Laborexperimentelles Arbeiten II - Cheatsheet

Mechanismen der Genregulation in Prokaryoten und Eukaryoten

Definition:

Mechanismen der Genregulation in Prokaryoten und Eukaryoten

Details:

• Prokaryoten: Genregulation erfolgt überwiegend auf Transkriptionsebene über Operons (z.B. lac-Operon).
• Eukaryoten: Genregulation erfolgt auf mehreren Ebenen (Chromatinstruktur, Transkription, posttranskriptional, Translation, posttranslationale Modifikation).
• Operon-Modell: Repressor, Promotor, Operator und Strukturgene.
• Chromatinstruktur: Heterochromatin (stillgelegt), Euchromatin (aktiv).
• Transkription: Transkriptionsfaktoren binden an Promotor- und Enhancer-Regionen.
• Posttranskriptional: RNA-Modifikation (Spleißen, Polyadenylierung, Capping).
• Translation: Regulation durch microRNAs (miRNAs) und siRNAs.
• Posttranslationale Modifikation: Phosphorylierung, Ubiquitinierung, Acetylierung.

Epigenetische Modifikationen und ihre Funktion

Definition:

Modifikationen an DNA oder Histonen, die Genexpression regulieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

Details:

• DNA-Methylierung: Hinzufügen einer Methylgruppe (\text{CH}_3) an Cytosinbasen, v.a. an CpG-Dinukleotiden.
• Histonmodifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung etc. beeinflussen Chromatinstruktur und Zugänglichkeit der DNA.
• Regulieren Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung.
• Vererbbare Veränderungen der Genexpression, jedoch reversible.

Techniken zur Analyse der Genexpression (RT-PCR, Northern Blot, Reportergen-Assays)

Definition:

Techniken zur Analyse der Genexpression umfassen Methoden wie RT-PCR, Northern Blot und Reportergen-Assays zur Untersuchung und Quantifizierung von mRNA-Leveln.

Details:

• RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion): Erlaubt die Quantifizierung von mRNA durch Umwandlung in cDNA, gefolgt von PCR-Amplifikation.
• • Real-Time PCR ermöglicht genauere, quantitative Ergebnisse durch Fluoreszenz-Messung.
  • Gängige Enzyme: Reverse Transkriptase und Taq-Polymerase.
• Northern Blot: Separate mRNA nach Größe mittels Agarose-Gelelektrophorese und übertrage sie auf eine Membran für Hybridisierung mit markierten Proben.
• • Ermöglicht Größenbestimmung und Quantifizierung spezifischer mRNA-Transkripte.
  • Braucht große Mengen an RNA und ist zeitaufwendig.
• Reportergen-Assays: Verwende Reportergene (z.B. GFP, Luciferase) zur Messung der Genexpression.
• • Fusion von Promotor-/Enhancer-Regionen mit dem Reportergen zur Untersuchung der Kontrollelemente der Genexpression.
  • Schnelle und quantifizierbare Methode, aber oft indirekt und potenziell nicht repräsentativ für endogene Genexpression.

Proteinextraktion, -reinigung und analytische Techniken (Gel-Elektrophorese, Western Blot, Massenspektrometrie)

Definition:

Proteine aus Zellen/Geweben extrahieren, reinigen und analysieren.

Details:

• Proteinextraktion: Zelllyse (mechanisch, chemisch), Pufferzusätze (Protease-Inhibitoren)
• Proteinreinigung: Chromatographie (Ionentausch, Affinität, Größe), Fällungstechniken
• Analytische Techniken:
• Gel-Elektrophorese: Proteine trennen nach Größe/isoelektrischem Punkt (SDS-PAGE, 2D-Gelelektrophorese)
• Western Blot: Proteindetektion nach Elektrophorese (Antikörper-spezifische Bindung, Signaldetektion)
• Massenspektrometrie: Proteinanalyse durch Massenbestimmung (MALDI-TOF, ESI-MS)

Sterile Arbeitsverfahren und Zellkultivierungstechniken

Definition:

Sterile Techniken zur Vermeidung von Kontaminationen, essenziell für Zellkultivierung.

Details:

• Laminarflow-Werkbank verwenden
• Autoklavieren von Geräten und Medien
• Arbeitsflächen mit 70 % Ethanol desinfizieren
• Nur sterile Werkzeuge und Reagenzien verwenden
• Zellkulturmedien: DMEM, FBS, Antibiotika
• Inkubatoren bei 37 °C, 5 % CO2
• Passagieren und Trypsinisieren zur Zellteilung

Fortgeschrittene Genom-Editierung und Sequenzierungstechniken (CRISPR/Cas9, NGS)

Definition:

Fortgeschrittene Genom-Editierung und Sequenzierungstechniken wie CRISPR/Cas9 und NGS werden verwendet, um gezielte genetische Veränderungen durchzuführen und DNA-Sequenzen schnell und präzise zu analysieren.

Details:

• CRISPR/Cas9: adaptive Immunabwehrmechanismus in Bakterien, genutzt zur gezielten Genmodifikation
• Guide-RNA (gRNA) dirigiert Cas9-Enzym zu spezifischer DNA-Sequenz
• Cas9 erzeugt Doppelstrangbrüche, die durch NHEJ oder HDR repariert werden
• Nächste-Generation-Sequenzierung (NGS): Hochdurchsatzsequenzierung, ermöglicht parallele Analyse von Millionen DNA-Molekülen
• NGS verwendet Techniken wie Illumina, Ion Torrent, PacBio
• Anwendungen: Genomforschung, Diagnostik, personalisierte Medizin, Krebsforschung

Ethik und Sicherheit in der molekularen medizinischen Forschung

Definition:

Ethik und Sicherheit in der molekularen medizinischen Forschung betreffen den verantwortungsvollen Umgang mit biologischen Materialien und personenbezogenen Daten sowie die Einhaltung gesetzlicher und moralischer Richtlinien.

Details:

• Ethische Grundsätze: Wahrung der Menschenwürde, freiwillige Teilnahme, informierte Einwilligung.
• Regulatorische Anforderungen: Einhaltung des Gentechnikgesetzes und der EU-Biozid-Verordnung.
• Sicherheitsmaßnahmen im Labor: Tragen von Schutzkleidung, richtige Entsorgung von biologischen Abfällen, regelmäßige Schulungen.
• Gefahrenstoffe: Kennzeichnung und Handhabung nach GHS-Richtlinien.
• Datenschutz: Anonymisierung und Verschlüsselung personenbezogener Daten.

Gute Laborpraxis (GLP) und gesetzliche Richtlinien

Definition:

Regeln für Planung, Durchführung und Überwachung von Laboruntersuchungen; stellen Qualität und Integrität der Daten sicher

Details:

• Gliederung: GLP-Prinzipien, Anforderungen, Verantwortlichkeiten
• Einhaltung durch regelmäßige Inspektionen und Audits
• Datenintegrität: Korrektheit, Vollständigkeit, Nachvollziehbarkeit
• SOPs (Standard Operating Procedures) zur Sicherung einheitlicher Abläufe
• Dokumentation und Archivierung: Erhaltung der Rückverfolgbarkeit der Daten
• Rechtlicher Rahmen: Europa (Richtlinie 2004/10/EG), Deutschland (Chemikaliengesetz, Arzneimittelgesetz)