Biochemisches Praktikum II - Cheatsheet

Grundlegende Schritte der Proteinaufreinigung

Definition:

Basisprozeduren zur Trennung und Reinheitserhöhung von Proteinen aus einer biologischen Matrix.

Details:

• Lyse: Zellaufschluss, z.B. durch Ultraschall oder chemische Mittel
• Fällung: Proteinfällung durch Salz (z.B. Ammoniumsulfat)
• Dialyse: Entfernung kleiner Moleküle durch semipermeable Membran
• Chromatographie: Trennung nach Größe (Gelfiltration), Ladung (Ionenaustausch), Hydrophobizität (Hydrophobe Interaktion) oder spezifischer Bindung (Affinitätschromatographie)
• Elektrophorese: Auftrennung nach Größe und Ladung im Gel (z.B. SDS-PAGE)
• Ultrazentrifugation: Trennung basierend auf Dichte

Michaelis-Menten-Gleichung und ihre Bedeutung

Definition:

Mathematische Beschreibung der Kinetik enzymatischer Reaktionen. V0 = (Vmax * [S]) / (Km + [S]).

Details:

• Vmax: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
• [S]: Substratkonzentration
• Km: Michaelis-Konstante; Substratkonzentration bei der die Hälfte von Vmax erreicht ist
• Anwendung: Bestimmung von enzymatischen Parametern

Größenausschlusschromatographie und ihre Anwendung

Definition:

Trennt Moleküle basierend auf Größe und Form, nicht Wechselwirkungen.

Details:

• Pufferlösung zum Transport von Molekülen.
• Verwendet poröse, gepackte Harzsäulen.
• Kleine Moleküle passieren durch Poren und haben längere Laufzeiten, große Moleküle umgehen Poren und eluieren schneller.
• Elutionsvolumen (\textit{V}_e) korreliert mit Molekülgröße.
• Anwendung in Proteinreinigung, Entsalzung, Bestimmung des Molekulargewichts.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ihre Variationen

Definition:

PCR: Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen. Variationen: Anpassungen zur Verbesserung von Spezifität, Effizienz und Anwendbarkeit.

Details:

• Grundprinzip: Denaturierung, Annealing, Elongation
• Benötigt: DNA-Matrize, Primer, DNA-Polymerase, dNTPs, Puffer
• Variationen: qPCR (quantitativ), RT-PCR (Reverse Transkriptase), Multiplex-PCR (mehrere Zielsequenzen), Digital Droplet PCR (ddPCR, hohe Sensitivität)
• Wichtig: Primer-Design, Optimierung der Reaktionsbedingungen
• Anwendungen: Genotypisierung, Klonen, Nachweis von Pathogenen

Massenspektrometrie zur Charakterisierung von Proteinen

Definition:

Technik zur Bestimmung der Masse und Sequenz von Peptiden und Proteinen

Details:

• Proteolyse: Proteine in Peptide zerlegen (z.B. Trypsin)
• Ionisation: Peptide ionisieren (z.B. ESI, MALDI)
• Analyse: Ionen nach Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) im Massenspektrometer trennen
• Detektion: Ionen mittels Detektor messen
• Sequenzierung: Peptidsequenzen aus Massenspektren ableiten (MS/MS)
• Datenbankabgleich: Identifikation durch Vergleich mit Proteindatenbanken

Unterschiedliche Hemmungsarten bei enzymatischen Reaktionen

Definition:

Enzymhemmungen klassifiziert nach Art der Interaktion mit Enzym oder Substrat, beeinflussen Enzymaktivität und Kinetik.

Details:

• Kompetitive Hemmung: Inhibitor konkurriert mit Substrat um Bindung an aktives Zentrum. Erhöht den scheinbaren K_m-Wert, V_max bleibt unverändert.
• Unkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet nur an den Enzym-Substrat-Komplex. Erniedrigt den scheinbaren K_m und V_max.
• Nichtkompetitive Hemmung: Inhibitor bindet an Enzym unabhängig von Substratbindung. V_max erniedrigt, K_m bleibt unverändert.
• Mischhemmung: Inhibitor kann an das freie Enzym oder den Enzym-Substrat-Komplex binden. Beeinflusst sowohl V_max als auch K_m.
• Allosterische Hemmung: Inhibitor bindet an eine andere Stelle als das aktive Zentrum, verändert Konformation des Enzyms.

Fluoreszenzspektroskopie zur Analyse von Biomolekülen

Definition:

Fluoreszenzspektroskopie analysiert die Fluoreszenz von Biomolekülen und liefert Informationen über Struktur und Dynamik.

Details:

• Prinzip: Anregung von Molekülen mit Licht bestimmter Wellenlänge, Emission von Licht bei längerer Wellenlänge
• Fluorophor: fluoreszierendes Molekül oder Protein
• Anwendungen: Proteinstruktur, Bindungsstudien, Interaktionsanalyse
• Parameter: Emissionsspektrum, Quantenausbeute, Lebensdauer
• FRET (Förster-Resonanzenergietransfer): Technik zur Untersuchung von Molekülinteraktionen

Datenauswertung und -anpassung bei Enzymkinetikexperimenten

Definition:

Resultate von Enzymkinetikexperimenten mithilfe von mathematischen Modellen und Anpassungsmethoden analysieren, um kinetische Parameter (z.B. Km, Vmax) zu ermitteln

Details:

• Michaelis-Menten-Gleichung: \[ v = \frac{{V_{max} [S]}}{{K_m + [S]}} \]
• Lineweaver-Burk-Diagramm: Doppelt-reziproke Darstellung der Michaelis-Menten-Gleichung, um Km und Vmax zu bestimmen \[ \frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{max} [S]} + \frac{1}{V_{max}} \]
• Hanes-Woolf-Diagramm: \[ \frac{[S]}{v} = \frac{[S]}{V_{max}} + \frac{K_m}{V_{max}} \]
• Eadie-Hofstee-Diagramm: \[ v = V_{max} - K_m \left( \frac{v}{[S]} \right) \]
• nicht-lineare Anpassungsmethoden zur Parameterbestimmung (z.B. Michaelis-Menten-Fit)
• Fehleranalyse und Güte des Fits bewerten (z.B. R²-Wert, Residuenanalyse)