Laborexperimentelles Arbeiten I - Exam

Aufgabe 1)

Du bist als Laborleiter damit beauftragt, DNA aus Gewebeproben zu extrahieren, um diese für nachfolgende molekularbiologische Analysen vorzubereiten. Dazu stehen Dir drei Methoden zur Verfügung: die Phenol-Chloroform-Extraktion, silica-basierte Verfahren und die Anionenaustauschchromatographie. Jede dieser Methoden hat ihre spezifischen Vorteile und Nachteile, die bei der Wahl der geeigneten Methode berücksichtigt werden müssen.

a)

• a) Beschreibe das grundsätzliche Vorgehen bei der Phenol-Chloroform-Extraktion. Welche Schritte sind notwendig, um DNA zu isolieren und zu reinigen? Erläutere kurz, warum jede dieser Schritte notwendig ist.

Lösung:

• a) Beschreibe das grundsätzliche Vorgehen bei der Phenol-Chloroform-Extraktion. Welche Schritte sind notwendig, um DNA zu isolieren und zu reinigen? Erläutere kurz, warum jede dieser Schritte notwendig ist.

• 1. Zellaufschluss: Der erste Schritt besteht darin, die Zellmembranen zu durchbrechen, um die DNA freizusetzen. Dies wird oft durch mechanische Methoden (z.B. Homogenisierung), enzymatische Methoden (z.B. mit Proteinase K) oder durch den Einsatz von Detergenzien erreicht. Dieser Schritt ist notwendig, um das Zellmaterial aufzubrechen und die Nukleinsäuren in Lösung zu bringen.
• 2. Zugabe von Phenol und Chloroform: Die Zugabe von Phenol und Chloroform dient der Denaturierung und Entfernung von Proteinen. Phenol denaturiert Proteine und Chloroform hilft, Phasen zu trennen. Die Mischung wird zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die DNA verbleibt in der wässrigen Phase, während Proteine und Lipide in die organische Phase übergehen. Dieser Schritt ist entscheidend, weil er es ermöglicht, die DNA von den meisten anderen Zellbestandteilen zu trennen.
• 3. Übertragung der wässrigen Phase: Die wässrige Phase, die die DNA enthält, wird vorsichtig in ein neues Röhrchen überführt. Dies ist wichtig, um die reine DNA-Lösung für weitere Schritte vorzubereiten.
• 4. Zugabe von Ethanol oder Isopropanol: Durch die Zugabe von kaltem Ethanol oder Isopropanol wird die DNA ausgefällt. Die Lösung wird gekühlt und zentrifugiert, um die DNA zu pelletieren. Dieser Schritt erlaubt es, die DNA von der wässrigen Lösung zu trennen.
• 5. Waschschritte: Der DNA-Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen, um Reste von Salzen und anderen Verunreinigungen zu entfernen. Nach dem Waschschritt wird das Ethanol entfernt und die DNA luftgetrocknet. Dieser Schritt trägt zur Reinheit der extrahierten DNA bei.
• 6. Resuspendierung: Schließlich wird die gereinigte DNA in einem geeigneten Puffer (z.B. TE-Puffer) resuspendiert. Das Resuspendieren in Puffer sorgt dafür, dass die DNA stabil bleibt und für nachfolgende Anwendungen verwendet werden kann.

b)

• b) Angenommen, Du verwendest ein silica-basiertes Verfahren zur DNA-Isolierung. Berechne die endgültige Salzkonzentration in der Elutionslösung, wenn Du 5 ml einer 70%igen Isopropanol-Waschlösung mit hoher Salzkonzentration (6 M NaCl) für die Waschschritte verwendet hast und die DNA letztlich in 500 µl Elutionspuffer (0.01 M NaCl) eluiert wird. Erkläre deine Berechnungsschritte und zeichne auf, welche Faktoren die Auskunft über die Ausbeute und Reinheit der isolierten DNA geben könnten.

Lösung:

• b) Angenommen, Du verwendest ein silica-basiertes Verfahren zur DNA-Isolierung. Berechne die endgültige Salzkonzentration in der Elutionslösung, wenn Du 5 ml einer 70%igen Isopropanol-Waschlösung mit hoher Salzkonzentration (6 M NaCl) für die Waschschritte verwendet hast und die DNA letztlich in 500 µl Elutionspuffer (0.01 M NaCl) eluiert wird. Erkläre deine Berechnungsschritte und zeichne auf, welche Faktoren die Auskunft über die Ausbeute und Reinheit der isolierten DNA geben könnten.

• Berechnung der endgültigen Salzkonzentration:
• 1. Annahmen und gegebene Werte:
• Volumen der Isopropanol-Waschlösung: 5 ml (5000 µl)
• Konzentration von NaCl in der Waschlösung: 6 M
• Volumen des Elutionspuffers: 500 µl
• Konzentration von NaCl im Elutionspuffer: 0.01 M
• 2. Berechnung der Gesamtmenge an NaCl:
Die Menge an NaCl in der Waschlösung kann berechnet werden als:

Menge_{NaCl} = Konzentration_{NaCl, Waschlösung} × Volumen_{Waschlösung}

Menge_{NaCl} = 6 mol/L × 5 × 10^{-3} L = 0.03 mol

Gesamtvolumen = Volumen_{Elutionspuffer} = 500 µl = 0,5 ml

Konzentration_{NaCl, Elution} = \frac{Menge_{NaCl}}{Gesamtvolumen}

Konzentration_{NaCl, Elution} = \frac{0.03 mol}{0.5 × 10^{-3} L} = 0.06 mol/L

• 1. Effizienz der Zellaufschluss- und Bindungsschritte: Die vollständige und effiziente Zelllyse sowie die Bindung der DNA an die Silica-Matrix beeinflussen die DNA-Ausbeute maßgeblich.
• 2. Anzahl und Gründlichkeit der Waschschritte: Ausreichende Waschschritte sind entscheidend, um Verunreinigungen zu entfernen, welche die Reinheit der DNA beeinträchtigen könnten.
• 3. Elutionseffizienz: Ein optimaler Elutionspuffer und korrekte Elutionstechnik stellen sicher, dass die maximale Menge an DNA von der Silica-Matrix freigesetzt wird.
• 4. Quality Control (QC) Tests: UV-Absorptionsmessung (z.B. A260/A280-Verhältnis) und Agarose-Gel-Elektrophorese können zur Beurteilung der Reinheit und Integrität der isolierten DNA herangezogen werden.

c)

• c) Beschreibe die Vor- und Nachteile jeder der drei Methoden (Phenol-Chloroform-Extraktion, silica-basierte Verfahren, Anionenaustauschchromatographie) hinsichtlich der Reinheit der DNA, die Wirtschaftlichkeit und die Handhabung im Laboralltag. Welche Methode würdest Du unter Berücksichtigung dieser Kriterien für eine hohe Anzahl von Proben vorschlagen und warum?

Lösung:

• c) Beschreibe die Vor- und Nachteile jeder der drei Methoden (Phenol-Chloroform-Extraktion, silica-basierte Verfahren, Anionenaustauschchromatographie) hinsichtlich der Reinheit der DNA, die Wirtschaftlichkeit und die Handhabung im Laboralltag. Welche Methode würdest Du unter Berücksichtigung dieser Kriterien für eine hohe Anzahl von Proben vorschlagen und warum?

• Phenol-Chloroform-Extraktion:
• Vorteile:- Hohe DNA-Reinheit: Entfernt Proteine und lipophile Verunreinigungen effizient- Geeignet für eine Vielzahl von Probenarten
• Nachteile:- Einsatz toxischer Chemikalien: Phenol und Chloroform sind gesundheitsschädlich und erfordern spezielle Entsorgung- Zeitaufwändig: Mehrere Extraktionsschritte notwendig- Nicht automatisierbar: Hoher manueller Aufwand
• Silica-basierte Verfahren:
• Vorteile:- Einfache Handhabung: Kit-basierte Methoden sind leicht anzuwenden- Relativ schnelle Methode: Oft in unter 1 Stunde durchführbar- Hohe DNA-Reinheit: Entfernt Proteine und Salze effektiv- Automatisierbar: Eignet sich gut für Hochdurchsatz
• Nachteile:- Kosten: Höhere Kosten für kommerzielle Kits- Bindungskapazität: Limitierte Menge an DNA, die gebunden werden kann
• Anionenaustauschchromatographie:
• Vorteile:- Sehr hohe Reinheit: Ideal für Anwendungen, die extrem reine DNA erfordern- Hohe Ausbeute: Geeignet für größere Mengen an DNA
• Nachteile:- Komplexe Handhabung: Erfordert spezielle Ausrüstung und Know-how- Kosten: Hohe Anfangsinvestitionen und spezielle Verbrauchsmaterialien- Zeitaufwändig: Mehrere Wasch- und Elutionsschritte
• Empfehlung für hohe Probenanzahlen:Unter Berücksichtigung der Reinheit der DNA, Wirtschaftlichkeit und Handhabung im Laboralltag, würde ich die silica-basierten Verfahren vorschlagen. Diese Methoden bieten eine gute Balance zwischen hoher Reinheit und geringer Komplexität. Sie sind zudem relativ schnell und einfach durchzuführen und lassen sich leicht automatisieren, was für die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben vorteilhaft ist. Trotz der höheren Kosten für kommerzielle Kits überwiegen die Vorteile in der Effizienz und Benutzerfreundlichkeit im Laboralltag.

Aufgabe 2)

In einem Laborversuch soll durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine spezifische DNA-Sequenz vervielfältigt werden. Du hast folgende Materialien und Informationen zur Verfügung: Ziel-DNA-Probe, Taq-Polymerase, Primerpaar (Vorwärts- und Rückwärtsprimer), dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate), Pufferlösung und einen Thermocycler. Die Amplifikation erfolgt in den drei typischen Schritten (Denaturierung, Annealing, Elongation) und umfasst insgesamt 30 Zyklen. Die anfängliche Konzentration der Ziel-DNA beträgt 10^3 Moleküle. Die Ziel-DNA soll nach der Amplifikation für diagnostische Zwecke verwendet werden.

a)

Beschreibe detailliert die drei Hauptschritte der PCR (Denaturierung, Annealing, Elongation) und erkläre, warum jede Phase bei bestimmten Temperaturen durchgeführt wird. Wie beeinflussen die Temperaturen die Enzymaktivität und die Hybridisierung der DNA?

Lösung:

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) besteht aus drei Hauptschritten: Denaturierung, Annealing und Elongation. Jeder dieser Schritte wird bei spezifischen Temperaturen durchgeführt, um die optimale Enzymaktivität und DNA-Hybridisierung zu gewährleisten. Hier sind die detaillierten Beschreibungen der drei Hauptschritte:

• Denaturierung:
  • Temperatur: 94-98°C
  • Zweck: In diesem Schritt wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt.
  • Erklärung: Die hohe Temperatur bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren der DNA, wodurch die Doppelhelix in Einzelstränge denaturiert wird.
• Annealing (Anlagerung):
  • Temperatur: 50-65°C
  • Zweck: In diesem Schritt binden die Primer, kurze DNA-Sequenzen, die komplementär zu den Zielregionen der Einzelstrang-DNA sind, an die Einzelstränge.
  • Erklärung: Die Temperatur wird gesenkt, damit die Primer an die komplementären Sequenzen der Einzelstrang-DNA binden können. Diese Temperatur muss ausreichend hoch sein, um unspezifische Bindungen zu vermeiden, aber niedrig genug, damit die spezifischen Primer binden können.
• Elongation (Verlängerung):
  • Temperatur: 72°C
  • Zweck: In diesem Schritt verlängert die Taq-Polymerase den Primer, indem sie dNTPs (Desoxynukleosidtriphosphate) anfügt, um einen neuen, komplementären DNA-Strang zu synthetisieren.
  • Erklärung: Die Temperatur von 72°C ist optimal für die Aktivität der Taq-Polymerase, einem hitzestabilen Enzym, das aus dem Bakterium Thermus aquaticus stammt. Bei dieser Temperatur kann die Polymerase effizient arbeiten und die neuen DNA-Stränge synthetisieren.

Die Temperaturen in jedem Schritt wurden sorgfältig ausgewählt, um die gewünschte chemische Reaktion zu fördern: Denaturierung bei hoher Temperatur, um die DNA zu trennen, Annealing bei mittlerer Temperatur, um die Primer binden zu lassen, und Elongation bei einer Temperatur, die optimal für das Enzym ist. So wird sichergestellt, dass die PCR in jedem Zyklus effizient und spezifisch abläuft.

b)

Berechne die theoretische Menge an Ziel-DNA-Molekülen nach 30 Zyklen der PCR. Gehe davon aus, dass die Effizienz der Polymerase bei jedem Zyklus 100% beträgt. Formuliere die entsprechende mathematische Gleichung und berechne das Endergebnis.

Lösung:

Um die theoretische Menge an Ziel-DNA-Molekülen nach 30 Zyklen der PCR zu berechnen, nehmen wir an, dass die Effizienz der Polymerase bei jedem Zyklus 100% beträgt. Das bedeutet, dass sich die Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Zyklus verdoppelt. Wir können die folgende mathematische Gleichung verwenden:

• Die allgemeine Formel für die Anzahl der DNA-Moleküle nach 'n' Zyklen lautet:

N_{\text{end}} = N_{\text{start}} \times 2^n

• Hierbei ist:
  • \(N_{\text{end}}\): Die Anzahl der DNA-Moleküle am Ende der PCR (nach 30 Zyklen).
  • \(N_{\text{start}}\): Die Anzahl der DNA-Moleküle zu Beginn der PCR (anfängliche Konzentration).
  • \(n\): Die Anzahl der Zyklen.

In diesem Fall haben wir: \(N_{\text{start}} = 10^3\) Moleküle \(n = 30\) Zyklen

Setzen wir diese Werte in die Gleichung ein:

N_{\text{end}} = 10^3 \times 2^{30}

Nun berechnen wir das Endergebnis:

• Berechnung:

N_{\text{end}} = 10^3 \times 2^{30} = 10^3 \times 1,073,741,824 = 1,073,741,824 \times 10^3 = 1,073,741,824,000

Also beträgt die theoretische Menge an Ziel-DNA-Molekülen nach 30 Zyklen der PCR:

• \(1,073,741,824,000\) Moleküle oder etwa \(1.07 \times 10^{12}\) Moleküle.

c)

Erkläre die Bedeutung der Primer in der PCR. Wie beeinflusst die Wahl der Primer das Ergebnis der Reaktion? Was kann passieren, wenn die Primer unspezifisch sind oder eine schlechte Passgenauigkeit zur Zielsequenz haben?

Lösung:

Die Primer spielen eine entscheidende Rolle in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), da sie den Startpunkt für die DNA-Synthese markieren. Hier sind die wichtigsten Punkte zur Bedeutung der Primer und ihrer Auswahl:

• Bedeutung der Primer:
  • Primer sind kurze Einzelstrang-DNA-Sequenzen (etwa 18-30 Nukleotide lang), die komplementär zu den Enden der Ziel-DNA-Sequenz sind.
  • Sie dienen als Startpunkte für die DNA-Polymerase, die den neuen DNA-Strang synthetisiert.
  • Es gibt zwei Primer: einen Vorwärtsprimer und einen Rückwärtsprimer. Der Vorwärtsprimer bindet an den 3'-Ende des antisense Strangs, der Rückwärtsprimer bindet an den 3'-Ende des sense Strangs.
• Einfluss der Primerwahl auf das Ergebnis:
  • Die Spezifität der PCR hängt maßgeblich von der Sequenz der Primer ab. Sie müssen spezifisch an die Ziel-DNA binden, um die gewünschte Amplifikation zu ermöglichen.
  • Die Primertemperatur (Tm), d. h. die optimale Temperatur, bei der die Primer binden, sollte berechnet und angepasst werden, da sie die Effizienz der Annealing-Phase beeinflusst.
  • Die Primer sollten keine ergänzenden Sequenzen (Komplementaritäten) enthalten, die zu Primer-Dimeren führen könnten, da dies die Effizienz der PCR verringern kann.
  • Die Länge und Sequenz der Primer sollten so gewählt werden, dass sie stabilerweise binden und spezifisch sind.
• Folgen unspezifischer oder schlecht passender Primer:
  • Wenn die Primer unspezifisch sind oder eine schlechte Passgenauigkeit zur Zielsequenz haben, können mehrere Probleme auftreten:
  • Unspezifische Bindung: Die Primer könnten an nicht zielgerichtete DNA-Sequenzen binden und unerwünschte DNA-Produkte amplifizieren. Dies kann zu Hintergrundrauschen führen und die Analyse der Ergebnisse erschweren.
  • Kein oder geringer PCR-Ertrag: Wenn der Primer schlecht an die Zielsequenz passt, könnte die Effizienz der Annealing-Phase reduziert werden, was zu einem geringen oder gar keinem PCR-Produkt führt.
  • Primer-Dimere: Wenn die Primer teilweise komplementär zueinander sind, könnten sie sich selbst annealen und Primer-Dimere bilden. Dies reduziert die Menge der verfügbaren Primer für die Zielsequenz und verringert die Effizienz der PCR.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl der richtigen Primer für eine erfolgreiche und spezifische PCR von größter Bedeutung ist. Sorgfältiges Design und Testen der Primer kann helfen, die oben genannten Probleme zu vermeiden und eine effiziente Amplifikation der gewünschten Ziel-DNA zu gewährleisten.

d)

Nenne und erläutere drei Anwendungen der PCR in der Molekularen Medizin und gib konkrete Beispiele für jede Anwendung. Wie trägt die PCR zu Fortschritten in der Diagnostik und Forschung bei?

Lösung:

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) hat zahlreiche Anwendungen in der Molekularen Medizin und trägt maßgeblich zu Fortschritten in der Diagnostik und Forschung bei. Hier sind drei wichtige Anwendungen der PCR sowie konkrete Beispiele und deren Bedeutung:

• 1. Diagnostik von Infektionskrankheiten:
  • Beispiel: Nachweis von viralen und bakteriellen Pathogenen wie SARS-CoV-2 (Verursacher von COVID-19), HIV, Hepatitis B und C, und Mycobacterium tuberculosis.
  • Erläuterung: Die PCR ermöglicht den schnellen und spezifischen Nachweis von Pathogenen in klinischen Proben durch Amplifikation ihrer DNA oder RNA. Dies ermöglicht eine frühzeitige Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten.
• 2. Genetische Diagnostik:
  • Beispiel: Erkennung von genetischen Mutationen und Erbkrankheiten wie Mukoviszidose, BRCA1/BRCA2-Mutationen (verbunden mit Brust- und Eierstockkrebs), und Huntington-Krankheit.
  • Erläuterung: Die PCR kann verwendet werden, um spezifische genetische Sequenzen zu amplifizieren und Mutationen nachzuweisen, die mit verschiedenen genetischen Störungen assoziiert sind. Dies ermöglicht prädiktive Tests, genetische Beratung und personalisierte Behandlungsstrategien.
• 3. Forensische Medizin:
  • Beispiel: Analyse von DNA-Spuren in Kriminalfällen zur Identifikation von Verdächtigen und Opfern, Vergleich von DNA-Proben aus Tatorten.
  • Erläuterung: Die PCR wird zur Amplifikation von DNA-Spuren verwendet, die häufig in sehr geringen Mengen an Tatorten gefunden werden. Die resultierenden DNA-Profile können verwendet werden, um Individuen zu identifizieren und Verbindungen zu Tatorten herzustellen, was in der forensischen Analyse von unschätzbarem Wert ist.

Beiträge der PCR zu Fortschritten in der Diagnostik und Forschung:

• Schnelligkeit und Genauigkeit: Die PCR ermöglicht schnelle und genaue Tests, die wesentlich kürzere Bearbeitungszeiten als traditionelle Methoden haben.
• Empfindlichkeit: Dank der hohen Sensitivität der PCR können sogar winzige Mengen von DNA oder RNA nachgewiesen werden, was besonders wertvoll in der Frühdiagnose von Krankheiten ist.
• Vielfältigkeit: Die PCR kann auf viele verschiedene Arten von Untersuchungen angewendet werden, von der Infektionsdiagnostik über die genetische Screening bis hin zur forensischen Analyse.
• Förderung der Forschung: In der molekularbiologischen und medizinischen Forschung hat die PCR die Untersuchung von Genen und Genexpression, das Verständnis von Krankheitsmechanismen und die Entwicklung neuer Therapien erheblich vorangebracht.

Zusammengefasst hat die PCR die Möglichkeit revolutioniert, genetische Informationen schnell und präzise zu analysieren, was zu bedeutenden Fortschritten in der Diagnostik, der personalisierten Medizin und der forensischen Wissenschaft geführt hat.

Aufgabe 3)

Kontext: Du arbeitest im Labor an der Extraktion und Aufreinigung eines bestimmten Proteins aus Hefe. Dazu verwendest Du verschiedene biochemische Methoden. Die einzelnen Schritte beinhalten die Zellaufschluss, die Zentrifugation zur Fraktionierung, die Gelfiltration zur Trennung nach Größe sowie die Quantifizierung und Charakterisierung des aufgereinigten Proteins.

a)

Frage: Beschreibe detailliert die Vorgehensweise zur Extraktion und Aufreinigung von Proteinen aus Hefezellen. Stelle die verschiedenen Zellaufschlussmethoden (mechanisch, chemisch, enzymatisch) dar, und erläutere, welche Vor- und Nachteile jede Methode bietet.

Lösung:

Beschreibe detailliert die Vorgehensweise zur Extraktion und Aufreinigung von Proteinen aus Hefezellen:Die Extraktion und Aufreinigung von Proteinen aus Hefezellen erfolgt in verschiedenen Schritten. Diese beinhalten den Zellaufschluss, die Zentrifugation zur Fraktionierung, die Gelfiltration zur Trennung nach Größe sowie die Quantifizierung und Charakterisierung des aufgereinigten Proteins.

• Zellaufschluss: Der erste Schritt ist das Aufbrechen der Hefezellen, um die darin enthaltenen Proteine freizusetzen. Es gibt verschiedene Methoden für den Zellaufschluss:
• Mechanische Methoden:
  • Homogenisierung: Die Hefezellen werden durch hohe Scherkräfte aufgebrochen. Dies kann z.B. durch den Einsatz eines Homogenisators oder eines Mikrowellenhomogenisators geschehen.
  • Ultraschall: Zellen werden durch Schallwellen (Ultraschall) aufgebrochen.
  • Vorteile: Schnelle Methode, geeignet für große Zellmengen.
  • Nachteile: Kann zu Proteinabbau führen, erfordert spezielle Geräte.
• Chemische Methoden:
  • Lysing Reagents: Chemikalien wie Detergenzien (z.B. SDS) oder Lösungsmittel werden verwendet, um Zellmembranen zu lösen.
  • Vorteile: Einfach durchzuführen, keine speziellen Geräte notwendig.
  • Nachteile: Chemikalien können Proteine denaturieren oder enzymatische Funktionen beeinträchtigen.
• Enzymatische Methoden:
  • Enzyme: Enzyme wie Lysozym oder Zymolyase werden verwendet, um spezifische Bindungen in der Zellwand zu hydrolysieren.
  • Vorteile: Schonend für Proteine, verhindert denaturierung.
  • Nachteile: Kostspielig, kann lange dauern.
• Zentrifugation: Nach dem Zellaufschluss werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt. Hierbei wird das Homogenat bei hohen Geschwindigkeiten zentrifugiert, um die ungelösten Bestandteile abzutrennen.
• Gelfiltration: Die aufgereinigten Proteine werden nach Größe getrennt. Dies erfolgt durch Gelfiltration oder Größen-Ausschluss-Chromatographie, wobei kleinere Moleküle langsamer durch eine poröse Matrix wandern als größere Moleküle.
• Quantifizierung und Charakterisierung: Die Proteine werden quantifiziert (z.B. durch Bradford-Assay) und ihre Reinheit und Identität wird durch Techniken wie SDS-PAGE oder Western Blot analysiert.

Zusammengefasst:

• Mechanische Methoden: Effektiv, aber riskieren Proteinabbau.
• Chemische Methoden: Einfache Anwendung, jedoch mögliches Denaturieren.
• Enzymatische Methoden: Schonend, aber kostspielig und zeitaufwendig.

b)

Frage: Nach dem Zellaufschluss erfolgt eine Zentrifugation zur Trennung der Zellhomogenate in verschiedene Fraktionen. Erkläre, wie die Zentrifugation funktioniert und wie Du die gewünschten Proteinfraktionen isolierst. Welche Parameter (z.B. Geschwindigkeit, Dauer, Temperatur) müssen beachtet werden?

Lösung:

Erklärung der Zentrifugation zur Trennung der Zellhomogenate in verschiedene Fraktionen:

• Wie funktioniert die Zentrifugation?
• Bei der Zentrifugation werden Proben mit hoher Geschwindigkeit um eine zentrale Achse gedreht. Dadurch erzeugt man eine Zentrifugalkraft, die die Bestandteile der Probe basierend auf ihrer Dichte und Masse separiert.
• Schwere Partikel setzen sich schneller und weiter unten im Röhrchen ab als leichtere Partikel, wodurch verschiedene Schichten oder Pellets entstehen.
• Isolierung der gewünschten Proteinfraktionen
• Nach der Zentrifugation hat man verschiedene Schichten im Zentrifugenröhrchen:
• Pellet: Die schwersten Partikel (wie Zelltrümmer oder Zellorganellen) setzen sich am Boden ab.
• Überstand: Der Überstand enthält leichtere Komponenten, darunter lösliche Proteine.
• Um die gewünschten Proteinfraktionen zu isolieren, entfernt man vorsichtig den Überstand von den Pellets.
• Dieser Überstand kann weiter analysiert oder erneut zentrifugiert werden, um feinere Fraktionen zu erhalten.
• Optional: Durch wiederholtes Zentrifugieren und anschließendes Fraktionieren kann man spezifische Proteine noch weiter auftrennen.
• Zu beachtende Parameter:
• Geschwindigkeit: Die Geschwindigkeit der Zentrifugation wird in Umdrehungen pro Minute (rpm) oder relative Zentrifugalkraft (RCF) angegeben. Höhere Geschwindigkeiten trennen schneller und feiner. Auswahl der Geschwindigkeit hängt von der Dichte und Größe der gesuchten Proteine ab.
• Dauer: Die Zeit, die für die Zentrifugation benötigt wird, beeinflusst die Trennung. Kürzere Zeiten können eine grobe Trennung bewirken, während längere Zeiten eine feinere Separation ermöglichen.
• Temperatur: Viele Proteine sind temperaturempfindlich. Eine niedrige Temperatur (z.B. 4 °C) während der Zentrifugation kann Proteinabbau verhindern und die Aktivität der Proteine erhalten.
• Pufferbedingungen: Der Puffer, in dem das Zellhomogenat gelöst ist, kann die Stabilität der Proteine beeinflussen. pH-Wert, Ionenstärke und andere Pufferkomponenten sollten optimiert sein.

Aufgabe 4)

Western Blotting ist eine analytische Methode zum Nachweis spezifischer Proteine in einer Probe mittels Elektrophorese und Antikörperreaktion. Der Prozess umfasst mehrere Schritte:

• Elektrophoretische Trennung der Proteine durch SDS-PAGE
• Transfer der Proteine auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF)
• Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran
• Inkubation mit einem primären Antikörper, der das Zielprotein erkennt
• Inkubation mit einem sekundären, markierten Antikörper gegen den primären Antikörper
• Detektion der markierten Antikörper (z.B. chemilumineszierend)
• Quantitative oder qualitative Auswertung der Proteinbande

a)

Erläutere den Zweck der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran und beschreibe ein potenzielles Problem, das auftreten könnte, wenn dieser Schritt nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird.

Lösung:

Zweck der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran:

• Die Blockierung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran ist ein entscheidender Schritt im Western Blotting-Prozess. Der Hauptzweck dieses Schritts besteht darin, zu verhindern, dass die Antikörper (sowohl primäre als auch sekundäre) an nicht-zielgerichtete Stellen auf der Membran binden. Dies wird durch das Auffüllen dieser unspezifischen Bindungsstellen mit einer blockierenden Lösung (wie Milch, Albumin oder Fischgelatine) erreicht.
• Ohne diese Blockierung würden die Antikörper zufällig an verschiedenen Stellen der Membran binden, was zu einem hohen Hintergrundsignal führen würde. Dies erschwert die Identifizierung und Quantifizierung des spezifischen Zielproteins, da das Signal des Zielproteins durch das unspezifische Signal überlagert wird.

Potenzielle Probleme bei unzureichender Blockierung:

• Wenn die Blockierung nicht ordnungsgemäß durchgeführt wird, könnten die Antikörper an zufällige, unspezifische Stellen auf der Membran binden.
• Dies führt zu einem erhöhten Hintergrundrauschen, wodurch das spezifische Signal des Zielproteins schwerer zu erkennen ist.
• Die Empfindlichkeit und Spezifität des Western Blots werden stark beeinträchtigt, da das tatsächliche Signal vom Rauschen überdeckt werden kann.
• In extremen Fällen könnte das Fehlen einer ordnungsgemäßen Blockierung dazu führen, dass fälschlicherweise angenommen wird, das Zielprotein sei vorhanden, obwohl es tatsächlich nicht da ist (falsch-positives Ergebnis), oder dass ein vorhandenes Zielprotein nicht erkannt wird (falsch-negatives Ergebnis).

b)

Ein Protein A hat eine Molekularmasse von 50 kDa, ein Protein B eine von 75 kDa. Du führst SDS-PAGE durch und erhältst Banden bei den erwarteten Positionen. Beschreibe die Schritte, wie Du spezifisch das 75 kDa Protein B nachweist und wie Du sicherstellst, dass die Bande bei 75 kDa tatsächlich zu Protein B gehört.

Lösung:

Nachweis des 75 kDa Protein B und Bestätigung seiner Identität:

Um sicherzustellen, dass die Bande bei 75 kDa tatsächlich zu Protein B gehört, musst Du die folgenden Schritte ausführen:

• SDS-PAGE: Führe zunächst eine SDS-PAGE durch, um die Proteine in Deiner Probe nach Größe zu trennen. Du solltest Banden an den erwarteten Positionen, einschließlich einer Bande bei 75 kDa, erhalten.
• Transfer auf Membran: Nach der elektrophoretischen Trennung werden die Proteine auf eine Membran (z.B. Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Dieser Schritt ermöglicht die spätere Detektion der Proteine durch Antikörper.
• Blockierung: Blockiere die Membran, um unspezifische Bindungsstellen zu füllen und somit Hintergrundrauschen zu minimieren. Das kann beispielsweise mit Milchpulver oder BSA durchgeführt werden.
• Inkubation mit primärem Antikörper: Bringe die Membran in Kontakt mit einem primären Antikörper, der spezifisch gegen das 75 kDa Protein B gerichtet ist. Dieser Antikörper bindet nur an Protein B, wenn es auf der Membran vorhanden ist.
• Waschen: Wasche die Membran, um überschüssige, ungebundene primäre Antikörper zu entfernen.
• Inkubation mit sekundärem Antikörper: Inkubiere die Membran mit einem sekundären Antikörper, der an den primären Antikörper bindet. Der sekundäre Antikörper ist mit einem Enzym oder einer anderen markierten Substanz gekoppelt, die zur Detektion dient (z.B. Enzym-gekoppelter oder Fluoreszenz-markierter Antikörper).
• Waschen: Erneutes Waschen der Membran, um überschüssige, ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
• Detektion: Entwickle die Membran, um die markierten sekundären Antikörper zu detektieren. Dies kann durch chemilumineszente Detektion, Farbentwicklung oder Fluoreszenz erfolgen, abhängig von der Markierung des sekundären Antikörpers.
• Kontrollen: Verwende Kontrollen, um die Spezifität des Nachweises sicherzustellen. Dazu können Proben mit und ohne Protein B sowie Proben mit bekanntem Protein B Gehalt verwendet werden.
• Bestätigung durch Überlagerung: Vergleiche die Positionen der Banden mit einem Proteinstandard (Protein Ladder), um sicherzustellen, dass die Bande bei 75 kDa tatsächlich in der richtigen Position liegt. Eine spezifische Bande bei 75 kDa in Kombination mit den Kontrollen und einer klaren Detektion deutet stark darauf hin, dass es sich um Protein B handelt.

c)

Berechne die Konzentration des Zielproteins in der Probe, wenn die Intensität der Proteinbande nach Western Blotting proportional zur Proteinmenge ist und mittels einer Standardkurve folgende Werte gefunden wurden:

• Standard 1: 50 ng, Intensität: 1000 A.U.
• Standard 2: 100 ng, Intensität: 2000 A.U.
• Probe: 3000 A.U.

Lösung:

Konzentration des Zielproteins berechnen:

Um die Konzentration des Zielproteins in der Probe zu berechnen, verwenden wir die gegebenen Werte der Standardkurve und die gemessene Intensität der Probe.

Gegebene Daten:

• Standard 1: 50 ng, Intensität: 1000 A.U.
• Standard 2: 100 ng, Intensität: 2000 A.U.
• Probe: 3000 A.U.

Die Werte zeigen eine lineare Beziehung zwischen der Proteinmenge und der Intensität (direkte Proportionalität). Daher können wir die Gleichung einer Geraden verwenden:

Intensität = m * Menge + b

Da bei keiner Proteinmenge (0 ng) keine Intensität (0 A.U.) gemessen wird, ist der y-Achsenabschnitt b = 0. Somit erhalten wir eine einfachere Gleichung:

Intensität = m * Menge

Um die Steigung m der Linie zu berechnen, nutzen wir die Daten der Standards:

m = \frac{{2000 A.U. - 1000 A.U.}}{{100 ng - 50 ng}} = \frac{{1000 A.U.}}{{50 ng}} = 20 \frac{{A.U.}}{{ng}}

Jetzt können wir die Gleichung der Standardkurve schreiben:

Intensität = 20 * Menge

Um die Menge des Zielproteins in der Probe zu finden, setzen wir die Intensität der Probe in diese Gleichung ein:

3000 A.U. = 20 * Menge

Um die Menge zu berechnen, teilen wir die Intensität durch die Steigung:

Menge = \frac{{3000 A.U.}}{{20 \frac{{A.U.}}{{ng}}}} = 150 ng

Die Konzentration des Zielproteins in der Probe beträgt demnach 150 ng.