Laborexperimentelles Arbeiten II - Exam

Aufgabe 1)

Du arbeitest in einem Forschungslabor und dein Team untersucht die Unterschiede und Gemeinsamkeiten der Genregulationsmechanismen in Prokaryoten und Eukaryoten. Schwerpunktmäßig sollst du dich mit den spezifischen Mechanismen des lac-Operons in Prokaryoten und den verschiedenen Ebenen der Genregulation in Eukaryoten auseinandersetzen. Zudem wird ein Vergleich zwischen den beiden Systeme erwartet, insbesondere wie die Regulation auf Transkriptionsebene erfolgt und welche weiteren Ebenen hinzu kommen.

a)

a) Beschreibe detailliert das lac-Operon in Prokaryoten. Gehe dabei auf die Rolle der einzelnen Komponenten wie Repressor, Operator, Promotor und Strukturgene ein. Führe aus, wie das lac-Operon durch den Lac-Repressor reguliert wird und welche Rolle Laktose dabei spielt.

Lösung:

Das lac-Operon in Prokaryoten:

• Das lac-Operon ist ein Modell für die Genregulation in Prokaryoten, insbesondere in Escherichia coli. Es ermöglicht der Zelle, Laktose nur dann zu verwerten, wenn Glukose nicht verfügbar ist.
• Das Operon besteht aus mehreren Schlüsselkomponenten:
  • Promoter: Eine DNA-Sequenz, an die die RNA-Polymerase bindet, um die Transkription der Strukturgene zu initiieren.
  • Operator: Ein DNA-Abschnitt neben dem Promoter, an den der Lac-Repressor binden kann.
  • Lac-Repressor: Ein Protein, das vom lacI-Gen kodiert wird. Dieses Protein bindet an den Operator und verhindert die Transkription der Strukturgene, indem es die RNA-Polymerase blockiert.
  • Strukturgene: Die Gene, die für die Enzyme zur Verwertung von Laktose kodieren: lacZ (kodiert für β-Galactosidase), lacY (kodiert für das Laktose-Permease) und lacA (kodiert für die Transacetylase).
• Die Regulation des lac-Operons erfolgt durch den Lac-Repressor und Laktose:
  • In Abwesenheit von Laktose bindet der Lac-Repressor an den Operator und blockiert die Transkription der Strukturgene, da die RNA-Polymerase daran gehindert wird, effektiv zu starten.
  • In Anwesenheit von Laktose wirkt ein Metabolit von Laktose, Allolaktose, als Induktor. Allolaktose bindet an den Lac-Repressor und verändert dessen Konformation, wodurch der Repressor nicht mehr an den Operator binden kann.
  • Wenn der Operator frei ist, kann die RNA-Polymerase die Strukturgene transkribieren, was zur Produktion der Enzyme führt, die für die Verwertung von Laktose notwendig sind.

b)

b) Erläutere die verschiedenen Ebenen der Genregulation in Eukaryoten und differenziere zwischen Chromatinstruktur, Transkription, posttranskriptionaler Modifikation, Translation und posttranslationalen Modifikationen. Gehe dabei konkret auf die Mechanismen ein, die bei den jeweiligen Regulationsebenen beteiligt sind, und nenne jeweils ein Beispiel, das diese Mechanismen veranschaulicht.

Lösung:

Genregulation in Eukaryoten:

Eukaryoten haben mehrere komplexe Ebenen der Genregulation, die es ihnen ermöglichen, Gene präzise und differenziert zu steuern. Diese Ebenen umfassen:

• Chromatinstruktur: Die Verpackung der DNA in Chromatin beeinflusst die Zugänglichkeit der Gene für die Transkription.
  • Mechanismen:
    • Histon-Modifikation: Histonproteine können acetyliert, methyliert oder phosphoryliert werden. Zum Beispiel führt die Acetylierung von Lysinresten an den Histonen durch Histon-Acetyltransferasen (HATs) zu einem lockereren Chromatin und ermöglicht die Transkription.
    • Chromatin-Remodeling-Komplexe: Diese Komplexe verschieben Nukleosomen oder entfernen sie teilweise, um die DNA zugänglich zu machen. Ein Beispiel ist der SWI/SNF-Komplex.
    • DNA-Methylierung: Methylierung von Cytosinbasen in Promotorregionen durch DNA-Methyltransferasen (DNMTs) führt meist zu einer Gen-Silencing. Ein bekanntes Beispiel ist die X-Inaktivierung bei Frauen.
• Transkription: Die Kontrolle der Genexpression auf der Transkriptionsebene ist entscheidend.
  • Mechanismen:
    • Transkriptionsfaktoren: Diese Proteine binden an spezifische DNA-Sequenzen (Promotoren oder Enhancer) und beeinflussen die Aktivität der RNA-Polymerase. Ein Beispiel ist das p53-Protein, das als Transkriptionsfaktor die Expression von Genen induziert, die an der Apoptose beteiligt sind.
    • Enhancer und Silencer: DNA-Elemente, die die Transkriptionsaktivität verstärken oder unterdrücken können. Beispiel: Der Enhancer des Immunoglobulin-Schwerketten-Locus fördert die Expression von Antikörpergenen in B-Zellen.
    • Transkriptions-Initiationskomplex: Der Zusammenschluss von RNA-Polymerase und allgemeinen Transkriptionsfaktoren am Promotor. Beispiel: Der TATA-Box-Bindeprotein (TBP) ist Teil des TFIID-Komplexes und bindet an die TATA-Box im Promotor.
• Posttranskriptionale Modifikation: Nach der Transkription werden RNA-Moleküle modifiziert und reguliert.
  • Mechanismen:
    • RNA-Spleißen: Entfernen von Introns und Zusammenfügen von Exons. Beispiel: Das Spleißosom entfernt Introns aus der prä-mRNA und bildet die reife mRNA.
    • 5'-Capping und Polyadenylierung: Hinzufügen einer 5'-Cap-Struktur und eines Poly-A-Schwanzes an das mRNA-Ende, um die Stabilität und den Export aus dem Zellkern zu ermöglichen. Beispiel: Die mRNA des Hitzeschock-Proteins wird polyadenyliert, um ihre Stabilität bei thermischem Stress zu erhöhen.
    • RNA-Editing: Chemische Veränderung der mRNA-Nukleotidsequenz. Beispiel: Apolipoprotein-B mRNA in den Leberzellen wird durch Deaminierung bearbeitet, wodurch eine kürzere Proteinform in der Leber gebildet wird.
• Translation: Regulation der Proteinsynthese aus mRNA.
  • Mechanismen:
    • Ribosomale Bindung: Initiationsfaktoren fördern die Bindung der mRNA an das Ribosom. Beispiel: Der mTOR-Signalweg reguliert die Verfügbarkeit von Initiationsfaktoren für die Proteinbiosynthese.
    • MicroRNAs (miRNAs): Kleine RNA-Moleküle, die an mRNAs binden und deren Translation verhindern oder deren Abbau fördern. Beispiel: miRNA-21 ist bekannt dafür, die Translation von Tumorsuppressor-Genen in verschiedenen Krebsarten zu unterdrücken.
• Posttranslationale Modifikationen: Änderungen an Proteinen nach der Translation, die ihre Funktion, Lokalisation oder Stabilität beeinflussen.
  • Mechanismen:
    • Phosphorylierung: Hinzufügen von Phosphatgruppen durch Kinasen. Beispiel: Die Phosphorylierung von CREB (cAMP Response Element-Binding Protein) bei der Signaltransduktion durch cAMP.
    • Ubiquitinierung: Markierung von Proteinen für den Abbau im Proteasom. Beispiel: Die Ubiquitinierung von Cyclin B signalisiert dessen Abbau während des Zellzyklus.
    • Glykosylierung: Hinzufügen von Zuckerresten an Proteine. Beispiel: Die Glykosylierung von Erythropoietin ist wichtig für seine biologische Aktivität und Zirkulation im Körper.
    • Proteolytische Verarbeitung: Aktivierung oder Inaktivierung von Proteinen durch proteolytische Spaltung. Beispiel: Die Spaltung von Proinsulin zu aktivem Insulin durch Proteasen.

c)

c) Vergleiche die Genregulation auf Transkriptionsebene zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Diskutiere dabei die unterschiedlichen Mechanismen und die Komplexität der Regulation in beiden Zelltypen. Stelle dabei dar, warum die Regulation in Eukaryoten auf mehreren Ebenen abläuft und welche Vorteile dies für die Zelle hat.

Lösung:

Vergleich der Genregulation auf Transkriptionsebene zwischen Prokaryoten und Eukaryoten:

• Regulation in Prokaryoten:
  • Prokaryoten, wie Bakterien, haben eine relativ einfachere Genregulation.
  • Hauptmechanismen der Regulation:
    • Operon-Struktur: Gene, die für bestimmte Funktionen notwendig sind, sind oft in Operons angeordnet, wobei ein einziger Promoter die Transkription mehrerer Strukturgene steuert. Ein bekannteres Beispiel ist das lac-Operon.
    • Repressor und Aktivator-Proteine: Repressorproteine binden an Operatoren und blockieren die Transkription, während Aktivatorproteine die Bindung der RNA-Polymerase fördern. Beispiel: Der Lac-Repressor und der Catabolitaktivatorprotein (CAP) beim lac-Operon.
    • Negative und positive Regulation: Durch negative Regulation wird die Expression von Genen durch Repressoren verhindert, während bei positiver Regulation Aktivatoren benötigt werden, um die Transkription zu initiieren.
  • Die Regulation ist oft schnell anpassungsfähig und reagiert sofort auf Umweltveränderungen, was für die schnelle Anpassung der Bakterien entscheidend ist.
• Regulation in Eukaryoten:
  • Eukaryoten haben eine viel komplexere Genregulation, da ihre Genexpression durch mehrere Ebenen reguliert wird.
  • Hauptmechanismen der Regulation:
    • Transkriptionsfaktoren: Diese Proteine binden an spezifische DNA-Sequenzen (Promotoren, Enhancer, Silencer) und modulieren die Aktivität der RNA-Polymerase. Beispiel: Hormonrezeptoren wie der Östrogenrezeptor regulieren die Expression hormonsensitiver Gene.
    • Chromatinstruktur und Epigenetik: Modifikationen wie Histon-Acetylierung, Methylierung und DNA-Methylierung beeinflussen die Zugänglichkeit der DNA. Beispiel: Die Methylierung von CpG-Inseln in Promotorregionen führt oft zur Gen-Silencing.
    • Enhancer und Silencer: DNA-Elemente, die weit entfernt vom Zielgen liegen und die Transkription verstärken oder unterdrücken können. Beispiel: Der Locus control region (LCR) des β-Globin-Gens.
    • Transkriptions-Initiationskomplex: Ein komplexer Zusammenschluss mehrerer Proteine, die die RNA-Polymerase rekrutieren und die Initiation der Transkription ermöglichen. Dies umfasst allgemeine Transkriptionsfaktoren und Mediator-Komplexe.
  • Die Regulation erfolgt auf mehreren Ebenen und involviert komplexe Netzwerke von Interaktionen, die eine feine Abstimmung der Genexpression ermöglichen.
  • Vorteile der mehrschichtigen Regulation:
    • Präzision und Flexibilität: Eukaryotische Zellen können auf komplexe Umweltsignale und Entwicklungsprogramme präzise reagieren.
    • Zell- und Gewebespezifische Expression: Unterschiedliche Zelltypen und Gewebe können spezifische Genexpressionsmuster aufrechterhalten, was zur Zellfunktion und Differenzierung beiträgt.
    • Anpassung an komplexe Lebenszyklen: Anpassung an verschiedenste Umweltbedingungen und Regulation während der Entwicklung und Differenzierung.
    • Regulation von mehrstufigen Prozessen: Ermöglicht die Kontrolle der Genexpression auf mehreren Ebenen von der DNA-Stufe bis hin zur posttranslationalen Modifikation der hergestellten Proteine.

Aufgabe 2)

Epigenetische Modifikationen und ihre FunktionModifikationen an DNA oder Histonen, die Genexpression regulieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

• DNA-Methylierung: Hinzufügen einer Methylgruppe (\text{CH}_3) an Cytosinbasen, v.a. an CpG-Dinukleotiden.
• Histonmodifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung etc. beeinflussen Chromatinstruktur und Zugänglichkeit der DNA.
• Regulieren Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung.
• Vererbbare Veränderungen der Genexpression, jedoch reversible.

a)

Aufgabe 1: Erkläre den Mechanismus der DNA-Methylierung und ihre Auswirkungen auf die Genexpression. Welche Enzyme sind daran beteiligt und welche Rolle spielen sie?

Lösung:

Epigenetische Modifikationen und ihre FunktionModifikationen an DNA oder Histonen, die Genexpression regulieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

• DNA-Methylierung: Hinzufügen einer Methylgruppe (CH₃) an Cytosinbasen, v.a. an CpG-Dinukleotiden.
• Histonmodifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung etc. beeinflussen Chromatinstruktur und Zugänglichkeit der DNA.
• Regulieren Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung.
• Vererbbare Veränderungen der Genexpression, jedoch reversible.

Aufgabe 1: Erkläre den Mechanismus der DNA-Methylierung und ihre Auswirkungen auf die Genexpression. Welche Enzyme sind daran beteiligt und welche Rolle spielen sie?

• DNA-Methylierung ist ein epigenetischer Mechanismus, bei dem eine Methylgruppe (\text{CH}₃) an die 5-Position des Cytosin-Rings angefügt wird, hauptsächlich an CpG-Dinukleotiden.
• Diese Methylierung wirkt in der Regel als Repressor der Genexpression.
• Die Enzyme, die die Methylierung katalysieren, werden als DNA-Methyltransferasen (DNMTs) bezeichnet. Wichtige Mitglieder dieser Enzymfamilie sind DNMT1, DNMT3A und DNMT3B.
• DNMT1 ist hauptsächlich für die Aufrechterhaltung der Methylierungsmuster während der DNA-Replikation verantwortlich, indem sie bestehende Methylierungsmuster auf den neuen DNA-Strang überträgt.
• DNMT3A und DNMT3B sind hauptsächlich an der De-novo-Methylierung beteiligt, was bedeutet, dass sie neue Methylierungsmuster auf unbeeinflusste DNA anbringen.
• Durch das Hinzufügen von Methylgruppen an die DNA können diese Enzyme die Bindung von Transkriptionsfaktoren und anderen Proteinen verhindern, was zu einer verminderten Genexpression führt.
• Die Auswirkungen der DNA-Methylierung auf die Genexpression können umfangreich sein und Konsequenzen für Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung haben.
• Weil diese modifikationen reversibel sind, bieten sie Zellen eine Möglichkeit, flexibel auf Umweltveränderungen zu reagieren.

b)

Aufgabe 2: Diskutiere die verschiedenen Arten der Histonmodifikationen und ihre Bedeutung für die Chromatinstruktur und Genregulation. Gib Beispiele für mindestens zwei unterschiedliche Modifikationen und ihre spezifischen Effekte.

Lösung:

Epigenetische Modifikationen und ihre FunktionModifikationen an DNA oder Histonen, die Genexpression regulieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

• DNA-Methylierung: Hinzufügen einer Methylgruppe (CH₃) an Cytosinbasen, v.a. an CpG-Dinukleotiden.
• Histonmodifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung etc. beeinflussen Chromatinstruktur und Zugänglichkeit der DNA.
• Regulieren Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung.
• Vererbbare Veränderungen der Genexpression, jedoch reversible.

Aufgabe 2: Diskutiere die verschiedenen Arten der Histonmodifikationen und ihre Bedeutung für die Chromatinstruktur und Genregulation. Gib Beispiele für mindestens zwei unterschiedliche Modifikationen und ihre spezifischen Effekte.

• Histonmodifikationen sind posttranslationale Veränderungen der Histonproteine, die maßgeblich die Chromatinstruktur und somit die Zugänglichkeit der DNA für die Transkription beeinflussen.
• Es gibt verschiedene Arten von Histonmodifikationen, darunter Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Sumoylierung.
Beispiele für zwei unterschiedliche Modifikationen:
• Acetylierung: Diese Modifikation erfolgt an den Lysinresten (K) der Histone durch das Hinzufügen einer Acetylgruppe (\text{COCH}_3).
• Enzyme: Histonacetyltransferasen (HATs) fügen Acetylgruppen hinzu, während Histondeacetylasen (HDACs) diese entfernen.
• Durch die Acetylierung wird die positive Ladung des Lysins neutralisiert, was die Wechselwirkung zwischen den Histonen und der negativ geladenen DNA schwächt.
• Dies führt zu einer Lockerung der Chromatinstruktur (Euchromatin), was die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren erhöht und somit die Genexpression aktiviert.
• Methylierung: Diese Modifikation beinhaltet das Hinzufügen einer oder mehrerer Methylgruppen an Arginin- (R) oder Lysinreste (K) der Histone.
• Enzyme: Histonmethyltransferasen (HMTs) fügen Methylgruppen hinzu, während Histondemethylasen (HDMs) sie entfernen.
• Die Wirkung der Methylierung hängt stark vom spezifischen Lysinrest und dem Methylierungsgrad (mono-, di-, oder trimethyliert) ab. Beispielsweise:
• Trimethylierung von H3K4 (Histon H3 am Lysin 4) ist häufig mit aktiver Transkription assoziiert.
• Trimethylierung von H3K27 (Histon H3 am Lysin 27) ist normalerweise mit der Repression von Genen verbunden.
• Diese Modifikationen sind Teil eines komplexen epigenetischen Codes, der die Genexpression fein reguliert und auf Umweltveränderungen reaktionsfähig ist.
• Sie spielen eine essentielle Rolle in der Regulierung der Chromatinstruktur und Genaktivität, und ihre Fehlregulierung kann zu verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs führen.

c)

Aufgabe 3: Angenommen, in einer Zelle erfolgt eine Methylierung an 20% der CpG-Dinukleotide eines bestimmten Gens. Wenn das Gen eine Länge von 3000 Basenpaaren hat und 200 CpG-Stellen beinhaltet, wie viele dieser Stellen werden methyliert? Berechne zudem, wie sich diese Methylierung statistisch auf die Genexpression auswirken könnte.

Lösung:

Epigenetische Modifikationen und ihre FunktionModifikationen an DNA oder Histonen, die Genexpression regulieren, ohne die DNA-Sequenz zu verändern.

• DNA-Methylierung: Hinzufügen einer Methylgruppe (CH₃) an Cytosinbasen, v.a. an CpG-Dinukleotiden.
• Histonmodifikationen: Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung etc. beeinflussen Chromatinstruktur und Zugänglichkeit der DNA.
• Regulieren Zellfunktion, Entwicklung und Differenzierung.
• Vererbbare Veränderungen der Genexpression, jedoch reversible.

Aufgabe 3: Angenommen, in einer Zelle erfolgt eine Methylierung an 20% der CpG-Dinukleotide eines bestimmten Gens. Wenn das Gen eine Länge von 3000 Basenpaaren hat und 200 CpG-Stellen beinhaltet, wie viele dieser Stellen werden methyliert? Berechne zudem, wie sich diese Methylierung statistisch auf die Genexpression auswirken könnte.

• Um die Anzahl der methylierten CpG-Stellen zu berechnen, kannst Du die Gesamtzahl der CpG-Stellen mit dem Prozentsatz der Methylierung multiplizieren:
• • Gegeben: Anzahl der CpG-Stellen: 200 Methylierungsprozentsatz: 20% (oder 0,20 in Dezimalform)
  • Rechnung: Anzahl der methylierten Stellen = 200 * 0,20 = 40
  • Also, 40 von den 200 CpG-Stellen werden methyliert.
• Auswirkungen auf die Genexpression:Die Methylierung von CpG-Dinukleotiden hat in der Regel repressiven Charakter auf die Genexpression. Die Hinzufügung von Methylgruppen an die CpG-Stellen zieht Proteine an, die die Zugänglichkeit der DNA für Transkriptionsfaktoren und somit für die Transkriptionsmaschinerie verringern.
• Statistisch betrachtet könnte die Methylierung von 20% der CpGs folgendes bewirken:
• Wenn sich diese 40 methylierten Stellen in wichtigen regulatorischen Regionen des Gens befinden, wie z.B. Promotoren oder Enhancer, kann dies die Transkriptionsaktivität des Gens signifikant reduzieren.
• Die Methylierung kann zur Chromatin-Kondensation beitragen, was die DNA weniger zugänglich macht und somit die Genexpression hemmt.
• Insgesamt würde die Methylierung von 20% der CpG-Stellen dieses Gens statistisch wahrscheinlich zu einer Reduktion der Genexpression führen.

Aufgabe 3)

Betrachten Sie die folgenden Techniken zur Analyse der Genexpression: RT-PCR, Northern Blot und Reportergen-Assays. Sie sollen eine umfassende Analyse eines spezifischen mRNA-Transkripts durchführen und die Vorteile und Nachteile jeder Methode abwägen.

a)

• Wählen Sie ein spezifisches mRNA-Transkript, welches Sie analysieren möchten. Beschreiben Sie detailliert, wie Sie dieses Transkript mittels RT-PCR quantifizieren würden. Gehen Sie dabei besonders auf die einzelnen Schritte der Methode ein (z.B. Isolierung der mRNA, Reverse Transkription, PCR-Amplifikation und Real-Time PCR).

Lösung:

Beispiel eines mRNA-TranskriptsEin Beispiel für ein spezifisches mRNA-Transkript, das analysiert werden soll, könnte die mRNA des Tumorsuppressorgens p53 sein. Dieser Transkriptionsfaktor spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Zellzyklus und der Apoptose.

• Schritte zur Quantifizierung des p53-mRNA-Transkripts mittels RT-PCR:

1. Isolierung der mRNA:Um die p53-mRNA zu isolieren, müssen die entsprechenden Zellen oder Gewebeproben gesammelt werden. Anschließend wird die RNA-Extraktion durchgeführt, häufig mit einem Trizol-Reagenz oder einem kommerziellen RNA-Isolierungssatz. Der Prozess besteht aus den folgenden Schritten:
   • Lyse der Zellen: Die Zellen werden lysiert, um die RNA freizusetzen.
   • Phase-Trennung: Dies beinhaltet die Zugabe von Chloroform, gefolgt von Zentrifugation, um die wässrige Phase, die die RNA enthält, von den organischen und interphasischen Schichten zu trennen.
   • RNA-Fällung: Isopropanol wird hinzugefügt, um die RNA aus der wässrigen Phase zu fällen, gefolgt von Zentrifugation.
   • Waschung und Auflösung: Der RNA-Pellet wird mit Ethanol gewaschen und anschließend in RNase-freiem Wasser gelöst.
2. Reverse Transkription:Die isolierte mRNA wird mittels Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Hierzu wird ein spezifischer Primer oder ein Oligo-dT- oder Random-Hexamer-Primer verwendet. Die Reaktionsschritte sind:
   • Mischen der mRNA mit Primern und Inkubation, um die Primer hybridisieren zu lassen.
   • Zugabe von Reverse Transkriptase, dNTPs und Pufferlösungen zur Mischung.
   • Durchführung der Reverse Transkription bei einer bestimmten Temperatur (typischerweise 42-45°C) für etwa 60 Minuten.
3. PCR-Amplifikation:Die cDNA dient als Vorlage für die PCR-Amplifikation. Zu den benötigten Komponenten gehören:
   • Spezifische Primer für das p53-Gen
   • dNTPs
   • DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase)
   • Pufferlösung
   Die PCR-Verfahrensschritte umfassen:
   • Denaturierung: Erhitzen der Mischung auf 94-95°C für 30 Sekunden, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren.
   • Annealing: Abkühlen auf 50-65°C für 30 Sekunden, damit die Primer an die Ziel-cDNA binden können.
   • Elongation: Erhitzen auf 72°C für 1 Minute, um die DNA zu synthetisieren.
   • Wiederholung dieser Zyklen typischerweise 25-35 Mal.
4. Real-Time PCR (Quantitative PCR):Hierbei handelt es sich um einen quantitativen Ansatz der PCR. Es werden fluoreszierende Farbstoffe oder Sonden verwendet, um die Amplifikation in Echtzeit zu überwachen. Die Schritte sind:
   • Vorbereitung der Mastermischung: Enthält die cDNA, spezifische Primer, DNA-Polymerase, dNTPs, Pufferlösung und einen fluoreszierenden Farbstoff (z.B. SYBR Green) oder eine Fluoreszenzsonde (z.B. TaqMan-Sonde).
   • Thermocycling: Die gleiche PCR-Amplifikation wie oben beschrieben wird in einem Echtzeit-PCR-Gerät durchgeführt, das die Fluoreszenz in jedem Zyklus misst.
   • Analyse der Ergebnisse: Die Fluoreszenz-Signale werden aufgezeichnet und in Beziehung zur Anzahl der Zyklen gesetzt. Die Ct-Werte (Threshold Cycle) werden verwendet, um die Menge der Ausgangs-mRNA zu quantifizieren, oft unter Verwendung einer Standardkurve oder relativer Quantifizierungsmethoden.

b)

• Skizzieren und erklären Sie den Ablauf des Northern Blot-Verfahrens für dasselbe Transkript. Diskutieren Sie die Vor- und Nachteile dieses Verfahrens im Vergleich zu RT-PCR, insbesondere in Bezug auf die benötigte RNA-Menge, Zeitaufwand und die Genauigkeit der Ergebnisse.

Lösung:

Northern Blot-VerfahrenDas Northern Blot-Verfahren wird zur Analyse der Genexpression verwendet und überprüft die Größe und Menge eines spezifischen mRNA-Transkripts in einer RNA-Probe. Im Folgenden skizziere ich den Ablauf des Northern Blot-Verfahrens für das p53-mRNA-Transkript:

• Schritte des Northern Blot-Verfahrens:

1. Isolierung der RNA:Wie bei der RT-PCR wird die Gesamtrna aus den Zellen oder Geweben isoliert, indem Verfahren wie die Verwendung von Trizol oder kommerziellen RNA-Isolierungssätzen angewendet werden. Die Schritte umfassen:
   • Lyse der Zellen
   • Phase-Trennung
   • RNA-Fällung
   • Waschung und Auflösung
2. Auftrennung der RNA mittels Gel-Elektrophorese:Die isolierte RNA wird auf einem Agarose-Gel mit Formaldehyd oder auf einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt. Formaldehyd wird verwendet, um die RNA denaturiert zu halten und genaue Größenunterschiede zu erkennen. Schritte umfassen:
   • Laden der RNA-Proben in die Gel-Taschen
   • Auftragen einer elektrischen Spannung, um die RNA-Fragmente nach Größe zu trennen
   • Färben des Gels mit Ethidiumbromid oder anderen Farbstoffen, um die RNA-Banden sichtbar zu machen
3. Transfer auf eine Membran:Die RNA wird aus dem Gel auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran übertragen (Blotting). Dies ermöglicht die Haltbarkeit und Zugänglichkeit der RNA für weitere Analysen. Transfermethoden umfassen:
   • Kapillartransfer: Die RNA wird durch Kapillarkräfte auf die Membran gezogen.
   • Elektrotransfer: Elektrische Spannung wird verwendet, um die RNA auf die Membran zu übertragen.
4. Hybridisierung mit spezifischer Sonde:Die Membran wird mit einer markierten DNA- oder RNA-Sonde, die komplementär zum Ziel-mRNA-Transkript (p53) ist, hybridisiert. Schritte umfassen:
   • Vorhybridisierung: Die Membran wird in einer Lösung inkubiert, um unspezifische Bindungen zu blockieren.
   • Hybridisierung: Die Membran wird mit der Sonde inkubiert, um spezifische Bindungen zwischen der Sonde und der Ziel-RNA zu ermöglichen.
5. Detektion der spezifischen mRNA:Die gebundene Sonde wird durch verschiedene Methoden nachgewiesen, abhängig von der Markierung der Sonde (radioaktive, fluoreszierende oder chemilumineszente Markierungen). Schritte umfassen:
   • Waschung der Membran, um unspezifische Bindungen zu entfernen
   • Detektion der Signalintensität zur Quantifizierung der Ziel-RNA

• Vor- und Nachteile des Northern Blot-Verfahrens im Vergleich zu RT-PCR:

• Vorteile:
  • Überprüfung der RNA-Größe: Northern Blot ermöglicht die Bestimmung der Größe des mRNA-Transkripts, was helfen kann, alternative Spleißformen zu identifizieren.
  • Molekulare Beständigkeit: Northern Blots können die Existenz mehrerer Transkripe übereinander zeigen, was in RT-PCR nicht möglich ist.
• Nachteile:
  • Benötigte RNA-Menge: Northern Blot erfordert eine größere Menge an Ausgangs-RNA im Vergleich zu RT-PCR. RT-PCR benötigt in der Regel weniger RNA für die Analyse.
  • Zeitaufwand: Das Northern Blot-Verfahren ist zeitaufwändig, da es mehrere Tage dauern kann, während RT-PCR in wenigen Stunden abgeschlossen werden kann.
  • Genauigkeit: RT-PCR bietet genauere quantitative Ergebnisse und ist empfindlicher hinsichtlich geringer RNA-Mengen im Vergleich zum Northern Blot.
  • Technischer Aufwand: Northern Blot ist technisch anspruchsvoller und erfordert spezifische Ausrüstung und markierte Sonden, was es weniger zugänglich macht im Vergleich zur RT-PCR.

c)

• Entwerfen Sie ein Experiment, bei dem Sie die Promotoraktivität des gewählten Gens mit einem Reportergen-Assay (z.B. mit Luciferase oder GFP) untersuchen. Beschreiben Sie, wie Sie den Promotor an das Reportergen fusionieren und in eine Zelle einbringen würden. Diskutieren Sie die möglichen Interpretationen der Ergebnisse sowie die Einschränkungen dieser Methode im Vergleich zu RT-PCR und Northern Blot.

Lösung:

Entwurf eines Experiments zur Untersuchung der Promotoraktivität mittels Reportergen-AssayFür dieses Experiment verwenden wir fluoreszierendes Protein (GFP) als Reportergen, um die Promotoraktivität des p53-Gens zu analysieren.

• Schritte zur Durchführung des Experiments:

1. Isolation und Klonierung des Promotors:Der Promotor des p53-Gens wird mittels PCR isoliert. Die spezifischen Primer beinhalten Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen, um die Klonierung zu erleichtern.
   • Amplifikation des p53-Promotors durch PCR
   • Verdau der PCR-Produkte und des Plasmidvektors mit den jeweiligen Restriktionsenzymen
   • Ligatur des isolierten Promotors in den Plasmidvektor upstream des GFP-Gens
2. Transformation und Selektion:Der rekombinante Plasmidvektor wird in kompetente E. coli-Zellen transformiert.
   • Transformation der Plasmide in kompetente Bakterien
   • Selektion der transformierten Bakterien auf Agarplatten mit Antibiotika
   • Verifizierung der positiven Klone durch Kolonie-PCR oder Restriktionsverdau
3. Transfektion in eukaryotische Zellen:Der bestätigte rekombinante Plasmidvektor wird dann in eukaryotische Zellen (z.B. HEK293) transfiziert, um die Promotoraktivität zu analysieren.
   • Vorbereitung der eukaryotischen Zellen für die Transfektion (Kultur und Passage)
   • Transfektion der Zellen mit dem rekombinanten Plasmid mittels Lipofektion oder Elektroporation
   • Inkubation der Zellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression des Reportergens
4. Messung der GFP-Expression:Die Aktivität des p53-Promotors wird durch die Messung der GFP-Fluoreszenz in den transfizierten Zellen analysiert.
   • Fluoreszenzmikroskopie zur Detektion der GFP-Expression
   • Fluoreszenz-Spektralphotometrie oder Durchflusszytometrie zur quantitativen Analyse der GFP-Expression

• Interpretation der Ergebnisse:
  • Erhöhte GFP-Expression: Hohe Fluoreszenzwerte deuten auf eine starke Aktivität des p53-Promotors hin und damit auf eine hohe Transkriptionsrate des Reportergens.
  • Geringe GFP-Expression: Niedrige Fluoreszenzwerte deuten auf eine geringe Aktivität des p53-Promotors hin und damit auf eine niedrige Transkriptionsrate des Reportergens.
  • Negative Kontrolle: Zellen, die mit einem Plasmid ohne Promotor transfiziert wurden, sollten keine GFP-Expression zeigen. Dies dient als Basislinie für die Interpretation der Ergebnisse.

• Einschränkungen im Vergleich zu RT-PCR und Northern Blot:
  • Indirekte Messung: Der Reportergen-Assay misst die Aktivität des Promotors indirekt durch die Expression des Reportergens. Veränderungen in der Promotoraktivität können schwer von post-transkriptionalen Effekten zu trennen sein.
  • Keine Quantifizierung der endogenen mRNA: Im Gegensatz zu RT-PCR und Northern Blot liefert der Reportergen-Assay keine direkten Informationen über die Menge der endogenen mRNA.
  • Klonierungsaufwand: Der Berichtergen-Assay erfordert aufwändige Klonierungs- und Transfektionsverfahren, was zusätzliche Zeit und Ressourcen in Anspruch nimmt.
  • Untersuchung der Promotoraktivität: Während RT-PCR und Northern Blot quantitative Daten über die mRNA-Expression liefern, eignet sich der Reportergen-Assay besser für die Analyse der Promotorstärke und -regulation.

Aufgabe 4)

Du arbeitest an einem Forschungsprojekt, welches die Identifizierung und Analyse eines unbekannten Proteins aus Herzzellenmäusen beinhaltet. Sorge dafür, dass Du das Protein zuerst extrahierst, reinigst und anschließend mit verschiedenen analytischen Techniken charakterisierst. Nutze verschiedene Techniken wie Zelllyse, chromatographische Methoden sowie analytische Techniken wie Gel-Elektrophorese, Western Blot und Massenspektrometrie.

a)

Beschreibe die Schritte, die Du zur Zelllyse und Proteinextraktion unternehmen würdest. Stelle sicher, dass Du auf die Vorteile und spezifischen Anwendungsbedingungen mechanischer und chemischer Zelllysemethoden eingehst. Welche Pufferzusätze würdest Du verwenden und warum?

Lösung:

• Zelllyse und Proteinextraktion:
Um ein Protein aus Herzzellenmäusen zu extrahieren, musst Du zunächst die Zellen lysieren, um die Proteine freizusetzen. Es gibt verschiedene Methoden zur Zelllyse, die Du verwenden kannst:
• Mechanische Zelllyse:
• Homogenisation: Dies geschieht mithilfe eines Dounce-Homogenisators oder eines French-Press. Diese Methode zerbricht die Zellmembran durch physikalische Kraft. Vorteile sind, dass sie keine zusätzlichen Chemikalien benötigt und für viele Zelltypen geeignet ist.
• Ultraschallbehandlung (Sonication): Hierbei werden Ultraschallwellen verwendet, um die Zellmembran zu zerbrechen. Diese Methode ist effektiv und schnell und eignet sich gut für kleine Zellmengen. Allerdings kann die Wärmeentwicklung Proteine denaturieren.
• Chemische Zelllyse:
• Detergenzien: SDS, Triton X-100 und NP-40 werden häufig verwendet. Diese Substanzen lösen die Zellmembran auf und ermöglichen den Austritt der Proteine. Der Vorteil ist eine schonende Behandlung der Proteine, aber es kann Störungen bei der Folgeanalyse geben.
• Enzyme: Lysozym wird häufig zur Lyse von Bakterienzellen verwendet. Es baut die Zellwand ab. Anschließend können Osmose oder Detergenzien verwendet werden.
• Für die Proteinextraktion benötigst Du geeignete Pufferzusätze:
• Protease-Inhibitoren: Diese werden zugegeben, um den Abbau der Proteine durch Proteasen zu verhindern. Beispiele sind PMSF, Leupeptin, und Aprotinin.
• Reduzierende Mittel: DTT oder 2-Mercaptoethanol werden verwendet, um Disulfidbrücken zu reduzieren und so die Proteine in ihrer nativen Konformation zu halten.
• Salze: KCl oder NaCl werden hinzugefügt, um eine ionische Stärke bereitzustellen, die die Stabilität der Proteine fördert.
• PH-Puffer: Tris-HCl oder Phosphatpuffer werden verwendet, um einen stabilen pH-Wert zu gewährleisten, was für die Proteinaktivität wichtig ist.

b)

Erkläre detailliert die Schritte der Proteinreinigung mittels Ionenaustausch-Chromatographie. Welche Bedeutung hat der pH-Wert des Puffersystems in diesem Prozess und wie wirkt er sich auf die Bindungsaffinität der Proteine zur Säule aus? Anhand welcher Kriterien würdest Du die passenden Pufferbedingungen auswählen?

Lösung:

• Schritte der Proteinreinigung mittels Ionenaustausch-Chromatographie:
• Vorbereitung der Puffer und Säule:
• Bereite alle benötigten Pufferlösungen vor. Die wichtigsten Pufferlösungen umfassen einen Startpuffer und einen Elutionspuffer. Der pH-Wert muss sorgfältig eingestellt werden, da er die Ladung der Proteine beeinflusst.
• Gleichzeitig reinige und equilibrie die Ionenaustauschersäule mit dem entsprechenden Gleichgewichtspuffer, um sicherzustellen, dass die Säule für die Bindung der Proteine bereit ist.
• Auftragen der Proteinprobe:
• Die zielgerichtete Proteinlösung wird auf die equilibrierte Säule aufgebracht. Die Wahl des Puffers sollte so getroffen werden, dass das gewünschte Protein eine starke Bindung an die Ionenaustauscherharzkügelchen eingeht, während unerwünschte Proteine weniger stark binden und durch den Startpuffer weggespült werden.
• Waschen der Säule:
• Sobald die Proteinprobe aufgebracht wurde, wird die Säule mit dem Gleichgewichtspuffer gespült, um nicht gebundene und schwach gebundene Proteine zu entfernen.
• Elution der gebundenen Proteine:
• Die Elution erfolgt durch schrittweise oder kontinuierliche Änderung des Salzgehalts oder pH-Werts des Elutionspuffers. Diese Änderungen stören die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Protein und der Säule, wodurch das Protein eluiert wird.
• Je nach Art der Ionenaustauschchromatographie (anionisch oder kationisch) werden unterschiedliche Methoden angewandt. Anionenaustauscher binden Proteine bei niedrigem pH-Wert und eluieren diese bei höherem pH-Wert, während Kationenaustauscher das Gegenteil tun.
• Sammlung der Eluate:
• Die eluierenden Proteine werden in Fraktionen gesammelt und anschließend mittels geeigneter Methoden (z.B. UV-Absorption, SDS-PAGE) analysiert, um die Anwesenheit des gewünschten Proteins festzustellen.
• Bedeutung des pH-Werts des Puffersystems:
• Der pH-Wert ist ein entscheidender Faktor in der Ionenaustauschchromatographie. Da Proteine ihr Bindungsverhalten entsprechend ihrer Ladung ändern, beeinflusst der pH-Wert die Nettoladung der Proteine.
• Der pH-Wert wird so gewählt, dass das Zielprotein die richtige Ladung zur Bindung an die Säule besitzt: Für anionische Austauschchromatographie sollte der pH-Wert oberhalb des isoelektrischen Punkts (pI) des Proteins liegen und für kationische Austauschchromatographie darunter.
• Kriterien zur Auswahl der Pufferbedingungen:
• Isoelektrischer Punkt (pI) des Proteins: Der pH-Wert des Puffers sollte so eingestellt sein, dass das Zielprotein eine entgegengesetzte Ladung zur Säule aufweist.
• Stabilität des Proteins: Der pH und die Ionenstärke sollten im Bereich liegen, in dem das Protein stabil ist und seine native Struktur behält.
• Pufferkapazität: Der Puffer sollte eine ausreichende Kapazität haben, um den pH während des gesamten Prozesses stabil zu halten.
• Kompatibilität mit nachfolgenden Analyseverfahren: Die Pufferbedingungen sollten so gewählt werden, dass sie die nachfolgenden Schritte wie Gel-Elektrophorese, Western Blot oder Massenspektrometrie nicht stören.

c)

Nachdem das Protein gereinigt wurde, möchtest Du es mittels SDS-PAGE trennen. Erläutere, wie SDS-PAGE funktioniert und warum diese Technik verwendet wird. Welche Informationen kannst Du durch diese Methode über das Protein gewinnen? Wie könnte die anschließende Detektion mittels Western Blot durchgeführt werden?

Lösung:

• SDS-PAGE: Funktionsweise und Anwendung
• Grundprinzip:
• SDS-PAGE steht für Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Diese Technik wird verwendet, um Proteine nach ihrer Größe zu trennen. SDS ist ein Detergens, das Proteine denaturiert und negativ auflädt.
• Der Prozess beginnt mit der Vorbereitung der Proteinproben, denen SDS und ein Reduktionsmittel wie DTT oder 2-Mercaptoethanol hinzugefügt werden. Diese Substanzen brechen die Disulfidbrücken und sorgen dafür, dass die Proteine linearisiert und gleichmäßig negativ geladen werden, proportional zu ihrer Länge.
• Die Proben werden dann in die Taschen eines Polyacrylamidgels geladen. Wenn eine elektrische Spannung angelegt wird, wandern die Proteine durch das Gel. Kleinere Proteine bewegen sich schneller und leichter durch die Poren des Gels, während größere Proteine langsamer wandern.
• Verwendung:
• SDS-PAGE wird verwendet, um Proteine nach ihrer Größe zu trennen und zu analysieren. Es ist besonders nützlich für die Einschätzung der Molekülmasse von Proteinen und zur Kontrolle der Reinheit von Proteinproben.
• Sie ermöglicht es, die Homogenität einer Proteinprobe zu überprüfen und gegebenenfalls Kontaminanten zu identifizieren.
• Ergebnisse und Informationen:
• Durch SDS-PAGE kannst Du das ungefähre Molekulargewicht der Proteine in deiner Probe bestimmen, indem Du die migrierten Proteine mit einer Proteinmolekulargewichtsleitern vergleichst.
• Du kannst herausfinden, ob Deine Probe ein einzelnes Protein oder eine Mischung mehrerer Proteine enthält. Eine saubere Bande im Gel deutet auf ein reines Protein hin, während mehrere Banden auf eine Kontamination oder mehrere Proteine hindeuten.
• Western Blot: Nachweis nach SDS-PAGE
• Nachdem die Proteine durch SDS-PAGE getrennt wurden, können sie mittels Western Blot nachgewiesen werden:
  • Transfer: Die Proteine im Gel werden auf eine Membran (Nitrocellulose oder PVDF) übertragen. Dies geschieht durch Anlegen eines elektrischen Feldes, das die Proteine aus dem Gel auf die Membran zieht.
  • Blockieren: Die Membran wird mit einer blockierenden Lösung (z.B. 5% Milch in TBS-T) inkubiert, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren und Hintergrundrauschen zu minimieren.
  • Primärantikörper: Die Membran wird dann mit einem primären Antikörper inkubiert, der spezifisch an das Zielprotein bindet.
  • Sekundärantikörper: Ein sekundärer Antikörper, der an den primären Antikörper bindet und an ein Enzym oder ein fluoreszierendes Molekül gekoppelt ist, wird hinzugefügt.
  • Detektion: Schließlich wird das gebundene Enzym/Substratpaar entwickelt, um das spezifische Protein auf der Membran sichtbar zu machen. Dies kann mittels Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder Farbstoffreaktionen erfolgen.
  • Analysieren: Das Ergebnis wird durch ein Bildgebungsgerät erfasst, das es ermöglicht, die spezifische Bande des Zielproteins zu identifizieren und dessen Menge zu quantifizieren.

d)

Zum Abschluss der Analyse verwendest Du eine Massenspektrometrie-Methode, um die Masse des unbekannten Proteins zu bestimmen. Vergleiche die Techniken MALDI-TOF und ESI-MS in Bezug auf ihre spezifischen Anwendungen und die Art der Daten, die sie liefern. Welche Methode würdest Du in diesem Fall bevorzugen und warum?

Lösung:

• Vergleich der Massenspektrometrie-Methoden: MALDI-TOF vs. ESI-MS
• MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight)
• Funktionsweise: Bei der MALDI-TOF-MS wird das Protein in eine elutriermittierende Matrix eingebettet. Ein Laserstrahl ionisiert die Moleküle und sie werden in die Gasphase überführt. Die ionisierten Moleküle werden in einem Flugrohr (Time of Flight) beschleunigt, und ihre Flugzeit bis zum Detektor wird gemessen. Die Flugzeit ist proportional zur Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) der Moleküle.
• Anwendungsbereich: MALDI-TOF wird hauptsächlich für die Analyse größerer Biomoleküle wie Proteine, Peptide, Polysaccharide und synthetische Polymere verwendet.
• Art der Daten: MALDI-TOF liefert im Allgemeinen genaue Molekularmasse von intakten Proteinen. Die Spektren enthalten häufig nur ein Hauptpeak pro Protein, was die Interpretation erleichtert.
• Vorteile: MALDI-TOF ist sehr empfindlich, kann große Moleküle analysieren und bietet eine schnelle Analysezeit.
• Nachteile: MALDI-TOF kann Schwierigkeiten haben, sehr kleine Moleküle oder komplexe Mischungen zu analysieren, und es kann zu Matrixeffekten kommen, die das Signal beeinflussen können.
• ESI-MS (Electrospray Ionization - Mass Spectrometry)
• Funktionsweise: Bei der ESI-MS wird die Proteinprobe in Lösung vernebelt, wobei ein elektrisches Feld die Lösung in feine Tröpfchen aufbricht. Diese Tröpfchen verdampfen, was zur Freisetzung und Ionisierung der Moleküle führt. Die ionisierten Moleküle werden dann in das Massenspektrometer eingeführt und nach ihrem m/z-Verhältnis getrennt.
• Anwendungsbereich: ESI-MS ist vielseitiger und wird für die Analyse von kleinen bis mittleren Molekülen verwendet, einschließlich Proteine, Peptide, Nukleotide, Lipide und kleine Moleküle.
• Art der Daten: ESI-MS erzeugt oft Spektren mit mehreren Ladungszuständen desselben Moleküls, was eine genaue Massenbestimmung und die Analyse von Proteingemischen ermöglicht.
• Vorteile: ESI-MS kann Proben in flüssiger Phase analysieren, ist gut für quantitative Analysen und bietet eine hohe Empfindlichkeit für kleine Moleküle und Komplexe.
• Nachteile: Die Spektren können komplexer sein und die Interpretation erfordert Erfahrung, insbesondere bei Gemischen mit vielen Komponenten.
• Empfehlung und Begründung:
• Bevorzugte Methode: In diesem speziellen Fall würde ich die MALDI-TOF-MS-Methode zur Bestimmung der Masse des unbekannten Proteins bevorzugen.
• Begründung:
  • MALDI-TOF-MS eignet sich hervorragend für die Analyse großer Biomoleküle wie Proteine und kann die Molekularmasse schnell und präzise ohne extensive Probenvorbereitung liefern.
  • Da das unbekannte Protein wahrscheinlich aus einer einzelnen Quelle (Herzzellenmäusen) stammt und möglicherweise nur aus wenigen verschiedenen Proteinen besteht, erlaubt MALDI-TOF eine einfache und klare Identifikation ohne die komplexe Deutung mehrerer Ladungszustände, was bei ESI-MS der Fall wäre.
  • Falls weitere Detektion oder Charakterisierung erforderlich ist, kann ESI-MS später verwendet werden, um detailliertere Informationen zu erhalten, wie z.B. über posttranslationale Modifikationen oder Protein-Protein-Interaktionen.