Humangenetik - Exam

Aufgabe 1)

Die DNA ist als Doppelhelix strukturiert und speichert die genetische Information. Jede Helix besteht aus Nukleotiden, die aus einem Phosphat, der Desoxyribose (einem Zucker) und einer der vier Basen Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) oder Guanin (G) bestehen. Die Basenpaare sind durch Wasserstoffbrücken verbunden: Adenin paart mit Thymin durch 2 Wasserstoffbrücken, und Cytosin paart mit Guanin durch 3 Wasserstoffbrücken. Der genetische Code wird durch Codons, also Drei-Basen-Sequenzen, bestimmt. Während der Replikation wird die DNA semikonservativ kopiert, wobei die DNA-Polymerase eine zentrale Rolle spielt. Die genetische Information wird durch Transkription in mRNA übertragen und anschließend durch Translation in Proteine umgewandelt. Zusätzlich spielen epigenetische Mechanismen wie die Methylierung der DNA und Histonmodifikationen eine Rolle bei der Regulation der Genexpression.

a)

a) Beschreibe detailliert den Prozess der DNA-Replikation, einschließlich der Rolle der DNA-Polymerase. Erkläre, warum die DNA-Replikation als semikonservativ bezeichnet wird.

Lösung:

Aufgabe: Beschreibe detailliert den Prozess der DNA-Replikation, einschließlich der Rolle der DNA-Polymerase. Erkläre, warum die DNA-Replikation als semikonservativ bezeichnet wird. Lösung:

• Einleitung zur DNA-Replikation: Die DNA-Replikation ist der Prozess, durch den die DNA in einer Zelle verdoppelt wird. Dies stellt sicher, dass jede Tochterzelle nach der Zellteilung eine vollständige Kopie des genetischen Materials erhält.
• Initiation: Der Prozess beginnt an spezifischen Stellen der DNA, die als Originen oder Replikationsursprünge bezeichnet werden. Proteine, die als Initiationsfaktoren bekannt sind, erkennen diese Originen und entwirren die DNA-Doppelhelix, wodurch eine Replikationsblase entsteht.
• Elongation: 1. Entwindung der Helix: Enzyme wie die Helikase lösen die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren und entwirren die Doppelhelix in zwei Einzelstränge. 2. Primase und Primer: Die Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die als Startpunkte für die DNA-Synthese dienen. 3. DNA-Polymerase: Die DNA-Polymerase fügt neue Nukleotide hinzu, die komplementär zu den bestehenden Matrizensträngen sind. Dies geschieht immer in 5' zu 3' Richtung. Die Leitstrang wird kontinuierlich synthetisiert, während der Folgestrang diskontinuierlich in Form von Okazaki-Fragmenten synthetisiert wird. 4. Ligase: Die DNA-Ligase verbindet die Okazaki-Fragmente zu einem durchgehenden Strang.
• Termination: Der Prozess endet, sobald die Replikationsgabeln aufeinandertreffen und sich die DNA vollständig verdoppelt hat.
• Semikonservative Replikation: Die DNA-Replikation wird als semikonservativ bezeichnet, weil jede der beiden resultierenden DNA-Moleküle aus einem ursprünglichen (alten) Strang und einem neuen, komplementären Strang besteht. Dieses Modell wurde durch die Experimente von Meselson und Stahl bestätigt und stellt sicher, dass die genetische Information genau und konsistent weitergegeben wird.
• Zusammenfassung: Die DNA-Replikation ist ein hochpräziser und zentraler Prozess in der Zellbiologie, der es den Zellen ermöglicht, genetisches Material zu kopieren und konsistent an die nächste Zellgeneration weiterzugeben. Die semikonservative Natur der Replikation garantiert, dass jede Tochterzelle eine genaue Kopie des genetischen Materials erhält.

b)

b) Gegeben sei eine DNA-Sequenz: 5'-ATCGTACG-3'. Gib die komplementäre DNA-Sequenz an und erläutere die spezifischen Basenpaarungen. Berechne die Anzahl der Wasserstoffbrücken in dieser Sequenz.

Lösung:

Aufgabe: Gegeben sei eine DNA-Sequenz: 5'-ATCGTACG-3'. Gib die komplementäre DNA-Sequenz an und erläutere die spezifischen Basenpaarungen. Berechne die Anzahl der Wasserstoffbrücken in dieser Sequenz. Lösung:

• Komplementäre DNA-Sequenz: Zum Erstellen der komplementären DNA-Sequenz verwenden wir die spezifischen Basenpaarregeln:
  • Adenin (A) paart mit Thymin (T) durch 2 Wasserstoffbrücken
  • Thymin (T) paart mit Adenin (A) durch 2 Wasserstoffbrücken
  • Cytosin (C) paart mit Guanin (G) durch 3 Wasserstoffbrücken
  • Guanin (G) paart mit Cytosin (C) durch 3 Wasserstoffbrücken
  Die komplementäre Sequenz zu 5'-ATCGTACG-3' lautet daher: 3'-TAGCATGC-5'
• Erklärung der spezifischen Basenpaarungen: Basenpaarungen erfolgen basierend auf der Wasserstoffbrückenbindung zwischen den Basen. In der komplementären DNA sequenzieren sich:
  • A (Adenin) paart mit T (Thymin): 2 Wasserstoffbrücken
  • T (Thymin) paart mit A (Adenin): 2 Wasserstoffbrücken
  • C (Cytosin) paart mit G (Guanin): 3 Wasserstoffbrücken
  • G (Guanin) paart mit C (Cytosin): 3 Wasserstoffbrücken
  Daher sieht die Basenpaarung für die gegebene Sequenz so aus:
  • A - T
  • T - A
  • C - G
  • G - C
  • T - A
  • A - T
  • C - G
  • G - C
• Anzahl der Wasserstoffbrücken: Zur Berechnung der Wasserstoffbrücken zählen wir jeweils die Brücken:
  • A - T: 2 Wasserstoffbrücken
  • T - A: 2 Wasserstoffbrücken
  • C - G: 3 Wasserstoffbrücken
  • G - C: 3 Wasserstoffbrücken
  • T - A: 2 Wasserstoffbrücken
  • A - T: 2 Wasserstoffbrücken
  • C - G: 3 Wasserstoffbrücken
  • G - C: 3 Wasserstoffbrücken
  Addition: (2 + 2 + 3 + 3 + 2 + 2 + 3 + 3 = 20 Wasserstoffbrücken) Die gesamte Anzahl der Wasserstoffbrücken in der gegebenen DNA-Sequenz beträgt somit 20 Wasserstoffbrücken.

Aufgabe 2)

Transkription und Translation sind wichtige Prozesse zur Umsetzung genetischer Information aus der DNA in Proteine. Während der Transkription im Zellkern wird aus einem DNA-Strang eine mRNA-Synthese durch RNA-Polymerase gefertigt. Dieser Vorgang beginnt mit der Initiation, bei der die RNA-Polymerase an die Promotorregion bindet, geht über in die Elongation, in der der RNA-Strang verlängert wird, und endet mit der Termination, bei der die RNA-Polymerase den synthetisierten RNA-Strang freisetzt. Die Translation hingegen findet an den Ribosomen statt. Hier wird die mRNA in eine Aminosäuresequenz, also ein Protein, umgewandelt. Die Translation beginnt mit der Initiation, in der das Ribosom an die mRNA bindet und das Startcodon erkennt. Darauf folgt die Elongation, bei der tRNA passende Aminosäuren zu den Codons der mRNA bringt, und abschließend die Termination, bei der ein Stopcodon erkannt und die Translation beendet wird.

a)

Beschreibe den Prozess der Transkription. Gehe dabei detailliert auf die Rolle der RNA-Polymerase und die einzelnen Schritte Initiation, Elongation und Termination ein.

Lösung:

Prozess der Transkription:Die Transkription ist der erste Schritt der Genexpression, bei dem die Information von der DNA in eine messenger-RNA (mRNA) umgeschrieben wird. Dieser Prozess findet im Zellkern statt und involviert mehrere Schritte: Initiation, Elongation und Termination.

• Initiation: Der Prozess beginnt mit der Bindung der RNA-Polymerase an die Promotorregion der DNA. Diese Region ist eine spezielle Sequenz, die das Startsignal für die Transkription gibt. Die RNA-Polymerase öffnet die Doppelhelix der DNA, sodass ein einzelner Strang als Matrize (Vorlage) dienen kann.
• Elongation: In der Elongationsphase bewegt sich die RNA-Polymerase entlang des DNA-Strangs in 3' zu 5'-Richtung, wobei sie komplementäre RNA-Nukleotide an die DNA-Vorlage anlagert und verknüpft. Die resultierende mRNA-Synthese erfolgt in 5' zu 3'-Richtung. Während dieses Prozesses wird der DNA-Doppelstrang vorübergehend geöffnet, und die neugebildete mRNA trennt sich kontinuierlich von der DNA ab.
• Termination: Die Transkription endet, sobald die RNA-Polymerase eine Terminatorsequenz der DNA erreicht. Diese Sequenz signalisiert das Ende der mRNA-Synthese. Nach dem Erreichen des Terminatorbereichs löst sich die RNA-Polymerase von der DNA und setzt die vollständig synthetisierte mRNA frei. Die DNA-Doppelhelix schließt sich wieder zu ihrer ursprünglichen Struktur.

Insgesamt spielt die RNA-Polymerase eine Schlüsselrolle bei der Transkription, da sie nicht nur die Promotorregion erkennt und bindet, sondern auch die Synthese der mRNA durch Verknüpfung der RNA-Nukleotide katalysiert und den korrekt gebildeten RNA-Strang freisetzt.

b)

Die Translation der mRNA in ein Protein ist ein weiterer essenzieller Schritt der Proteinsynthese. Beschreibe diesen Prozess und erläutere die Rolle des Ribosoms und der tRNA. Gehe dabei auf die einzelnen Schritte Initiation, Elongation und Termination ein.

Lösung:

Prozess der Translation:Die Translation ist der Schritt der Proteinsynthese, in dem die genetische Information der mRNA in eine Aminosäuresequenz, also in ein Protein, umgewandelt wird. Dieser Prozess findet an den Ribosomen statt und umfasst die Schritte Initiation, Elongation und Termination.

• Initiation: Der Prozess beginnt mit der Bindung des Ribosoms an die mRNA. Das Ribosom erkennt das Startcodon (meistens AUG) auf der mRNA, welches das Signal für den Beginn der Translation darstellt. Eine Initiator-tRNA, die die entsprechende Aminosäure (Methionin) trägt, bindet an das Startcodon. Das Ribosom besteht aus zwei Untereinheiten (klein und groß), wobei die kleine Untereinheit zunächst an die mRNA bindet und dann die große Untereinheit hinzukommt, um den Initiationskomplex zu vervollständigen.
• Elongation: In der Elongationsphase wird die Polypeptidkette verlängert. Das Ribosom bewegt sich entlang der mRNA in 5' zu 3'-Richtung. Jede Codon-Sequenz (bestehend aus drei Nukleotiden) der mRNA wird durch eine entsprechende tRNA erkannt, die die passende Aminosäure liefert. Die tRNA-Moleküle haben ein Anticodon, welches komplementär zu den mRNA-Codons ist, und tragen an ihrem anderen Ende die spezifische Aminosäure. Die Ribosomalen Untereinheiten ermöglichen die Bindung der tRNA an das entsprechende Codon und die Verknüpfung der Aminosäuren zu einer wachsenden Polypeptidkette. Nachdem die tRNA ihre Aminosäure abgegeben hat, wird sie vom Ribosom freigesetzt und kann erneut verwendet werden.
• Termination: Der Prozess der Translation endet, sobald das Ribosom ein Stopcodon (UAA, UAG oder UGA) auf der mRNA erreicht. Diese Codons signalisieren das Ende der Translation. Es gibt keine tRNA-Moleküle, die an diese Stopcodons binden. Stattdessen binden Freisetzungsfaktoren an das Stopcodon, wodurch die Polypeptidkette freigesetzt wird. Das Ribosom zerfällt in seine Untereinheiten und kann für eine neue Runde der Translation verwendet werden.

Insgesamt spielen das Ribosom und die tRNA eine zentrale Rolle bei der Translation: Das Ribosom stellt sicher, dass die mRNA korrekt gelesen wird und dass die Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge verknüpft werden, während die tRNA die spezifischen Aminosäuren zu den mRNA-Codons bringt und dadurch den Aufbau des Proteins ermöglicht.

Aufgabe 3)

Mutationen und DNA-Reparaturmechanismen sind entscheidend für die Erhaltung der genetischen Stabilität. Es gibt verschiedene Arten von Mutationen, darunter Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Substitutionen. Diese Mutationen können durch Umweltfaktoren, Fehler bei der DNA-Replikation oder spontan auftreten. Um Schäden an der DNA zu korrigieren, verfügt die Zelle über mehrere Reparaturmechanismen wie die Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER), die nicht-homologe End-Verknüpfung (NHEJ) und die homologe Rekombinationsreparatur (HR).

Die BER entfernt beschädigte Basen und füllt die Lücken durch die Aktivität der DNA-Polymerase auf und versiegelt sie durch DNA-Ligase. Die NER erkennt Verformungen der DNA und entfernt ein Oligonukleotid, das dann wieder aufgefüllt und versiegelt wird. NHEJ verknüpft gebrochene DNA-Enden ohne Vorlage und ist daher fehleranfällig. Im Gegensatz dazu nutzt die HR das Schwesterchromatid als Vorlage und ist daher sehr genau.

Fehler in diesen Reparaturmechanismen können zu Mutagenese und Tumorentstehung führen.

a)

Erläutere die Unterschiede zwischen der Basenexzisionsreparatur (BER) und der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) im Hinblick auf die Art der erkannten und reparierten DNA-Schäden.

Lösung:

Unterschiede zwischen der Basenexzisionsreparatur (BER) und der Nukleotidexzisionsreparatur (NER):

• Art der erkannten Schäden:- BER: Die Basenexzisionsreparatur repariert hauptsächlich kleine, nicht-helixverformende Schäden an der DNA, wie oxidierte oder alkylierte Basen, die durch endogene Stoffwechselprozesse oder Umwelteinflüsse entstanden sind.- NER: Die Nukleotidexzisionsreparatur erkennt und repariert größere, helixverformende Schäden, die häufig durch UV-Strahlung (z. B. Pyrimidindimere) oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe verursacht werden.
• Mechanismus der Reparatur:- BER: Dieser Mechanismus entfernt beschädigte Basen durch eine Glycosylase, wodurch ein apurinischer oder apyrimidinischer (AP) Ort entsteht. Danach entfernt eine AP-Endonuklease das Zucker-Phosphat-Rückgrat, und die entstehende Lücke wird durch die DNA-Polymerase aufgefüllt und durch die DNA-Ligase versiegelt.- NER: Bei der Nukleotidexzisionsreparatur wird ein Oligonukleotid-Strangstück, das den Schaden enthält, durch endonukleolytischen Schnitt entfernt. Danach wird der entstehende Einzelstrangbereich durch die DNA-Polymerase neu synthetisiert und durch die DNA-Ligase versiegelt.
• Genauigkeit und Anwendungsbereich:- BER: Dieser Mechanismus ist relativ spezifisch für kleine Schäden an einzelnen Basen und ist hochgenau, da er sich auf die Erkennung und Entfernung spezifischer beschädigter Basen konzentriert.- NER: Obwohl diese Methode größere DNA-Abschnitte entfernt und damit potenziell mehr Reparaturen durchführt, ist sie dennoch hochgenau, da sie die helikalen Verformungen der Doppelhelix erkennt und korrekt behebt.

b)

Beschreibe die Prozessschritte der homologen Rekombinationsreparatur (HR). Weshalb ist sie im Vergleich zur nicht-homologen End-Verknüpfung (NHEJ) genauer?

Lösung:

Prozessschritte der homologen Rekombinationsreparatur (HR):

• Erkennung und Vorbereitung des Schadens: Wenn ein Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA erkannt wird, bereitet die Zelle die beschädigte DNA durch Entfernen eines kleinen Einzelstrangabschnitts an beiden Enden des Bruches vor. Dies wird als 5'-3' End-Resektion bezeichnet und hinterlässt einzelsträngige 3'-Überhänge.
• Stranginvasion und D-Loop Bildung: Die einzelsträngigen 3'-Überhänge suchen nach einer homologen Sequenz auf dem Schwesterchromatid und invasieren diese, wodurch ein D-Loop (Displacement Loop) entsteht.
• DNA-Synthese und Strangverlängerung: Die DNA-Polymerase synthetisiert neue DNA, indem sie das intakte Schwesterchromatid als Vorlage nutzt. Dies verlängert den invasiven Strang und erweitert den D-Loop.
• Verzweigungsmigration und Heteroduplexbildung: Die Verzweigungspunkte werden weiter entlang der DNA migriert, was zur Bildung eines Heteroduplexbereichs führt, in dem der neu synthetisierte Strang mit dem Schwesterchromatid hybridisiert.
• Ligation und Auflösung der Verzweigungen: Die entstandenen Verzweigungen werden aufgelöst und die neu synthetisierten DNA-Stränge werden ligiert, wodurch die ursprüngliche Doppelhelixstruktur der DNA vollständig wiederhergestellt wird.

Warum HR genauer ist als NHEJ:

• Verwendung einer Vorlage: Im Gegensatz zur nicht-homologen End-Verknüpfung (NHEJ), die keine homologische Vorlage benötigt und daher fehleranfällig ist, verwendet die HR das Schwesterchromatid als Vorlage. Dadurch wird eine fehlerfreie Reparatur ermöglicht.
• Geringere Wahrscheinlichkeit für Mutationen: Durch die genaue Kopierarbeit der DNA-Polymerase und die anschließende Ligation der DNA-Stränge ist die Wahrscheinlichkeit für Mutationen bei der HR wesentlich geringer.
• Präzision: Die HR ist ein sehr präziser Mechanismus, der sicherstellt, dass die genetische Information originalgetreu wiederhergestellt wird, während NHEJ häufig kleine Deletionen oder Insertionen an den Bruchstellen hinterlässt und somit anfälliger für Fehler ist.

c)

Eine bestimmte punktuelle Mutation in einem Onkogen führt zur Entstehung eines Tumors. Erkläre, wie eine fehlerhafte Reparaturmechanismen zu dieser Mutation führen kann und diskutiere die potenzielle Rolle der verschiedenen Reparaturwege bei der Entstehung von Tumoren.

Lösung:

Wie fehlerhafte Reparaturmechanismen zu Mutationen führen können:

• Basenexzisionsreparatur (BER): Fehler in der BER können auftreten, wenn die Erkennung beschädigter Basen oder die Entfernung und Wiederherstellung der richtigen Basen fehlschlägt. Dies kann dazu führen, dass mutierte Basen in der DNA verbleiben und bei der Replikation fehlerhaft kopiert werden, was zu Punktmutationen führen kann.
• Nukleotidexzisionsreparatur (NER): Wenn das NER-System defekt ist, können größere DNA-Deformierungen wie durch UV-Strahlung verursachte Pyrimidindimere bestehen bleiben. Diese können während der Replikation fehlerhaft gelesen werden, was zu Mutationen führt. Eine fehlerhafte NER kann auch zu klonogenen Mutagenese führen, bei der ganze Segmente von mutierten Nukleotiden entstehen.
• Nicht-homologe End-Verknüpfung (NHEJ): Da NHEJ ohne ähnliche Vorlage arbeitet, ist dieses Reparatursystem tendenziell fehleranfällig und kann Insertionen oder Deletionen an den Bruchstellen hinterlassen. Solche Fehler können Rahmenverschiebungsmutationen verursachen, was zur dysfunktionalen Genprodukte und Tumorentstehung führen kann.
• Homologe Rekombinationsreparatur (HR): Fehler in der HR sind weniger verbreitet, da dieser Mechanismus sehr genau ist. Jedoch, wenn HR fehlerhaft funktioniert oder nicht verfügbar ist, kann die Zelle auf NHEJ zurückgreifen, was die Wahrscheinlichkeit von Mutationen erhöht, die zu Tumoren führen könnten.

Potenzielle Rolle der verschiedenen Reparaturmechanismen bei der Entstehung von Tumoren:

• BER und NER: Fehler in diesen Reparaturmechanismen können dazu führen, dass DNA-Schäden nicht korrekt repariert werden und somit zu Mutationen progressive führen. In einem Onkogen, das normalerweise die Zellwachstumskontrolle reguliert, könnte eine einzige Mutation zu unkontrolliertem Zellwachstum und Tumorbildung führen.
• NHEJ: Aufgrund seiner fehleranfälligen Natur könnte NHEJ bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen zu Deletionen oder Insertionen führen, welche die Funktion von Tumorsuppressorgenen beeinträchtigen oder onkogene Mutationen verursachen könnten.
• HR: Während HR sehr präzise ist, führt ein Ausfall dieses Mechanismus dazu, dass Zellen auf NHEJ angewiesen sind, wodurch die Fehleranfälligkeit und die Gefahr von Tumoren steigt. Mutationen in Genen, die an HR beteiligt sind (wie BRCA1 und BRCA2), sind mit erhöhtem Krebsrisiko verbunden.

Insgesamt spielen die Reparaturmechanismen eine entscheidende Rolle beim Schutz der genetischen Integrität. Defekte in diesen Systemen können zu Mutationen führen, die das Wachstum und die Differenzierung von Zellen stören und letztlich zur Tumorbildung beitragen.

Aufgabe 4)

In einem Forschungsprojekt siehst Du Dir die genetischen Ursachen einer seltenen Erbkrankheit an, die durch Mutationen in einem spezifischen Gen verursacht wird. Du hast DNA-Proben von Patienten erhalten und möchtest nun herausfinden, welche Mutationen vorhanden sind. Dazu verwendest Du die PCR zur Amplifikation des betroffenen Gens und anschließend die Sequenzierung zur Detektion der Mutationen. Die folgenden Unteraufgaben beinhalten die Anwendung und Analyse der Methoden PCR und Sequenzierung.

a)

Erkläre den Zweck der PCR und formuliere die mathematische Gleichung, die die Anzahl der DNA-Kopien nach n Amplifizierungszyklen beschreibt. Wenn Du 30 Zyklen durchführst, wie viele Kopien einer spezifischen DNA-Sequenz wirst Du ungefähr erhalten?

Lösung:

Zweck der PCRDie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine molekularbiologische Methode, die verwendet wird, um spezifische DNA-Sequenzen zu vervielfältigen. Diese Technik erlaubt es, aus einer kleinen Menge an DNA-Proben ausreichend Material zu erzeugen, um es für detaillierte genetische Untersuchungen zu nutzen. Die PCR funktioniert durch wiederholte Zyklen der Denaturierung (Trennen der DNA-Stränge), Annealing (Bindung von Primern an die Zielsequenz) und Elongation (Synthese des neuen DNA-Strangs), wodurch die Menge des spezifischen DNA-Abschnitts exponentiell wächst.Mathematische Gleichung der DNA-AmplifikationDie Anzahl der DNA-Kopien nach n Amplifizierungszyklen kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden:

• Anzahl der DNA-Kopien = x_0 \times 2^n

wobei:

• x_0 = Ursprüngliche Anzahl der DNA-Kopien
• n = Anzahl der durchgeführten Zyklen

Beispiel mit 30 ZyklenWenn Du 30 Zyklen durchführst, kannst Du die Anzahl der Kopien einer spezifischen DNA-Sequenz wie folgt berechnen:Anzahl der DNA-Kopien = x_0 \times 2^{30}Angenommen, Du startest mit einer einzigen DNA-Kopie (x_0 = 1), dann wäre die Berechnung wie folgt:Anzahl der DNA-Kopien = 1 \times 2^{30} = 1,073,741,824Nach 30 Zyklen wirst Du also ungefähr 1,073,741,824 Kopien der spezifischen DNA-Sequenz erhalten.

b)

Beschreibe den grundlegenden Ablauf der Sanger-Sequenzierung. Welche Unterschiede bestehen im Vergleich zur Next Generation Sequencing (NGS) Methode?

Lösung:

Grundlegender Ablauf der Sanger-SequenzierungDie Sanger-Sequenzierung, auch bekannt als Kettenabbruchmethode, ist eine klassische DNA-Sequenzierungsmethode, die prinzipiell wie folgt abläuft:

• DNA-Vorbereitung: Die zu sequenzierende DNA wird isoliert und aufgereinigt.
• Denaturierung: Die DNA-Doppelstränge werden durch Hitze getrennt, um einzelne Stränge zu erhalten.
• Primer-Bindung: Ein kurzer DNA-Primer, der komplementär zur Sequenz ist, wird an die einzelsträngige DNA gebunden.
• Elongation: In einer Reaktionsmischung, die die DNA-Polymerase, normale Desoxynukleotide (dNTPs) und fluoreszenzmarkierte Didesoxynukleotide (ddNTPs) enthält, wird die Elongation gestartet. Die ddNTPs beenden die Synthese, weil sie keine 3'-OH-Gruppe besitzen.
• Abbruch der Kettenbildung: Jedes Mal, wenn ein ddNTP eingebaut wird, endet die DNA-Synthese. Dies führt zu zahlreichen DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge.
• Fragmenttrennung und Detektion: Die fragmente werden durch Kapillarelektrophorese der Länge nach getrennt und die Fluoreszenzmarkierungen der ddNTPs an das Ende jedes Fragments werden durch einen Detektor erfasst. So kann die Basenreihenfolge bestimmt werden.

Unterschiede zwischen Sanger-Sequenzierung und Next Generation Sequencing (NGS)Sowohl die Sanger-Sequenzierung als auch NGS sind Methoden zur Bestimmung der DNA-Sequenz, doch sie unterscheiden sich deutlich in ihrer Technologie und Anwendung:

• Skalierbarkeit und Durchsatz: Sanger-Sequenzierung sequenziert typischerweise ein DNA-Fragment pro Reaktion und ist relativ langsam. NGS kann Millionen von DNA-Molekülen gleichzeitig sequenzieren, daher ist der Durchsatz viel höher.
• Geschwindigkeit: Sanger-Sequenzierung ist zeitaufwändig und benötigt viele manuelle Schritte. NGS ist automatisierter und kann in kürzerer Zeit eine größere Menge an Daten erzeugen.
• Kosten: Sanger-Sequenzierung ist im Allgemeinen teurer pro Basis, die sequenziert wird, besonders bei großem Umfang. NGS ist kosteneffizienter für die Sequenzierung großer Genome oder vieler Proben.
• Technologische Methode: Sanger-Sequenzierung verwendet Kettenabbruchmethoden und Electrophorese, während NGS verschiedene Techniken wie Sequenzieren durch Synthese, Sequenzieren durch Ligation und Pyrosequenzierung verwendet.
• Anwendungsbereich: Die Sanger-Sequenzierung wird häufig für gezielte Sequenzierungen und Validierungen verwendet. NGS wird aufgrund seiner hohen Kapazität für genomweite Analysen, Transkriptomanalysen und Entdeckung neuer Varianten genutzt.

c)

Angenommen, Du hast eine 400 bp lange DNA-Sequenz mit einer Punktmutation, die eine genetische Krankheit verursacht. Wenn Du ein PCR-Produkt sequenzierst und die folgende Basenabfolge erhältst:

5' ATGCAGTTCGATCGTAGCTAGCTAGCTTGACGTTAGC 3'

. Die gleiche Sequenz im Wildtyp wäre:

5' ATGCAGTTCGATCGTGGCTAGCTAGCTTGACGTTAGC 3'

. Identifiziere die Mutation und erkläre ihre potenziellen Auswirkungen auf das Protein, das durch diese DNA-Sequenz kodiert wird.

Lösung:

Identifizierung der MutationZunächst vergleichen wir die beiden gegebenen DNA-Sequenzen, um die Mutation zu identifizieren.

• Vorliegende Sequenz (mit Mutation):

  5' ATGCAGTTCGATCGTAGCTAGCTAGCTTGACGTTAGC 3'

• Wildtyp-Sequenz:

  5' ATGCAGTTCGATCGTGGCTAGCTAGCTTGACGTTAGC 3'

Durch den Vergleich stellen wir fest, dass die Mutation an der 18. Position der Sequenz auftritt:

• Mutierte Sequenz: ...TAGCTAG...
• Wildtyp-Sequenz: ...GAGCTAG...

Die Punktmutation ist also ein Austausch von Guanin (G) durch Thymin (T) an der 18. Position der Sequenz.Potenzielle Auswirkungen der MutationUm die Auswirkungen der Mutation auf das kodierte Protein zu verstehen, müssen wir die DNA-Sequenz in ihre entsprechende Aminosäuresequenz übersetzen.Wir nehmen hierfür jeweils die mRNA-Sequenz und übersetzen sie in Aminosäuren.

• mRNA-Sequenz des Wildtyps:

  5' AUG CAG UUC GAU CGU GGC UAG CUA GCC UUG ACG UUA GCU 3'

• mRNA-Sequenz des mutierten Typs:

  5' AUG CAG UUC GAU CGU AUU UAG CUA GCC UUG ACG UUA GCU 3'

Die entsprechenden Aminosäuresequenzen wären:

• Wildtyp-Protein:

  Met-Gln-Phe-Asp-Arg-Gly

• Mutiertes Protein:

  Met-Gln-Phe-Asp-Arg-Ile

Der Aminosäureaustausch ist:

• Wildtyp: Gly (Glycin)
• Mutante: Ile (Isoleucin)

Dieser Aminosäureaustausch könnte verschiedene Auswirkungen auf das resultierende Protein haben:

• Veränderte Proteinstruktur: Glycin und Isoleucin haben unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften. Glycin ist eine kleine, flexiblere Aminosäure, während Isoleucin größere Seitenketten aufweist. Dies könnte die Sekundärstruktur und/oder Faltung des Proteins beeinflussen.
• Veränderung der Protein-Funktion: Der Austausch könnte die Funktion des Proteins beeinträchtigen, besonders wenn Glycin in einer aktiven oder bindenden Domäne liegt. Die Mutation könnte die Affinität zu Liganden oder anderen interagierenden Molekülen verändern.
• Krankheitsursache: Im schlimmsten Fall könnte die Mutation zu einem Verlust der Funktion oder der Gain-of-Function des Proteins führen, was die zugrunde liegende genetische Krankheit verursacht.