Laborexperimentelles Arbeiten I - Cheatsheet

Methoden der DNA-Extraktion

Definition:

Methoden zur Isolierung von DNA aus biologischem Material, ermöglichen nachfolgende molekularbiologische Analysen.

Details:

• Grundprinzip: Lyse der Zellen zur Freisetzung der DNA, Entfernung von Proteinen und Verunreinigungen, Isolierung und Reinigung der DNA
• Häufige Techniken: Phenol-Chloroform-Extraktion, Silica-basierte Verfahren, Anionenaustauschchromatographie
• Phenol-Chloroform-Extraktion: Lysispuffer + Proteinase K → Phenol/Chloroform-Isolierung → Ethanolpräzipitation
• Silica-basierte Verfahren: Zelllyse + Bindung der DNA an Silica in hoher Salzkonzentration → Waschschritte → Elution der DNA
• Anionenaustauschchromatographie: DNA bindet an eine Anionenaustauscher-Matrix → Waschschritte → Elution mit hoher Salzkonzentration
• Vorteile & Nachteile: Phenol-Chloroform (hohe Reinheit, toxische Reagenzien); Silica-Säulen (einfach, schnelle Protokolle, höhere Kosten); Anionenaustausch (hohe Reinheit, komplexere Protokolle)

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Definition:

Methode zur Vervielfältigung spezifischer DNA-Sequenzen.

Details:

• Denaturierung: Trennung der DNA-Doppelhelix (ca. 94-98°C).
• Annealing: Binden der Primer an die Einzelstränge (ca. 50-65°C).
• Elongation: DNA-Synthese durch Taq-Polymerase (ca. 72°C).
• Zyklenzahl: üblicherweise 25-35 Durchgänge.
• Endprodukt: exponentielle Vervielfältigung der Ziel-DNA.
• Anwendung: Diagnostik, Klonierung, Sequenzierung, Forensik.

Proteinextraktion und -aufreinigung

Definition:

Extrahieren und Reinigen von Proteinen aus biologischem Material zur weiteren Analyse und Anwendung.

Details:

• Proteinenextraktion: Zellaufschluss durch mechanische, chemische oder enzymatische Methoden
• Zentrifugation: Trennung der Zellhomogenate in Fraktionen
• Aufreinigung: Chromatographie (z.B. Affinität, Ionenaustausch, Gel-Filtration)
• Gelfiltration: Größenausschlussprinzip, Proteine nach Größe getrennt
• Elektrophorese: Auftrennung nach Größe/Ladung, z.B. SDS-PAGE
• Quantifizierung: Bestimmung der Konzentration, z.B. Bradford-Assay
• Proteincharakterisierung: Massenspektroskopie, Western Blot, Sequenzanalyse

Western Blotting

Definition:

Analytische Methode zum Nachweis spezifischer Proteine in einer Probe mittels Elektrophorese und Antikörperreaktion.

Details:

• Elektrophoretische Trennung der Proteine durch SDS-PAGE
• Transfer der Proteine auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF)
• Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran
• Inkubation mit einem primären Antikörper, der das Zielprotein erkennt
• Inkubation mit einem sekundären, markierten Antikörper gegen den primären Antikörper
• Detektion der markierten Antikörper (z.B. chemilumineszierend)
• Quantitative oder qualitative Auswertung der Proteinbande

Transfektion und Transduktion

Definition:

Transfektion - Einbringen von Fremd-DNA in eukaryotische Zellen. Transduktion - Übertragung von DNA in Zellen durch Viren.

Details:

• Transfektion: Benutzung von chemischen oder physikalischen Methoden (z.B. Lipofektion, Elektroporation)
• Transduktion: Nutzung von viralen Vektoren (z.B. Lentiviren, Adenoviren)
• Effizienz variiert je nach Methode und Zelltyp
• Ziel: Expression von Genen oder Gen-Silencing
• Kontrollen nötig: Positive (z.B. GFP) und Negative (Mock)

Fluoreszenzmikroskopie

Definition:

Methode zur spezifischen Visualisierung von Zellstrukturen mit Hilfe von fluoreszierenden Farbstoffen und Licht im sichtbaren Spektrum.

Details:

• Nutzung von Fluorochromen, die bei spezifischen Wellenlängen Licht emittieren.
• Anregung durch hochenergetisches Licht (meist UV oder Blau).
• Emission des Fluorochroms bei längeren Wellenlängen (meist Grün oder Rot).
• Dichroitische Spiegel und Filter zur Trennung von Anregungs- und Emissionslicht.
• Ermöglicht die Markierung und Visualisierung spezifischer Proteine oder Organellen in lebenden oder fixierten Zellen.
• Wichtige Werkzeuge: Confokalmikroskopie, STED-Mikroskopie, TIRF-Mikroskopie.

Statistische Methoden

Definition:

Anwendung mathematischer Modelle und statistischer Testverfahren zur Analyse und Interpretation experimenteller Daten.

Details:

• Deskriptive Statistik: Mittelwert (\overline{x}), Median, Standardabweichung (s)
• Induktive Statistik: Hypothesentests, p-Wert (\alpha-Niveau), Konfidenzintervalle
• Regressionsanalyse: Lineare Regression (y = a + bx), Korrelationskoeffizient (r)
• Varianzanalyse (ANOVA): Vergleich mehrerer Mittelwerte, F-Test

Bioinformatik-Werkzeuge

Definition:

Bioinformatik-Werkzeuge - Software und Datenbanken für die Analyse biologischer Daten.

Details:

• Sequenzanalyse: BLAST, Clustal Omega
• Strukturanalyse: PyMOL, UCSF Chimera
• Genomanalyse: Ensembl, UCSC Genome Browser
• Proteomanalyse: proteomicsDB, SWISS-PROT
• Werkzeuge für molekulare Modellierung und Simulation: GROMACS, AutoDock