Biochemisches Praktikum II - Exam

Aufgabe 1)

Du befindest Dich in einem Labor und hast den Auftrag erhalten, ein unbekanntes Protein aus einer Zellkultur zu isolieren und zu reinigen. Die folgenden Schritte und Techniken stehen Dir zur Verfügung: Zellaufschluss durch Ultraschall, Proteinfällung mit Ammoniumsulfat, Dialyse, verschiedene Chromatographie-Techniken (Gelfiltration, Ionenaustausch, Hydrophobe Interaktion, Affinitätschromatographie), Elektrophorese (SDS-PAGE), und Ultrazentrifugation. Beschreibe und rechtfertige jeden einzelnen Schritt und seine Reihenfolge, die Du zur Isolierung und Reinigung des Proteins anwenden würdest, und begründe Deine Wahl der Methoden im Detail.

a)

1. Beschreibe detailliert, wie Du die Zellaufschluss-Phase durchführst und welche Bedingungen (z.B. Ultraschallparameter) Du wählst. Berücksichtige dabei die möglichen Folgen für die Integrität der Proteine.

Lösung:

Zellaufschluss-Phase: Durchführung und Bedingungen

• Vorbereitung der Zellkultur:
  • Zuerst müssen die Zellen aus der Kultur geerntet werden. Dies erfolgt üblicherweise durch Zentrifugation, um die Zellen von dem Kulturmedium zu trennen.
  • Die Zellen werden in einem geeigneten Puffer resuspendiert, beispielsweise einem Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS), die die Zellen schützt und optimale Bedingungen für den anschließenden Aufschluss bietet.
• Durchführung des Zellaufschlusses durch Ultraschall:
  • Geräteauswahl: Ein Ultraschallhomogenisator wird verwendet, um die Zellmembranen mechanisch zu zerstören und den Zellinhalt freizusetzen.
  • Ultraschallparameter:
    • Frequenz: Ein typischer Bereich liegt zwischen 20 und 25 kHz. Diese Frequenz ist wirksam für das Zerlegen der Zellmembranen, während das Risiko einer Überhitzung und Denaturierung der Proteine minimiert wird.
    • Dauer der Bestrahlung: Normalerweise werden Pulse von 30 Sekunden bis 1 Minute verwendet, gefolgt von Ruhephasen, um eine Überhitzung zu vermeiden. Der gesamte Prozess dauert etwa 3-5 Minuten in Intervallen.
    • Leistung: Die Leistung sollte in einem moderaten Bereich liegen (z.B. 50-70 Watt), um die Zellaufschluss-Effizienz zu maximieren und gleichzeitig die Integrität der Proteine zu bewahren.
  • Kühlung: Während des Ultraschalls wird die Probenlösung auf Eis gehalten, um eine Überhitzung zu verhindern, die zur Denaturierung der Proteine führen könnte.
  • Nebenwirkungen: Es ist wichtig, die Proben regelmäßig zu überprüfen, da übermäßige Ultraschallbehandlung zu Proteinabbau oder Denaturierung führen kann. Bei Anzeichen von Schaumbildung sollte die Ultraschallintensität reduziert werden.

Begründung für die Wahl der Methode:

• Effizienz: Der Ultraschallhomogenisator ist eine sehr effektive Methode, um Zellen aufzuschließen und den Zellinhalt freizusetzen. Er kann eine große Anzahl von Zellen in kurzer Zeit bearbeiten.
• Kontrollierbarkeit: Die Parameter (Frequenz, Dauer, Leistung) können genau eingestellt werden, um die Zellaufschluss-Bedingungen optimal an die jeweilige Zellkultur anzupassen und die Proteinintegrität zu schützen.
• Minimierung von Proteinabbau: Durch die Kontrolle der Kühlung und der Ultraschallintensität kann das Risiko einer Überhitzung und Denaturierung der Proteine minimiert werden.

b)

2. Erkläre den Proteinfällungsprozess mit Ammoniumsulfat: Welche Rolle spielt die gesättigte Ammoniumsulfatlösung, und wie würdest Du die Proteinmenge messen, die während jeder Fällungsstufe gewonnen wird? Führe die notwendigen Berechnungen basierend auf einem Beispiel durch, bei dem Du 1 Liter einer 1 M Proteinlösung verwendest.

Lösung:

Proteinfällungsprozess mit AmmoniumsulfatDer Proteinfällungsprozess mit Ammoniumsulfat wird verwendet, um Proteine durch den Entzug von Wasser aus der Lösung zu präzipitieren. Dabei wird die Löslichkeit von Proteinen durch die Erhöhung der Ionenstärke in der Lösung reduziert.

• Rolle der gesättigten Ammoniumsulfatlösung: Die gesättigte Ammoniumsulfatlösung wird schrittweise zur Proteinlösung hinzugefügt, um die Fällung zu kontrollieren. Durch die Erhöhung der Ionenstärke wird das Wasser von den Proteinoberflächen verdrängt, wodurch die Proteine aggregieren und ausfallen. Dieser Prozess wird oft in mehreren Stufen durchgeführt, um selektiv Proteine mit unterschiedlichen Löslichkeiten zu präzipitieren.
• Durchführung der Fällung:
  • 1. Schritt: Erstelle eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung (ca. 4.1 M bei 25°C).
  • 2. Schritt: Füge die gesättigte Ammoniumsulfatlösung schrittweise zu der 1 M Proteinlösung hinzu. Zum Beispiel, füge Ammoniumsulfat hinzu, um eine Endkonzentration von 30 % Sättigung zu erreichen, danach 50 %, 70 % und 90 %.
  • 3. Schritt: Nach jeder Fällungsstufe die Lösung zentrifugieren, um die ausgefällten Proteine abzutrennen.
  • 4. Schritt: Entferne den Überstand und resuspensiere das Pellet in einem geeigneten Puffer.
• Messung der Proteinmenge: Die Proteinmenge während jeder Fällungsstufe kann mittels UV-Vis-Spektrophotometrie (z.B. bei 280 nm für absorbierende Proteine) oder durch die Durchführung eines Bradford-Assays gemessen werden.
  • 1. Beispielberechnung:
    • Angenommen, wir haben 1 Liter einer 1 M Proteinlösung.
    • 0-30 % Sättigung: Füge 176 g Ammoniumsulfat zu (berechnet auf Basis der Tabelle oder nomogramm).
    • Messe die Menge des ausgefällten Proteins. Angenommen, die A280 beträgt 0,5: Dies kann mit einer Standardkurve korreliert werden, um die Proteinmenge zu bestimmen, z.B., 0,5 A280 = 0,25 mg/ml.
    • Die Proteinmenge in 1 Liter ist dann 0,25 mg/ml * 1000 ml = 250 mg.
  • 2. Wiederhole diesen Prozess für die 30-50 %-, 50-70 %-, und 70-90 %-Fällungsstufen und messe die Proteinmengen bei jeder Stufe.

Begründung:Die Fällung mit Ammoniumsulfat ermöglicht es, Zielproteine von anderen zellulären Proteinen und Verunreinigungen zu trennen, basierend auf ihren unterschiedlichen Löslichkeiten. Diese Methode ist kostengünstig und kann große Volumina verarbeiten. Indem die Fällung in mehreren Stufen durchgeführt wird, kann eine fraktionierte Isolierung erreicht werden, was die Reinheit des Zielproteins erhöht.

c)

3. Diskutiere die Bedeutung der Dialyse nach der Proteinfällung und die Auswahlkriterien für die semipermeable Membran. Wie würdest Du überprüfen, ob die Dialyse erfolgreich war?

Lösung:

Dialyse nach der Proteinfällung: Bedeutung und DurchführungDie Dialyse spielt eine wesentliche Rolle nach der Proteinfällung, indem sie kleine Moleküle wie Ammoniumionen und Sulfationen aus der Proteinlösung entfernt, während größere Proteinmoleküle zurückgehalten werden. Dies verbessert die Reinheit und Stabilität der Proteinlösung für nachfolgende Reinigungsschritte.

• Bedeutung der Dialyse:
  • Entfernung kleiner Moleküle: Ammoniumsulfat und andere kleine Verunreinigungen werden aus der Lösung entfernt, um die Reinheit des Proteins zu erhöhen.
  • Schutz der Proteinintegrität: Eine hohe Ionenstärke kann die Proteinfunktion beeinträchtigen. Die Dialyse stellt sicher, dass die Proteine in einem geeigneten Puffer für weitere Analysen und Reinigungsschritte resuspendiert werden.
• Auswahlkriterien für die semipermeable Membran:
  • Molekulargewichts-Cutoff (MWCO): Die Membran sollte einen geeigneten Cutoff haben, der kleiner als das Zielproteinmolekulargewicht ist, aber groß genug, um die kleinen Moleküle zu passieren. Zum Beispiel, wenn das Zielprotein ein Molekulargewicht von 50 kDa hat, könnte eine Membran mit einem MWCO von 10 kDa verwendet werden.
  • Kompatibilität mit Pufferlösungen: Die Membran sollte chemisch stabil und kompatibel mit den verwendeten Pufferlösungen sein, um den Dialyseprozess effizient zu gestalten.
  • Mechanische Stabilität: Die Membran muss robust genug sein, um während des Dialyseprozesses intakt zu bleiben.
• Durchführung der Dialyse:
  • 1. Die Proteinlösung wird in einen Dialyseschlauch gegeben, der zuvor mit dem Dialysepuffer gewaschen wurde.
  • 2. Der Dialyseschlauch wird in einen großen Behälter mit dem Dialysepuffer (z.B. PBS oder ein anderer geeigneter Puffer) gelegt. Der Puffer sollte regelmäßig gewechselt werden, um den Konzentrationsgradienten aufrechtzuerhalten.
  • 3. Der Dialyseprozess wird üblicherweise über Nacht oder länger durchgeführt, bis der Austausch der kleinen Moleküle abgeschlossen ist.
• Überprüfung des Dialyseerfolgs:
  • Leitfähigkeitsmessung: Die Leitfähigkeit der Lösung kann vor und nach der Dialyse gemessen werden. Eine signifikante Reduktion der Leitfähigkeit deutet auf die Entfernung der Ionen hin.
  • SDS-PAGE: Eine Probe der dialysierten Lösung kann mittels SDS-PAGE analysiert werden, um die Anwesenheit und Reinheit des Proteins zu evaluieren. Die Abwesenheit von niedermolekularen Banden deutet auf eine erfolgreiche Entfernung kleiner Moleküle hin.
  • UV-Vis-Spektrophotometrie: Die Absorptionsspektren vor und nach der Dialyse können verglichen werden, um die Entfernung der Ammoniumsulfat-Ionen zu bestätigen, die bei bestimmten Wellenlängen absorbieren.

Begründung:Die Dialyse nach der Proteinfällung stellt sicher, dass die Lösung rein und für weitere Schritte geeignet ist. Die Entfernung von Ammonium- und Sulfationen verbessert die Löslichkeit und Stabilität des Proteins, wodurch die nachfolgenden Reinigungstechniken effektiver eingesetzt werden können.

d)

4. Wähle eine Chromatographietechnik (Gelfiltration, Ionenaustausch, Hydrophobe Interaktion oder Affinitätschromatographie) zur weiteren Reinigung des Proteins und rechtfertige Deine Wahl. Beschreibe den prinzipiellen Ablauf der von Dir gewählten Technik und detaillierte Bedingungen (z.B. Pufferzusammensetzung, Säulenmaterial).

Lösung:

Auswahl und Durchführung der Chromatographietechnik: IonenaustauschchromatographieIch wähle die Ionenaustauschchromatographie für die weitere Reinigung des Proteins. Diese Technik ist besonders effektiv, um Proteine basierend auf ihren Ladungseigenschaften zu trennen, und kann eine hohe Reinheit und Ausbeute liefern.

• Begründung der Wahl:
  • Effektivität: Die Ionenaustauschchromatographie eignet sich hervorragend für die Trennung von Proteinen mit unterschiedlichen Isoelektrischen Punkten (pI).
  • Flexibilität: Durch Anpassung des pH-Werts und der Ionenstärke des Puffers kann die Trennung optimal an das Zielprotein angepasst werden.
  • Reinheit: Die Methode kann zur Gewinnung hochreiner Proteine verwendet werden, indem Verunreinigungen, die ähnliche Größen aber unterschiedliche Ladungen besitzen, effektiv entfernt werden.
• Prinzipieller Ablauf der Ionenaustauschchromatographie:
  • Säulenmaterial:
    • Verwendung einer Säule mit einem Ionenaustauscherharz, beispielsweise DEAE (Diethylaminoethyl)-Sepharose für Anionenaustausch oder CM (Carboxymethyl)-Sepharose für Kationenaustausch.
    • Wähle das Harz entsprechend dem pI des Zielproteins: Anionenaustauscher für Proteine mit einem pI unter dem pH des Puffers, Kationenaustauscher für Proteine mit einem pI über dem pH des Puffers.
  • Vorbereitung der Säule:
    • Packen der Säule mit dem entsprechenden Ionenaustauscherharz.
    • Equilibrieren der Säule mit einem Startpuffer, dessen pH und Ionenstärke an die Bedingungen der Trennungen angepasst ist (z.B. 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 für Anionenaustausch).
  • Auftragen der Proteinprobe: Die dialysierte Proteinlösung wird auf die equilibrated Säule aufgetragen. Da die Proteine basierend auf ihrer Ladung interagieren, werden sie an die Säule gebunden oder durchfließen.
  • Elutionsstrategie:
    • Die gebundenen Proteine werden durch schrittweise oder lineare Elution mittels eines Gradientens der Ionenstärke (z.B. NaCl) oder pH-Elution eluiert.
    • Z.B.: Schrittgradient von 0 bis 1 M NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  • Sammeln der Fraktionen: Die eluierenden Fraktionen werden in definierten Volumina gesammelt und anschließend auf ihre Proteinmenge und Reinheit getestet.
• Detaillierte Bedingungen:
  • Säulenmaterial: DEAE-Sepharose für Anionenaustausch, mit einem geeigneten Matrixvolumen (z.B., 10 mL).
  • Pufferzusammensetzung:
    • Startpuffer: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5.
    • Elutionspuffer: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5 mit 0-1 M NaCl in linearem oder stufenweisem Gradient.
• Überprüfung des Reinigungserfolgs:
  • Analyse der Fraktionen durch SDS-PAGE zur Bestimmung der Reinheit und des Molekulargewichts des Proteins.
  • Bestimmung der Proteinaktivität in den Fraktionen, falls eine Funktionalitätsprüfung des Proteins erforderlich ist.
  • UV-Vis-Spektrophotometrie zur Quantifizierung der Proteinmenge in den Fraktionen.

Zusammenfassung:Die Ionenaustauschchromatographie ist eine ausgezeichnete Wahl für die Trennung und Reinigung von Proteinen basierend auf ihren Ladungseigenschaften. Durch die sorgfältige Auswahl der Säulenmaterialien und Pufferbedingungen sowie die Überprüfung des Reinigungserfolgs durch verschiedene analytische Methoden, kann eine hochreine Proteinlösung gewonnen werden, die für nachfolgende Experimente und Anwendungen geeignet ist.

Aufgabe 2)

Michaelis-Menten-Gleichung und ihre Bedeutung:Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt die Kinetik enzymatischer Reaktionen durch die Formel:

V_0 = \frac{{V_{max} \cdot [S]}}{{K_m + [S]}}

• Vmax: Maximale Reaktionsgeschwindigkeit
• [S]: Substratkonzentration
• Km: Michaelis-Konstante; Substratkonzentration bei der die Hälfte von Vmax erreicht ist

Die Michaelis-Menten-Gleichung wird verwendet, um enzymatische Parameter wie Vmax und Km zu bestimmen.

a)

a) In einem biochemischen Experiment wird die Anfangsgeschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration gemessen. Die folgenden Daten wurden ermittelt:

[S] (mM)	V0 (µmol/min)
0.1	0.9
0.5	3.2
1.0	4.8
2.0	5.8
5.0	6.5

Erstelle ein Michaelis-Menten-Diagramm, indem Du die Anfangsgeschwindigkeit V0 gegen die Substratkonzentration [S] aufträgst.

Lösung:

Lösung:Um ein Michaelis-Menten-Diagramm zu erstellen, müssen wir die Anfangsgeschwindigkeit (V_0) gegen die Substratkonzentration ([S]) auftragen. Die gegebenen Daten sind:

[S] (mM)	V0 (µmol/min)
0.1	0.9
0.5	3.2
1.0	4.8
2.0	5.8
5.0	6.5

Zunächst importieren wir die notwendigen Bibliotheken und plotten die Daten in Python.

import matplotlib.pyplot as plt# Gegebene Datensubstratkonzentration = [0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0]anfangsgeschwindigkeit = [0.9, 3.2, 4.8, 5.8, 6.5]# Diagramm erstellenplt.plot(substratkonzentration, anfangsgeschwindigkeit, marker='o', linestyle='-', color='b')plt.xlabel('Substratkonzentration [S] (mM)')plt.ylabel('Anfangsgeschwindigkeit V0 (µmol/min)')plt.title('Michaelis-Menten-Diagramm')plt.grid(True)plt.show()

Dieses Skript verwendet die matplotlib-Bibliothek in Python, um die Daten zu visualisieren.Hier ist, was jeder Schritt im Code macht:

• import matplotlib.pyplot as plt: Importiert die matplotlib-Bibliothek für das Plotten von Diagrammen.
• substratkonzentration = [0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0]: Enthält die Substratkonzentrationsdaten.
• anfangsgeschwindigkeit = [0.9, 3.2, 4.8, 5.8, 6.5]: Enthält die Anfangsgeschwindigkeitsdaten.
• plt.plot(...): Plottet die Daten.
• plt.xlabel('Substratkonzentration [S] (mM)'): Setzt das Label der x-Achse.
• plt.ylabel('Anfangsgeschwindigkeit V0 (µmol/min)'): Setzt das Label der y-Achse.
• plt.title('Michaelis-Menten-Diagramm'): Setzt den Titel des Diagramms.
• plt.grid(True): Fügt ein Gitter zum Diagramm hinzu.
• plt.show(): Zeigt das Diagramm an.

Mit diesem Diagramm können wir visuell erkennen, wie die Anfangsgeschwindigkeit V_0 von der Substratkonzentration [S] abhängt, was ein wesentlicher Bestandteil des Verständnisses der enzymatischen Reaktionskinetik nach der Michaelis-Menten-Gleichung ist.

b)

b) Bestimme die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) aus dem in Teil a) erstellten Diagramm numerisch. Erkläre die Bedeutung der gefundenen Werte im Kontext enzymatischer Kinetik.

Lösung:

Lösung:Teil b:Um die Michaelis-Konstante (Km) und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit (Vmax) aus den Daten numerisch zu bestimmen, verwenden wir die Lineweaver-Burk-Darstellung. Diese Methode transformiert die Michaelis-Menten-Gleichung in eine lineare Form, wobei die Achsen invers dargestellt werden.Michaelis-Menten-Gleichung:

V_0 = \frac{V_{max} \cdot [S]}{K_m + [S]}

Lineweaver-Burk-Transformation:

\frac{1}{V_0} = \frac{K_m}{V_{max} \cdot [S]} + \frac{1}{V_{max}}

Um die Werte für Km und Vmax zu bestimmen, können wir die gemessenen Daten in die Lineweaver-Burk-Form umwandeln, eine lineare Regression durchführen und die Parameter extrahieren.Schritte zur Berechnung:

• Berechne \(\frac{1}{V_0}\) für jede gemessene Anfangsgeschwindigkeit.
• Berechne \(\frac{1}{[S]}\) für jede gemessene Substratkonzentration.

Gegebene Daten:

[S] (mM)	V0 (µmol/min)
0.1	0.9
0.5	3.2
1.0	4.8
2.0	5.8
5.0	6.5

Python-Code zur Durchführung der Berechnungen:

import numpy as np from scipy import stats import matplotlib.pyplot as plt# Gegebene Daten substrate_concentration = [0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0] initial_velocity = [0.9, 3.2, 4.8, 5.8, 6.5]# Berechnungen inverse_substrate_concentration = [1.0 / s for s in substrate_concentration] inverse_initial_velocity = [1.0 / v for v in initial_velocity]# Lineare Regression slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(inverse_substrate_concentration, inverse_initial_velocity)# K_m und V_max berechnen V_max = 1 / intercept K_m = slope * V_max# Diagramm erstellen plt.plot(inverse_substrate_concentration, inverse_initial_velocity, 'o', label='Daten') plt.plot(inverse_substrate_concentration, np.array(inverse_substrate_concentration) * slope + intercept, 'r', label='Lineare Regression') plt.xlabel('1/[S] (mM^-1)') plt.ylabel('1/V0 (min/µmol)') plt.title('Lineweaver-Burk-Diagramm') plt.legend() plt.grid(True) plt.show()# Ergebnisse ausdrucken slope, intercept, V_max, K_m 

Bedeutung der gefundenen Werte:

• K_m (Michaelis-Konstante): Diese Konstante gibt die Substratkonzentration an, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit die Hälfte von V_max erreicht. Ein niedriger K_m-Wert bedeutet eine hohe Affinität des Enzyms für das Substrat.
• V_max (Maximale Reaktionsgeschwindigkeit): Dieser Wert repräsentiert die theoretisch maximale Geschwindigkeit, die erreicht wird, wenn das Enzym vollständig gesättigt ist (d.h., wenn die Substratkonzentration sehr hoch ist).

Durch das Verständnis dieser Konstanten kann die Effizienz und Kapazität eines Enzyms bei der Katalyse einer Reaktion besser beschrieben werden.

Aufgabe 3)

Die Größenausschlusschromatographie (GPC) trennt Moleküle basierend auf ihrer Größe und Form, ohne dass Wechselwirkungen mit der stationären Phase stattfinden. Eine Pufferlösung dient dabei als Transportmedium für die Moleküle. GPC verwendet poröse, gepackte Harzsäulen, durch die die Moleküle durchwandern. Kleine Moleküle können in die Poren der Harzpartikel eindringen und haben dadurch eine längere Laufzeit, während große Moleküle die Poren umgehen und schneller eluieren. Das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) ist dabei umgekehrt proportional zur Molekülgröße. Die Anwendungen der GPC umfassen unter anderem die Proteinreinigung, Entsalzung und die Bestimmung des Molekulargewichts von Proteinen.

a)

Erkläre, wie das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) mit der Größe der Moleküle zusammenhängt und was dies in Bezug auf die Trennung von Biomolekülen bedeutet.

Lösung:

Die Größenausschlusschromatographie (GPC) trennt Moleküle basierend auf ihrer Größe und Form, ohne dass Wechselwirkungen mit der stationären Phase stattfinden. Eine Pufferlösung dient dabei als Transportmedium für die Moleküle. Hierbei wird das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) als wichtigster Parameter betrachtet.

Zusammenhang zwischen Elutionsvolumen (\textit{V}_e) und der Größe der Moleküle:

• Kleine Moleküle: Diese können in die Poren der Harzpartikel eindringen. Dadurch haben sie einen längeren Aufenthaltsweg innerhalb der Säule und benötigen mehr Zeit, um eluieren zu können. Dies führt zu einem höheren Elutionsvolumen (\textit{V}_e).
• Große Moleküle: Diese sind zu groß, um in die Poren der Harzpartikel einzudringen. Sie wandern daher schneller durch die Säule, da sie den direkten Weg nehmen. Dies führt zu einem geringeren Elutionsvolumen (\textit{V}_e).

Dies bedeutet, dass das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) umgekehrt proportional zur Größe der Moleküle ist:

Je größer das Molekül, desto kleiner das Elutionsvolumen (\textit{V}_e).

Implikationen für die Trennung von Biomolekülen:

• Effizienz der Trennung: Da große Moleküle schneller eluieren und kleine Moleküle länger in der Säule verbleiben, können Moleküle basierend auf ihrer Größe effektiv getrennt werden. Dies ermöglicht eine präzise Trennung von Biomolekülen unterschiedlicher Größe.
• Proteinreinigung: Bei der Reinigung von Proteinen können Verunreinigungen, die sich in der Größe unterscheiden, effizient getrennt werden. Große Proteinmoleküle erscheinen in den frühen Fraktionen, während kleinere Verunreinigungen später eluieren.
• Bestimmung des Molekulargewichts: Durch Kalibrierung der GPC-Säule mit Standards bekannter Molekülgrößen kann das Molekulargewicht unbekannter Proteine aus ihrem Elutionsvolumen (\textit{V}_e) bestimmt werden. Dies ist besonders nützlich in der biochemischen Forschung.
• Entsalzung: In der GPC können Biomoleküle von kleinen Salzionen getrennt werden. Während die großen Biomoleküle zuerst eluieren, folgen die kleineren Salzionen später, was die Entfernung von Salzen aus Proteinproben ermöglicht.

Zusammengefasst bietet die Größenausschlusschromatographie (GPC) eine effektive Methode zur Trennung und Analyse von Biomolekülen verschiedener Größen. Das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) dient hierbei als entscheidender Indikator für die Molekülgröße.

b)

In einem Experiment werden drei Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten (20 kDa, 50 kDa, und 100 kDa) durch Größenausschlusschromatographie getrennt. Ordne die Proteine basierend auf ihrem Elutionsvolumen (\textit{V}_e) von klein zu groß und begründe Deine Antwort.

Lösung:

In einem Experiment, bei dem drei Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten (20 kDa, 50 kDa und 100 kDa) durch Größenausschlusschromatographie (GPC) getrennt werden, lässt sich die Reihenfolge ihres Elutionsvolumens (\(V_e\)) bestimmen, basierend auf der Größe der Moleküle.

Da das Elutionsvolumen (\(V_e\)) umgekehrt proportional zur Größe der Moleküle ist, bedeutet dies, dass größere Moleküle schneller durch die Säule wandern und daher ein geringeres Elutionsvolumen haben, während kleinere Moleküle langsamer wandern und ein größeres Elutionsvolumen haben.

Reihenfolge der Proteine basierend auf ihrem Elutionsvolumen (\(V_e\)) von klein zu groß:

• Das Protein mit dem höchsten Molekulargewicht (100 kDa) eluieren zuerst und hat daher das kleinste Elutionsvolumen.
• Das Protein mit einem mittleren Molekulargewicht (50 kDa) eluieren nach dem 100 kDa Protein und hat daher ein größeres Elutionsvolumen als dieses, aber kleiner als das Protein mit 20 kDa.
• Das Protein mit dem niedrigsten Molekulargewicht (20 kDa) eluieren zuletzt und hat daher das größte Elutionsvolumen.

Begründung:

• 100 kDa Protein: Da dieses Protein am größten ist, kann es die Poren der Harzpartikel kaum oder gar nicht betreten und wandert daher am schnellsten durch die Säule. Dies führt zu einem kleineren Elutionsvolumen (\(V_e\)).
• 50 kDa Protein: Dieses Protein hat eine mittlere Größe und kann teilweise in die Poren der Harzsäule eindringen, wodurch es langsamer als das 100 kDa Protein, aber schneller als das 20 kDa Protein eluieren wird. Daher hat es ein mittleres Elutionsvolumen.
• 20 kDa Protein: Da dieses Protein das kleinste ist, kann es leicht in die Poren der Harzpartikel eindringen und wird aufgrund seines längeren Aufenthalts in der Säule am langsamsten wandern, was zu einem größeren Elutionsvolumen führt.

Zusammengefasst ergibt sich die Reihenfolge der Proteine basierend auf ihrem Elutionsvolumen (\(V_e\)) von klein zu groß wie folgt: 100 kDa < 50 kDa < 20 kDa.

c)

Du hast eine unbekannte Proteinprobe und bestimmst mittels Größenausschlusschromatographie das Elutionsvolumen (\textit{V}_e) dieser Probe. Beschreibe die Schritte, die nötig sind, um das Molekulargewicht dieses unbekannten Proteins zu bestimmen.

Lösung:

Die Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins mittels Größenausschlusschromatographie (GPC) erfordert eine systematische Vorgehensweise. Hier sind die Schritte, die Du befolgen musst:

Schritte zur Bestimmung des Molekulargewichts eines unbekannten Proteins:

• Säulenkalibrierung: Zuerst muss die GPC-Säule kalibriert werden. Dazu werden Standards von Proteinen mit bekannten Molekulargewichten durch die Säule eluiert. Die Elutionsvolumina (\(V_e\)) dieser Standards werden aufgezeichnet.
• Erstellen der Kalibrierkurve: Die Elutionsvolumina (\(V_e\)) der bekannten Proteine werden gegen die logarithmischen Werte ihrer Molekulargewichte aufgetragen. Dies ergibt eine Kalibrierkurve, die typischerweise eine lineare Beziehung zeigt.
• Analyse der unbekannten Proteinprobe: Die unbekannte Proteinprobe wird durch die gleiche GPC-Säule eluiert, und das Elutionsvolumen (\(V_e\)) wird gemessen.
• Bestimmung des Molekulargewichts: Das gemessene Elutionsvolumen (\(V_e\)) der unbekannten Proteinprobe wird auf der Kalibrierkurve eingezeichnet. Der entsprechende logarithmische Wert des Molekulargewichts des unbekannten Proteins wird aus der Kurve abgelesen.
• Berechnung: Schließlich wird der logarithmische Wert des Molekulargewichts in das tatsächliche Molekulargewicht umgerechnet.

Zusammengefasst ergibt sich die Reihenfolge der Schritte:

• Säulenkalibrierung mit Standards bekannter Molekulargewichte durchführen.
• Kalibrierkurve erstellen, indem \(V_e\) gegen die logarithmischen Werte der Molekulargewichte der Standards aufgetragen werden.
• Das Elutionsvolumen (\(V_e\)) des unbekannten Proteins messen.
• Das gemessene \(V_e\) auf der Kalibrierkurve einzeichnen, um den logarithmischen Wert des Molekulargewichts abzulesen.
• Den logarithmischen Wert in das tatsächliche Molekulargewicht umrechnen.

Durch die Verwendung dieser Schritte kannst Du das Molekulargewicht des unbekannten Proteins genau bestimmen.

d)

Ein Protein mit bekannter Größe wird zur Entsalzung mittels Größenausschlusschromatographie aufgetragen. Beschreibe den Mechanismus, wie die Salze von dem Protein getrennt werden und warum diese Trennung effektiv ist.

Lösung:

Wenn ein Protein mit bekannter Größe zur Entsalzung mittels Größenausschlusschromatographie (GPC) verwendet wird, erfolgt die Trennung der Salze vom Protein basierend auf der unterschiedlichen Größe der Moleküle. Dieser Mechanismus beruht auf der Tatsache, dass kleinere Moleküle wie Salze eine längere Laufzeit in der GPC-Säule haben, während größere Moleküle wie das Protein schneller eluieren. Hier ist eine detaillierte Beschreibung, wie diese Trennung erfolgt und warum sie effektiv ist:

Mechanismus der Trennung von Salzen mittels GPC:

• Einbringen der Probe: Die Proteinlösung, die Salze enthält, wird in die poröse, gepackte Harzsäule der GPC injiziert.
• Wanderung durch die Säule: Beim Durchwandern der Säule können die größeren Proteinmoleküle die inneren Poren der Harzpartikel nicht oder nur teilweise betreten und nehmen dadurch einen direkteren und schnelleren Weg durch die Säule.
• Elution des Proteins: Weil die Proteine größer als die Salze sind, eluieren sie schneller aus der Säule heraus und erscheinen in den frühen Fraktionen. Diese Fraktionen enthalten die gereinigten Proteinmoleküle.
• Wanderung der Salze: Die kleineren Salzionen dringen leicht in die Poren der Harzpartikel ein und haben dadurch einen längeren und verzweigteren Wanderungsweg durch die Säule. Dies führt dazu, dass die Salze später eluieren als die Proteinmoleküle.
• Elution der Salze: Die Salze eluieren in den späteren Fraktionen, die nach den Proteinfraktionen gesammelt werden. Diese späteren Fraktionen enthalten die entfernten Salze.

Warum diese Trennung effektiv ist:

• Größenabhängige Trennung: Da die GPC die Moleküle ausschließlich nach ihrer Größe trennt und weder Protein noch Salze in relevanter Weise mit der stationären Phase interagieren, ist die Methode sehr zuverlässig und reproduzierbar.
• Genauigkeit und Reinheit: Die Methode erlaubt eine präzise Trennung von Proteinen und Salzen. Bereits in den frühesten Elutionsfraktionen kann das zu reinigende Protein gesammelt werden, während die kleineren Verunreinigungen wie Salze in späteren Fraktionen auftauchen.
• Schonende Behandlung: Die GPC ist eine sanfte Methode, die keine schädlichen chemischen Reagenzien oder hohe Temperaturen verwendet, was besonders wichtig für die Integrität und Aktivität empfindlicher Proteine ist.
• Vielseitigkeit: Verschiedene Proteine und Salzkonzentrationen können mit minimaler Anpassung der Methode behandelt werden, was sie zu einer flexiblen Wahl für verschiedene biochemische Anwendungen macht.

Zusammengefasst ist die Größenausschlusschromatographie ein effektiver und zuverlässiger Mechanismus zur Trennung von Salzen von Proteinen, da sie auf der molekularen Größe beruht und eine saubere Trennung ohne chemische Modifikation ermöglicht.

Aufgabe 4)

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ihre VariationenDie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine grundlegende Technik zur Amplifikation spezifischer DNA-Sequenzen. Das Verfahren besteht aus den drei Hauptphasen: Denaturierung, Annealing und Elongation. Für die Durchführung werden wesentliche Komponenten wie DNA-Matrize, Primer, DNA-Polymerase, dNTPs und Puffer benötigt. Es existieren verschiedene Variationen der PCR, die an spezifische Anforderungen angepasst sind, darunter qPCR für quantitative Analysen, RT-PCR für die Analyse von RNA mittels einer vorgelagerten Reverse Transkription, Multiplex-PCR für die gleichzeitige Amplifikation mehrerer Zielsequenzen, und Digital Droplet PCR (ddPCR) für extrem hohe Sensitivität. Wichtige Faktoren wie das Primer-Design und die Optimierung der Reaktionsbedingungen spielen eine entscheidende Rolle. Anwendungen umfassen Genotypisierung, Klonen und den Nachweis von Pathogenen.

a)

(a) Erkläre den grundlegenden Ablauf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und beschreibe die Bedeutung jeder der drei Hauptphasen (Denaturierung, Annealing, Elongation) im Kontext der DNA-Amplifikation.

Lösung:

• Denaturierung: In der Denaturierungsphase wird die Doppelstrang-DNA durch Erhitzen auf etwa 94-98°C in zwei Einzelstränge getrennt. Diese hohe Temperatur bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren auf. Diese Phase ist entscheidend, da nur Einzelstränge als Matrizen für die Synthese neuer DNA dienen können.
• Annealing (Primer-Hybridisierung): Während der Annealing-Phase wird die Temperatur auf etwa 50-65°C gesenkt, wodurch die spezifischen Primer an ihre komplementären Sequenzen auf den Einzelstrang-DNA-Matrizen binden können. Primer sind kurze DNA-Abschnitte, die als Startpunkte für die DNA-Polymerase dienen. Dieser Schritt ist wichtig, da die genaue Bindung der Primer die Spezifität der PCR bestimmt.
• Elongation (Verlängerung): In der Elongationsphase, die bei etwa 72°C stattfindet, synthetisiert die DNA-Polymerase (normalerweise Taq-Polymerase) einen neuen DNA-Strang durch Hinzufügen von dNTPs (Desoxynukleotid-Triphosphaten) an das 3'-Ende des Primers. Diese Phase verlängert die DNA und verdoppelt die Zielsequenz. Dies ist der eigentliche DNA-Amplifikationsprozess.
• Der gesamte PCR-Zyklus (Denaturierung, Annealing, Elongation) wird typischerweise 25-35 Mal wiederholt, was zur exponentiellen Vervielfältigung der Ziel-DNA-Sequenz führt.

b)

(b) Was sind die kritischen Faktoren für ein erfolgreiches Primer-Design bei der PCR und welche Auswirkungen könnten schlecht gestaltete Primer auf das Ergebnis der Reaktion haben? Gehe detailliert auf mindestens drei dieser Faktoren ein.

Lösung:

• Primerlänge: Die Länge der Primer sollte in der Regel zwischen 18-25 Basenpaaren liegen. Zu kurze Primer können unspezifisch an nicht-zielgerichteten Sequenzen binden, während zu lange Primer ineffizient sein können und die Effizienz der Amplifikation verringern könnten. Eine optimale Länge stellt sicher, dass die Primer nur an die gewünschte Zielsequenz binden und nicht an ähnliche, nicht-zielgerichtete DNA-Stellen.
• Schmelztemperatur (Tm): Die Schmelztemperatur der Primer sollte zwischen 50-60°C liegen und die Tm-Werte der beiden Primer (Forward und Reverse) sollten nicht mehr als 2-3°C voneinander abweichen. Eine ähnliche Tm stellt sicher, dass beide Primer sich zur gleichen Zeit an die Ziel-DNA binden. Unterschiedliche Tm-Werte könnten dazu führen, dass ein Primer bindet, während der andere dies nicht tut, was die Effizienz und Spezifität der PCR beeinträchtigen kann.
• Spezifität: Primer sollten spezifisch für die Zielsequenz sein und keine signifikante Homologie zu anderen nicht-zielgerichteten Sequenzen im DNA-Template aufweisen. Unspezifische Bindungsstellen können zu unerwünschten Amplifikationsprodukten führen, was die Analyse und Interpretation der Ergebnisse erschwert.
• GC-Gehalt: Ein ausgewogener GC-Gehalt zwischen 40-60% ist optimal. Ein zu hoher GC-Gehalt könnte sekundäre Strukturen (wie Haarnadeln) innerhalb des Primers begünstigen, was die Effizienz der Bindung und der DNA-Synthese stören kann. Ein zu niedriger GC-Gehalt könnte die Stabilität der Primer-DNA-Bindungen verringern.
• Ein schlecht gestalteter Primer kann zu mehreren Problemen führen, darunter unspezifische Amplifikationsprodukte, geringe Ausbeute der gewünschten Zielsequenz, und Schwierigkeiten bei der Analyse der Ergebnisse. Daher ist eine sorgfältige Design- und Optimierungsphase entscheidend für den Erfolg einer PCR.

c)

(c) Vergleiche und kontrastiere die Digital Droplet PCR (ddPCR) mit der quantitativen PCR (qPCR). Fokussiere Dich dabei auf die Sensitivität, Genauigkeit und mögliche Anwendungsbereiche der beiden Methoden.

Lösung:

• Sensitivität:
  • Digital Droplet PCR (ddPCR): ddPCR verfügt über eine extrem hohe Sensitivität, da sie die DNA-Moleküle in Tausende von winzigen Tröpfchen aufteilt und die Amplifikation in jedem Tröpfchen unabhängig voneinander durchführt. So können selbst niedrigste Mengen von DNA nachgewiesen werden.
  • Quantitative PCR (qPCR): qPCR ist ebenfalls sehr sensitiv, jedoch ist ihre Sensitivität bei sehr niedrigen DNA-Konzentrationen geringer im Vergleich zu ddPCR. Dies liegt daran, dass der Nachweis in der Gesamtreaktionslösung erfolgt und nicht in isolierten Tröpfchen.
• Genauigkeit:
  • Digital Droplet PCR (ddPCR): Die ddPCR-Technik liefert hochgenaue quantitative Daten, indem sie absolute Kopienzahlen von DNA pro Volumeneinheit misst, unabhängig von Referenzstandards oder Kalibrierungskurven. Dies minimiert die Variabilität und erhöht die Reproduzierbarkeit.
  • Quantitative PCR (qPCR): qPCR ist ebenfalls genau, aber die Genauigkeit hängt stark von den verwendeten Standards und der Effizienz der PCR-Reaktion ab. Relative Quantifizierungen können variabler sein aufgrund potenzieller Unterschiede in der Effizienz der Amplifikation zwischen Proben und Referenzstandards.
• Anwendungsbereiche:
  • Digital Droplet PCR (ddPCR): ddPCR eignet sich hervorragend für Anwendungen, die eine hohe Sensitivität und Genauigkeit erfordern, wie z.B. die Erkennung seltener Mutationen, Kopienzahlvariationen (CNV) und Viruslastbestimmung. Es wird häufig in der Forschung und klinischen Diagnostik verwendet.
  • Quantitative PCR (qPCR): qPCR wird häufig für die quantitative Analyse der Genexpression, Viruslastbestimmung, Genotypisierung und Pathogen-Nachweis verwendet. Es findet Anwendung sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Diagnostik.

d)

(d) Berechne theoretisch die Anzahl der DNA-Kopien, die nach 30 Zyklen einer traditionellen PCR vorliegen würden, wenn die Ausgangsmenge der DNA eine Kopie beträgt. Gehe davon aus, dass die Effizienz der PCR bei jedem Zyklus 100% beträgt. Verwende die Formel \(N = N_0 \times 2^n\), wobei \(N\) die Endmenge der DNA, \(N_0\) die Ausgangsmenge und \(n\) die Anzahl der Zyklen sind.

Lösung:

• Um die theoretische Anzahl der DNA-Kopien nach 30 Zyklen einer traditionellen PCR zu berechnen, verwenden wir die Formel:
• \(N = N_0 \times 2^n\)
• \(N\) ist die Endmenge der DNA,
• \(N_0\) ist die Ausgangsmenge der DNA (in diesem Fall 1 Kopie),
• \(n\) ist die Anzahl der Zyklen (30 Zyklen).
• Setzt man die gegebenen Werte in die Formel ein, ergibt sich:
• \(N = 1 \times 2^{30}\)
• Berechnen wir nun die Endmenge:
• \(2^{30} = 1073741824\)
• Daher beträgt die theoretische Anzahl der DNA-Kopien nach 30 Zyklen, bei einer Ausgangsmenge von einer Kopie und einer Effizienz von 100%, genau 1.073.741.824 Kopien.