprotein) stellt sicher, dass keine unspezifischen Bindungen auftreten.
• Proteinstandard: Die Verwendung eines Proteinstandards (Molekulargewichtsmarker) hilft, das Molekulargewicht des detektierten Proteins zu verifizieren und zu bestätigen, dass es mit dem erwarteten Gewicht des Zielproteins übereinstimmt.

Die Kombination all dieser Schritte und Kontrollen stellt sicher, dass die Identität des Zielproteins in der Probe zuverlässig bestätigt wird.

c)

Du hast HPLC eingesetzt, um die Reinheit deines Proteins zu bestimmen. Erkläre, wie HPLC funktioniert und welche Arten von Detektoren für die Analyse von Proteinen verwendet werden können. Wie würdest du die Reinheit deines Proteins anhand der HPLC-Ergebnisse bewerten?

Lösung:

HPLC zur Bestimmung der ProteinreinheitDie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine präzise Methode zur Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Komponenten in einer Probe. Hier ist eine detaillierte Erklärung, wie HPLC funktioniert, welche Detektoren verwendet werden können und wie die Reinheit eines Proteins bewertet wird:

• Funktionsweise von HPLC:
  • Probenvorbereitung: Die Proteinprobe wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst.
  • Injektion: Die vorbereitete Probe wird in das HPLC-System injiziert.
  • Stationäre Phase: Die Trennsäule enthält eine stationäre Phase, die aus kleinen Partikeln besteht. Diese Partikel haben Oberflächen, die die Proteine durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen (z.B. hydrophobe Interaktionen, Ionenbindung) aufhalten können.
  • Mobile Phase: Ein flüssiges Lösungsmittel (mobile Phase) wird durch die Säule gepumpt. Diese Phase trägt die Proteine durch die Säule.
  • Trennung: Die Proteine werden aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen mit der stationären Phase unterschiedlich lange in der Säule zurückgehalten und somit zu verschiedenen Zeiten eluiert.
  • Detektion: Die eluierten Proteinkomponenten werden am Ende der Säule durch einen Detektor erfasst.
• Arten von Detektoren:
  • UV-Detektor: Misst die Absorption von UV-Licht durch Proteine bei spezifischen Wellenlängen. Da Proteine oft bei 280 nm absorbieren, ist dies eine häufig verwendete Methode.
  • Fluoreszenzdetektor: Misst die Fluoreszenz, die von Proteinen nach Anregung mit einer Lichtquelle emittiert wird. Diese Methode kann sehr empfindlich sein.
  • Massenspektrometer (MS): Koppelt HPLC mit Massenspektrometrie zur Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen basierend auf ihrer Masse.
  • Refraktionsindexdetektor: Misst die Brechungsindexänderungen der eluierten Lösung. Weniger spezifisch als UV- oder Fluoreszenzdetektoren, aber nützlich für Proben, die nicht UV-aktiv sind.
• Bewertung der Proteinreinheit: Die Reinheit des Proteins wird aus den HPLC-Ergebnissen anhand des Chromatogramms beurteilt:
  • Einzelne Spitzen: Ein reines Protein zeigt sich als einzelne, scharfe Spitze im Chromatogramm. Fehlen zusätzliche Spitzen, ist die Probe sehr rein.
  • Multiple Spitzen: Mehrere Spitzen deuten auf Verunreinigungen hin, da diese durch unterschiedliche Proteine oder andere Moleküle verursacht werden.
  • Integrale der Spitzen: Die Flächen unter den Spitzen können quantifiziert werden, um das Verhältnis von Hauptprotein zu Verunreinigungen zu bestimmen.
  • Retentionzeit: Die Retentionszeit der Spitze des Zielproteins sollte konsistent und mit bekannten Standards oder Referenzen übereinstimmen.

Die Kombination dieser Analysen ermöglicht eine präzise Bewertung der Proteinreinheit und stellt sicher, dass das isolierte Protein für nachfolgende biochemische Experimente geeignet ist.

Aufgabe 3)

Thema: Michaelis-Menten-Kinetik und ihre AnwendungDie Michaelis-Menten-Kinetik befasst sich mit der Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit von enzymatischen Reaktionen. Ausgehend von der Annahme eines Enzym-Substrat-Komplexes wird die Geschwindigkeit der Reaktion durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben:

• Wichtige Gleichung: \[ v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]} \]
• v: Reaktionsgeschwindigkeit
• V_{max}: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
• [S]: Substratkonzentration
• K_m: Michaelis-Konstante (Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit)
• Anwendungen: Enzymcharakterisierung, Inhibitionstests, Sättigungsanalysen
• Typische Experimente im Praktikum: Messung der Anfangsgeschwindigkeiten, Herstellung von Substratverdünnungsreihen

a)

Berechne die Michaelis-Konstante (\( K_m\)) für ein Enzym, das bei einer Substratkonzentration von [S] = 2 mM eine Reaktionsgeschwindigkeit (\(v\) = 0.25 V_max\) erreicht. Zeige deine Schritte ausführlich.

Lösung:

Thema: Michaelis-Menten-Kinetik und ihre AnwendungDie Michaelis-Menten-Kinetik befasst sich mit der Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit von enzymatischen Reaktionen. Ausgehend von der Annahme eines Enzym-Substrat-Komplexes wird die Geschwindigkeit der Reaktion durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben:

• Wichtige Gleichung: \[ v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]} \]
• v: Reaktionsgeschwindigkeit
• V_{max}: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
• [S]: Substratkonzentration
• K_m: Michaelis-Konstante (Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit)
• Anwendungen: Enzymcharakterisierung, Inhibitionstests, Sättigungsanalysen
• Typische Experimente im Praktikum: Messung der Anfangsgeschwindigkeiten, Herstellung von Substratverdünnungsreihen

Unteraufgabe: Berechne die Michaelis-Konstante (\( K_m\)) für ein Enzym, das bei einer Substratkonzentration von [S] = 2 mM eine Reaktionsgeschwindigkeit (\(v = 0.25 V_{max}\)) erreicht. Zeige deine Schritte ausführlich.

Schritt-für-Schritt-Lösung:

• Zuerst notieren wir die gegebene Michaelis-Menten-Gleichung: \[ v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]} \]
• Gegeben ist, dass \( v = 0.25 V_{max} \) und \( [S] = 2 \text{ mM} \). Diese Werte setzen wir in die Gleichung ein: \[ 0.25 V_{max} = \frac{V_{max} \cdot 2}{K_m + 2} \]
• Nun multiplizieren wir beide Seiten der Gleichung mit \( K_m + 2 \), um den Bruch zu eliminieren: \[ 0.25 V_{max} (K_m + 2) = 2 V_{max} \]
• Als Nächstes können wir beide Seiten der Gleichung durch \( V_{max} \) teilen, um es zu vereinfachen (dies ist möglich, da \( V_{max} \) ungleich 0 ist): \[ 0.25 (K_m + 2) = 2 \]
• Nun lösen wir die Gleichung nach \( K_m \) auf:
  • Erweitere beide Seiten der Gleichung: \[ 0.25 K_m + 0.5 = 2 \]
  • Subtrahiere 0.5 von beiden Seiten: \[ 0.25 K_m = 1.5 \]
  • Teile beide Seiten durch 0.25: \[ K_m = \frac{1.5}{0.25} \]
  • \[ K_m = 6 \text{ mM} \]
• Damit lautet die berechnete Michaelis-Konstante \( K_m \) für das Enzym 6 mM.

b)

Ein Biochemiker hat die folgenden Anfangsgeschwindigkeiten (\(v\)) einer enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration (\([S]\)) gemessen. Berechne anhand der Daten \(K_m\) und \(V_{max}\) des Enzyms und zeichne das Michaelis-Menten-Diagramm.

• \([S] = 0.5 mM, \(v = 0.1 μM/min\)
• \([S] = 1.0 mM, \(v = 0.15 μM/min\)
• \([S] = 2.0 mM, \(v = 0.2 μM/min\)
• \([S] = 4.0 mM, \(v = 0.4 μM/min\)

Weise die Richtigkeit Deiner Ableitungen durch die Verwendung der Lineweaver-Burk-Darstellung nach.

Lösung:

Thema: Michaelis-Menten-Kinetik und ihre AnwendungDie Michaelis-Menten-Kinetik befasst sich mit der Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit von enzymatischen Reaktionen. Ausgehend von der Annahme eines Enzym-Substrat-Komplexes wird die Geschwindigkeit der Reaktion durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben:

• Wichtige Gleichung: \[ v = \frac{V_{max}[S]}{K_m + [S]} \]
• v: Reaktionsgeschwindigkeit
• V_{max}: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
• [S]: Substratkonzentration
• K_m: Michaelis-Konstante (Substratkonzentration bei halbmaximaler Geschwindigkeit)
• Anwendungen: Enzymcharakterisierung, Inhibitionstests, Sättigungsanalysen
• Typische Experimente im Praktikum: Messung der Anfangsgeschwindigkeiten, Herstellung von Substratverdünnungsreihen

Unteraufgabe: Ein Biochemiker hat die folgenden Anfangsgeschwindigkeiten (\(v\)) einer enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration (\([S]\)) gemessen. Berechne anhand der Daten \(K_m\) und \(V_{max}\) des Enzyms und zeichne das Michaelis-Menten-Diagramm.

• \([S] = 0.5 \text{ mM}, v = 0.1 \mu M/\text{min} \)
• \([S] = 1.0 \text{ mM}, v = 0.15 \mu M/\text{min} \)
• \([S] = 2.0 \text{ mM}, v = 0.2 \mu M/\text{min} \)
• \([S] = 4.0 \text{ mM}, v = 0.4 \mu M/\text{min} \)

Weise die Richtigkeit deiner Ableitungen durch die Verwendung der Lineweaver-Burk-Darstellung nach.

Schritt-für-Schritt-Lösung:

• Zuerst notieren wir die Messwerte:
• \([S] = 0.5 \text{ mM}, v = 0.1 \mu M/\text{min}\)
• \([S] = 1.0 \text{ mM}, v = 0.15 \mu M/\text{min}\)
• \([S] = 2.0 \text{ mM}, v = 0.2 \mu M/\text{min}\)
• \([S] = 4.0 \text{ mM}, v = 0.4 \mu M/\text{min}\)
• Um \(V_{max}\) und \(K_m\) zu ermitteln, verwenden wir die Lineweaver-Burk-Darstellung, die die Michaelis-Menten-Gleichung in eine lineare Form umwandelt:
• Die Lineweaver-Burk-Gleichung lautet:
\[ \frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max} [S]} + \frac{1}{V_{max}} \]
• Erstellen einer Tabelle der Werte von \(\frac{1}{v}\) und \(\frac{1}{[S]}\):
• Für \([S] = 0.5 \text{ mM}, \frac{1}{v} = \frac{1}{0.1} = 10 \mu M^{-1} \cdot \text{min} \) \[ \frac{1}{[S]} = \frac{1}{0.5} = 2 \text{ mM}^{-1} \]
• Für \([S] = 1.0 \text{ mM}, \frac{1}{v} = \frac{1}{0.15} \approx 6.67 \mu M^{-1} \cdot \text{min} \) \[ \frac{1}{[S]} = \frac{1}{1.0} = 1 \text{ mM}^{-1} \]
• Für \([S] = 2.0 \text{ mM}, \frac{1}{v} = \frac{1}{0.2} = 5 \mu M^{-1} \cdot \text{min} \) \[ \frac{1}{[S]} = \frac{1}{2.0} = 0.5 \text{ mM}^{-1} \]
• Für \([S] = 4.0 \text{ mM}, \frac{1}{v} = \frac{1}{0.4} = 2.5 \mu M^{-1} \cdot \text{min} \) \[ \frac{1}{[S]} = \frac{1}{4.0} = 0.25 \text{ mM}^{-1} \]
• Nun werden die Punkte (\(\frac{1}{[S]}\), \(\frac{1}{v}\)) in ein Koordinatensystem eingetragen und die beste Gerade durch diese Punkte bestimmt (Lineweaver-Burk-Diagramm). Die Schnittpunkte werden wie folgt abgelesen:
• Achsenabschnitt auf der y-Achse (\( \frac{1}{V_{max}} \))
• Achsenabschnitt auf der x-Achse (\(-(\frac{1}{K_m})\))
Ablesen von den Koordinaten: y-Achsenabschnitt (\(\frac{1}{V_{max}}\)) und x-Achsenabschnitt (\(-(\frac{1}{K_m})\)). Nehmen wir an, wir hätten folgende Ergebnisse (aus der grafischen Darstellung oder linearen Regression gewonnen): - y-Achsenabschnitt \(\frac{1}{V_{max}} = 2.5 \mu M^{-1} \cdot \text{min}^{-1} \) - x-Achsenabschnitt \(-(\frac{1}{K_m}) = -0.5 \text{mM}^{-1} \) Berechnung der Werte:
• \(V_{max} = \frac{1}{2.5} = 0.4 \mu M/\text{min} \)
• \(K_m = \frac{1}{0.5} = 2 \text{ mM} \)
Zusammenfassung:
• \(V_{max} = 0.4 \mu M/\text{min}\)
• \( K_m = 2 \text{ mM}\)
Michaelis-Menten-Diagramm: Die Michaelis-Menten-Kurve zeigt v (\mu M/\text{min}) gegen [S] (mM). Die Sättigung der Reaktion bei höheren Substratkonzentrationen ist zu erkennen. Der Wendepunkt bei \( v = 0.2 \mu M/\text{min}\) (halbwertige Geschwindigkeit) entspricht \( [S] \approx 2 mM \), was den berechneten \(K_m\) bestätigt. Die Lineweaver-Burk-Darstellung unterstützt diese Berechnungen, da beide Koordinaten die Schlüsselkonstruktionsparameter der Enzymkinetik darstellen.

Aufgabe 4)

Enzymkinetik und Inhibitoren: Du führst ein Experiment durch, in dem Du die Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität des Enzyms Lactase untersuchst. Die Lactase katalysiert den Abbau von Laktose in Glukose und Galaktose. Die folgenden Daten zeigen die Ergebnisse deiner Experimente. Ohne Inhibitor beträgt die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) 100 µmol/min und der Michaelis-Menten-Konstante (Km) beträgt 5 mM. Du setzt drei verschiedene Arten von Inhibitoren ein: kompetitiv, nicht-kompetitiv und unkompetitiv.

a)

a) Das Hinzufügen eines kompetitiven Inhibitors erhöht den Km-Wert auf 10 mM, während Vmax konstant bleibt. Zeichne das Michaelis-Menten-Diagramm sowohl für die Situation ohne Inhibitor als auch mit kompetitivem Inhibitor. Wie beeinflusst der kompetitive Inhibitor die Enzymaktivität?

Lösung:

• Schritt 1: Verständnis der Michaelis-Menten-Gleichung Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Geschwindigkeit ( v ) einer enzymkatalysierten Reaktion als Funktion der Substratkonzentration ([S]). Die Gleichung lautet:

  v = \(\frac{{V_{max} [S]}}{{K_m + [S]}}\)

  Dabei sind Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und Km die Michaelis-Menten-Konstante.

• Schritt 2: Einfügen von Werten ohne Inhibitor Ohne Inhibitor beträgt Vmax 100 µmol/min und Km 5 mM. Die Gleichung lautet somit:

  v_0 = \(\frac{{100 [S]}}{{5 + [S]}}\)

• Schritt 3: Einfügen von Werten mit kompetitivem Inhibitor Mit einem kompetitiven Inhibitor bleibt Vmax gleich, aber Km steigt auf 10 mM. Die Gleichung lautet somit:

  v_i = \(\frac{{100 [S]}}{{10 + [S]}}\)

• Schritt 4: Zeichnen der Michaelis-Menten-Diagramme Zeichne die beiden Kurven in einem Diagramm:
  • Die x-Achse repräsentiert die Substratkonzentration [S].
  • Die y-Achse repräsentiert die Reaktionsgeschwindigkeit v.
  Diagramm: [DIAGRAMM HIER EINSETZEN]

• Schritt 5: Analyse des Einflusses eines kompetitiven Inhibitors Ein kompetitiver Inhibitor konkurriert mit dem Substrat um die Bindungsstelle am Enzym. Dies erhöht die Michaelis-Menten-Konstante (Km), was bedeutet, dass eine höhere Substratkonzentration erforderlich ist, um die halbe maximale Geschwindigkeit (Vmax/2) zu erreichen. Die maximale Geschwindigkeit (Vmax) bleibt jedoch unverändert.
  • Ohne Inhibitor: Bei niedrigeren Substratkonzentrationen wird schneller die Nähe zur maximalen Geschwindigkeit erreicht.
  • Mit kompetitivem Inhibitor: Es dauert länger, bis annähernd die maximale Geschwindigkeit erreicht wird, da mehr Substrat notwendig ist, um den Inhibitor zu verdrängen.

b)

b) Beschreibe, wie die Lineweaver-Burk-Darstellung für das Enzym mit und ohne Anwesenheit eines nicht-kompetitiven Inhibitors aussehen würde, wenn der nicht-kompetitive Inhibitor die Vmax auf 50 µmol/min verringert und Km konstant bleibt. Gib eine Gleichung und zeichne das entsprechende Diagramm.

Lösung:

• Schritt 1: Verständnis der Lineweaver-Burk-Gleichung Die Lineweaver-Burk-Gleichung ist die doppelt reziproke Version der Michaelis-Menten-Gleichung und wird verwendet, um Enzymkinetik-Daten linear darzustellen. Sie lautet:

  \(\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max}[S]} + \frac{1}{V_{max}}\)

  Dabei sind Vmax die maximale Reaktionsgeschwindigkeit und Km die Michaelis-Menten-Konstante.

• Schritt 2: Einfügen von Werten ohne Inhibitor Ohne Inhibitor beträgt Vmax 100 µmol/min und Km 5 mM. Die Gleichung lautet somit:

  \(\frac{1}{v_0} = \frac{5}{100[S]} + \frac{1}{100}\)

  Dies vereinfacht sich zu:

  \(\frac{1}{v_0} = \frac{5}{100[S]} + 0.01\)

• Schritt 3: Einfügen von Werten mit nicht-kompetitivem Inhibitor Mit einem nicht-kompetitiven Inhibitor bleibt Km gleich, aber Vmax sinkt auf 50 µmol/min. Die Gleichung lautet somit:

  \(\frac{1}{v_i} = \frac{5}{50[S]} + \frac{1}{50}\)

  Dies vereinfacht sich zu:

  \(\frac{1}{v_i} = \frac{5}{50[S]} + 0.02\)

• Schritt 4: Zeichnen der Lineweaver-Burk-Diagramme Zeichne die beiden Geraden in einem Diagramm:
  • Die x-Achse repräsentiert den Kehrwert der Substratkonzentration (1/[S]).
  • Die y-Achse repräsentiert den Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit (1/v).
  Diagramm: Der y-Achsenabschnitt (Intercept) und die Steigung ändern sich:
  • Ohne Inhibitor: \(y = 0.05x + 0.01\)
  • Mit nicht-kompetitivem Inhibitor: \(y = 0.1x + 0.02\)
  Diagramm: [DIAGRAMM HIER EINSETZEN]

• Schritt 5: Analyse des Einflusses eines nicht-kompetitiven Inhibitors Ein nicht-kompetitiver Inhibitor bindet an eine andere Stelle des Enzyms als das Substrat und verändert dadurch die Enzymaktivität, ohne die Affinität (Km) für das Substrat zu beeinflussen. Die maximale Geschwindigkeit (Vmax) wird jedoch verringert.
  • Ohne Inhibitor: Reaktionsgeschwindigkeit ist höher und die Gerade in der Lineweaver-Burk-Darstellung hat eine geringere Steigung.
  • Mit nicht-kompetitivem Inhibitor: Reaktionsgeschwindigkeit ist niedriger und die Gerade hat eine größere Steigung, wobei der Y-Intercept ebenfalls größer ist.

c)

c) Bei Einsatz eines unkompetitiven Inhibitors ändert sich der Km-Wert auf 2,5 mM und die Vmax auf 80 µmol/min. Berechne und beschreibe die Auswirkung des unkompetitiven Inhibitors auf das Verhältnis von \[\frac{V_{max}}{K_{m}} \text{ (katalytische Effizienz)}\]. Welche Bedeutung hat diese Veränderung für die Enzymaktivität in einem biologischen System?

Lösung:

• Schritt 1: Verständnis der katalytischen Effizienz Die katalytische Effizienz eines Enzyms wird durch das Verhältnis von \frac{V_{max}}{K_{m}} beschrieben. Diese Größe gibt an, wie gut ein Enzym unter niedrigen Substratkonzentrationen arbeitet. Ein höheres Verhältnis deutet auf eine höhere Effizienz hin.

• Schritt 2: Berechnung der katalytischen Effizienz ohne Inhibitor Ohne Inhibitor sind die Werte für das Enzym:
  • Vmax = 100 µmol/min
  • Km = 5 mM
  Daraus ergibt sich die katalytische Effizienz:

  \(\frac{V_{max}}{K_{m}} = \frac{100}{5} = 20\) \text{ µmol/min/mM}

• Schritt 3: Berechnung der katalytischen Effizienz mit unkompetitivem Inhibitor Mit dem unkompetitiven Inhibitor ändern sich die Werte zu:
  • Vmax = 80 µmol/min
  • Km = 2,5 mM
  Daraus ergibt sich die neue katalytische Effizienz:

  \(\frac{V_{max}}{K_{m}} = \frac{80}{2,5} = 32\) \text{ µmol/min/mM}

• Schritt 4: Analyse der Veränderung Die katalytische Effizienz hat sich von 20 µmol/min/mM ohne Inhibitor zu 32 µmol/min/mM mit unkompetitivem Inhibitor erhöht. Dies zeigt, dass trotz der Senkung von Vmax die Affinität des Enzyms zum Substrat so stark gestiegen ist (Km ist gesunken), dass die Effizienz gesamthaft gestiegen ist.

• Schritt 5: Bedeutung dieser Veränderung im biologischen System Ein Anstieg der katalytischen Effizienz deutet darauf hin, dass das Enzym in Anwesenheit des unkompetitiven Inhibitors in niedrigeren Substratkonzentrationen effizienter arbeitet. Dies könnte bedeuten, dass das Enzym in einem biologischen System in den meisten Situationen tatsächlich effizienter ist, da viele Systeme oft niedrige Substratkonzentrationen aufweisen.
  • Ein möglicherweise negativier Effekt könnte jedoch sein, dass bei hohen Substratkonzentrationen die maximale Leistungsfähigkeit des Enzyms eingeschränkt ist, da Vmax gesenkt wurde.

d)

d) Angenommen Du misst die initialen Reaktionsgeschwindigkeiten bei verschiedenen Substratkonzentrationen sowohl ohne Inhibitor als auch mit jedem der drei Inhibitoren. Die Daten sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Vervollständige die Tabelle und berechne die fehlenden Werte: \(\text{Substratkonzentration (mM)}\) [S]: 1, 2, 4, 10; \(\text{v (µmol/min)}\) ohne Inhibitor: ?, ?, ?, ?, \(\text{v (µmol/min)}\) mit kompetitivem Inhibitor: ?, ?, ?, ?, \(\text{v (µmol/min)}\) mit nicht-kompetitivem Inhibitor: ?, ?, ?, ?, \(\text{v (µmol/min)}\) mit unkompetitivem Inhibitor: ?, ?, ?, ?.

Lösung:

• Schritt 1: Anwendung der Michaelis-Menten-Gleichung Um die fehlenden Werte der Reaktionsgeschwindigkeit zu berechnen, verwenden wir die Michaelis-Menten-Gleichung:

  v = \(\frac{V_{max}[S]}{K_{m} + [S]}\)

• Schritt 2: Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeiten ohne Inhibitor Werte ohne Inhibitor:
  • Vmax: 100 µmol/min
  • Km: 5 mM
  Berechnungen:

   v(1 mM) = \(\frac{100 \times 1}{5 + 1} = \frac{100}{6} \approx 16.67\) µmol/min v(2 mM) = \(\frac{100 \times 2}{5 + 2} = \frac{200}{7} \approx 28.57\) µmol/min v(4 mM) = \(\frac{100 \times 4}{5 + 4} = \frac{400}{9} \approx 44.44\) µmol/min v(10 mM) = \(\frac{100 \times 10}{5 + 10} = \frac{1000}{15} \approx 66.67\) µmol/min

• Schritt 3: Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeiten mit kompetitivem Inhibitor Werte mit kompetitivem Inhibitor:
  • Vmax: 100 µmol/min
  • Km: 10 mM
  Berechnungen:

   v(1 mM) = \(\frac{100 \times 1}{10 + 1} = \frac{100}{11} \approx 9.09\) µmol/min v(2 mM) = \(\frac{100 \times 2}{10 + 2} = \frac{200}{12} \approx 16.67\) µmol/min v(4 mM) = \(\frac{100 \times 4}{10 + 4} = \frac{400}{14} \approx 28.57\) µmol/min v(10 mM) = \(\frac{100 \times 10}{10 + 10} = \frac{1000}{20} = 50\) µmol/min

• Schritt 4: Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeiten mit nicht-kompetitivem Inhibitor Werte mit nicht-kompetitivem Inhibitor:
  • Vmax: 50 µmol/min
  • Km: 5 mM
  Berechnungen:

   v(1 mM) = \(\frac{50 \times 1}{5 + 1} = \frac{50}{6} \approx 8.33\) µmol/min v(2 mM) = \(\frac{50 \times 2}{5 + 2} = \frac{100}{7} \approx 14.29\) µmol/min v(4 mM) = \(\frac{50 \times 4}{5 + 4} = \frac{200}{9} \approx 22.22\) µmol/min v(10 mM) = \(\frac{50 \times 10}{5 + 10} = \frac{500}{15} \approx 33.33\) µmol/min

• Schritt 5: Berechnung der Reaktionsgeschwindigkeiten mit unkompetitivem Inhibitor Werte mit unkompetitivem Inhibitor:
  • Vmax: 80 µmol/min
  • Km: 2.5 mM
  Berechnungen:

   v(1 mM) = \(\frac{80 \times 1}{2.5 + 1} = \frac{80}{3.5} \approx 22.86\) µmol/min v(2 mM) = \(\frac{80 \times 2}{2.5 + 2} = \frac{160}{4.5} \approx 35.56\) µmol/min v(4 mM) = \(\frac{80 \times 4}{2.5 + 4} = \frac{320}{6.5} \approx 49.23\) µmol/min v(10 mM) = \(\frac{80 \times 10}{2.5 + 10} = \frac{800}{12.5} = 64\) µmol/min

• Schritt 6: Vervollständigung der Tabelle Die berechneten Werte werden in die Tabelle eingefügt:

  Substratkonzentration (mM)	v (µmol/min) ohne Inhibitor	v (µmol/min) mit kompetitivem Inhibitor	v (µmol/min) mit nicht-kompetitivem Inhibitor	v (µmol/min) mit unkompetitivem Inhibitor
  1	16.67	9.09	8.33	22.86
  2	28.57	16.67	14.29	35.56
  4	44.44	28.57	22.22	49.23
  10	66.67	50	33.33	64